基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接研究參芪扶正注射液抗非小細(xì)胞性肺癌的作用機(jī)制

楊罡 趙峻 鄧崢 袁兵 張?jiān)戚x

摘要 目的：運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)研究參芪扶正注射液抗非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的活性成分及作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法：應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（ TCMSP）獲取參芪扶正注射液的活性成分及靶點(diǎn)，通過美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫獲取NSCLC與正常肺組織的差異基因，并采用STRING數(shù)據(jù)庫及Cytoscape構(gòu)建共同靶點(diǎn)可視化網(wǎng)絡(luò)圖。借助DAVID數(shù)據(jù)庫實(shí)現(xiàn)基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG） 富集分析，利用AutoDock Vina和PyMoL進(jìn)行分子對(duì)接以驗(yàn)證。結(jié)果：獲取參芪扶正注射液活性成分41個(gè)，NSCLC差異基因2 861個(gè)，共同靶點(diǎn)58個(gè)。GO分析顯示生物學(xué)過程主要涉及對(duì)類固醇激素、氧化應(yīng)激、多種化學(xué)物理因素刺激等反應(yīng)的調(diào)節(jié);KEGG富集顯示主要通過TNF、Relaxin、IL-17、P13K/AKT、Estrogen等通路發(fā)揮抗癌作用。分子對(duì)接表明藥物主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合性較好，從分子層面對(duì)參芪扶正注射液的有效性進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)論：運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接的方法證明參芪扶正注射液通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮對(duì)NSCLC的治療作用，并為臨床應(yīng)用提供了理論支持。

關(guān)鍵詞 參芪扶正注射液;非小細(xì)胞肺癌;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對(duì)接

Abstract Objective：To explore the active components and mechanism of Shenqi Fuzheng Injection for the treatment of non-small cell lung cancer（NSCLC） by network pharmacology and molecular docking technology，and to provide theoretical basis for clinical application.Methods：TCMSP database was used to obtain the active components and targets of Shenqi Fuzheng Injection.The differential genes between NSCLC and normal lung tissue were obtained by NCBI database.And the visual network of common targets was drawed by STRING database and Cytoscape.The DAVID database was used to perform GO analysis and KEGG pathway analysis.The molecular docking technology was carried out by using AutoDock Vina and PyMOL for further verification.Results：A total of 41 active components of Shenqi Fuzheng Injection，2 861 differential genes of NSCLC and 58 common targets were obtained.GO enrichment analysis showed that the biological process mainly involved in the regulation of steroid hormone，oxidative stress response，and multiple chemical and physical responses; KEGG enrichment showed that anti-cancer effect was mainly through TNF pathway，Relaxin pathway，IL-17 pathway，P13K/AKT pathway and Estrogen pathway.The results of molecular docking showed that the main active components had good binding with key targets，and the effectiveness of Shenqi Fuzheng Injection was verified from the molecular level.Conclusion：The therapeutic effect of Shenqi Fuzheng Injection on NSCLC through multi-components，multi-targets and multi-pathways can be proved by network pharmacology and molecular docking，which provides theoretical support for clinical application.

Keywords Shenqi Fuzheng Injection; Non-small cell lung cancer; Network pharmacology; Molecular docking

中圖分類號(hào)：R285文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.20.001

原發(fā)性支氣管肺癌簡(jiǎn)稱肺癌，是我國及全球范圍內(nèi)最常見的嚴(yán)重威脅人群生命和健康的惡性腫瘤。2018年全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，肺癌以11.6%的發(fā)病率及18.4%的病死率高居所有類型癌癥榜首[1]。同時(shí)，根據(jù)癌癥中心提供的數(shù)據(jù)，我國肺癌患者人數(shù)約為78.1萬且以2%～3%的增長(zhǎng)率逐年增多[2]。其中，非小細(xì)胞肺癌（Non-small Cell Lung Cancer，NSCLC）占肺癌患者總數(shù)的絕大部分，且由于其癌細(xì)胞生長(zhǎng)分裂速度慢，擴(kuò)散轉(zhuǎn)移相對(duì)較晚，2/3的患者確診時(shí)已為晚期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移從而喪失手術(shù)機(jī)會(huì)[3]?；熓沁@部分患者的標(biāo)準(zhǔn)治療措施，但由于不良反應(yīng)大，且嚴(yán)重影響患者生命質(zhì)量。故尋求不良反應(yīng)小且有療效的NSCLC替代或輔助支持療法具有重大的臨床意義。

參芪扶正注射液（Shenqi Fuzheng Injection，SFI）是以黨參和黃芪為主要成分的中藥制劑。中醫(yī)認(rèn)為黨參益氣養(yǎng)精、健脾益肺;而黃芪具有補(bǔ)氣固表的功效[4]?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)參芪扶正注射液能夠抑制炎癥介質(zhì)產(chǎn)生抗炎作用，通過調(diào)控細(xì)胞周期促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡從而產(chǎn)生抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種藥理作用[5-6]。該中藥制劑臨床應(yīng)用多年，常用于肺癌、胃癌等多種癌癥的輔助治療。同時(shí)臨床研究表明，參芪扶正注射液在改善中晚期肺癌患者生命質(zhì)量，減輕放化療不良反應(yīng)并提高其療效等方面具有良好的臨床療效[7-8]。但其具體的作用機(jī)制和有效活性成分有待進(jìn)一步研究，以便更好地指導(dǎo)臨床用藥。

由于中醫(yī)藥治療疾病具有多種成分、多個(gè)靶點(diǎn)、多條通路共同發(fā)揮作用的特點(diǎn)，對(duì)復(fù)方中藥治療疾病的生物學(xué)機(jī)制研究需兼顧整體性和系統(tǒng)性。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種研究中藥活性化合物、作用靶標(biāo)和疾病之間相互作用的新方法，本質(zhì)上是基于大數(shù)據(jù)信息挖掘的系統(tǒng)生物學(xué)。該方法對(duì)于藥物功效的評(píng)價(jià)、作用機(jī)制的研究具有科學(xué)性和可視化的特點(diǎn)[9]。分子對(duì)接技術(shù)將藥物小分子作為配體與受體蛋白進(jìn)行3D結(jié)構(gòu)間的對(duì)接，來預(yù)測(cè)蛋白和藥物分子的親和力及結(jié)合模式從而達(dá)到藥物設(shè)計(jì)及驗(yàn)證的目的?；诖耍狙芯窟\(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索參芪扶正注射液核心活性成分和靶點(diǎn)，并結(jié)合生物學(xué)、通路分析和分子對(duì)接技術(shù)，預(yù)測(cè)其干預(yù)NSCLC的作用機(jī)制，從而為參芪扶正注射液臨床運(yùn)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 參芪扶正注射液中化合物收集

將參芪扶正注射液主要成分“黨參”“黃芪”作為關(guān)鍵詞，輸入至中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），檢索出成分對(duì)應(yīng)的化合物。

1.2 藥物的活性成分和靶蛋白篩選

藥物口服生物利用度（OB）是藥動(dòng)學(xué)ADME參數(shù)中的重要指標(biāo)之一，指藥物中有效活性成分經(jīng)吸收進(jìn)入人體血液循環(huán)的速度與程度。OB值越低提示藥物的治療效果可能越差。類藥性（DL）是指某化合物與已知藥物的相似程度，通常DL值越低，該化合物作為藥物活性成分的可能性越低[10]。因此，以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步篩選出具有較高生物學(xué)活性的成分。將成分在TCMSP中進(jìn)行藥物靶標(biāo)的匹配，并將獲取的靶標(biāo)經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）校正為標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.3 NSCLC差異基因獲取

通過NCBI平臺(tái)（National Center for Biotechnology Information，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的GEO數(shù)據(jù)庫，將物種選擇為智人且樣本量以>20為選擇標(biāo)準(zhǔn)，下載非小細(xì)胞肺癌及癌旁正常肺組織DNA測(cè)序數(shù)據(jù)。利用R語言edgR軟件包對(duì)肺癌差異表達(dá)基因做進(jìn)一步分析，設(shè)置logFCfilter≥1，顯著性P-value>0.05，并使用R語言gplots軟件包繪制差異基因火山圖及熱圖。

1.4 藥物和疾病共同靶點(diǎn)獲取

利用VENNY 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny），對(duì)非小細(xì)胞肺癌差異基因和參芪扶正注射液主要化合物的靶點(diǎn)進(jìn)行比較，篩選出共同作用靶點(diǎn)，并繪制Venny圖。

1.5 構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)

利用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)可視化分析和編輯軟件Cytoscape（Version3.7.2）構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。在網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)（Node）代表黨參和黃芪、藥物活性成分、關(guān)鍵靶基因以及非小細(xì)胞肺癌。邊（Edge）代表黨參、黃芪與對(duì)應(yīng)活性成分、活性成分與靶基因、疾病與靶基因相互作用關(guān)系。

1.6 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（ PPI）網(wǎng)絡(luò)

利用STRING平臺(tái)（https：//string-db.org/）構(gòu)建交集靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并利用R語言繪制相互作用關(guān)系最高的前20個(gè)靶點(diǎn)蛋白柱狀圖。以明確參芪扶正注射液中的主要有效成分“黨參”“黃芪”對(duì)非小細(xì)胞肺癌的作用關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.7 通路富集分析

將獲取到的交集基因?qū)胫罝AVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov）進(jìn)行基因本體（GO）生物學(xué)功能富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號(hào)通路富集分析。并借助Omicshare平臺(tái)（https：//www.omicshare.com/tools/）及R語言中g(shù)gplot2包將富集得到的結(jié)果繪制成氣泡圖和柱狀圖。最后應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建參芪扶正注射液主要藥物成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖。

1.8 分子對(duì)接

從PDB數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）下載PPI網(wǎng)絡(luò)中相互作用Degree值前4位核心蛋白的3D結(jié)構(gòu)，并從PubChem數(shù)據(jù)庫（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）及ZINC數(shù)據(jù)庫（http：//zinc.docking.org）下載網(wǎng)絡(luò)圖中Degree值最高的前4位活性小分子的3D結(jié)構(gòu)。應(yīng)用AutoDock Tools 1.5.6對(duì)獲取的小分子及蛋白3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行去水、加氫、計(jì)算電荷等處理后，導(dǎo)入到AutoDock Vina進(jìn)行對(duì)接，計(jì)算出藥物活性成分與靶蛋白相結(jié)合所需的最低結(jié)合效能。再利用Pymol2.1.1將對(duì)接所獲得的相互作用結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分獲取

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中以黨參、黃芪進(jìn)行檢索，共計(jì)獲得221個(gè)化合物（黨參134個(gè)、黃芪87個(gè)），并根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18篩選后共獲得活性成分41個(gè)，其中黨參21個(gè)、黃芪20個(gè)，二者無重疊成分。見表1。

2.2 藥物靶點(diǎn)的獲取

借助TCMSP對(duì)41個(gè)活性化合物進(jìn)行靶點(diǎn)篩選，共獲得210個(gè)靶點(diǎn)，其中黃芪101個(gè)，黨參189個(gè)，80個(gè)為共有的重疊靶點(diǎn)。

2.3 非小細(xì)胞肺癌的差異基因獲取

通過NCBI平臺(tái)以“NSCLC Normal”為關(guān)鍵詞在GEO數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，以樣本量>20、人類非小細(xì)胞肺癌組織與正常肺組織為標(biāo)本進(jìn)行篩選，下載目標(biāo)表達(dá)譜（GSE21933）的平臺(tái)文件及樣本文件。獲取非小細(xì)胞肺癌差異基因2 861個(gè)，并借助R語言繪制出差異基因的熱圖。見圖1?；鹕綀D見圖2。

2.4 共同靶點(diǎn)的獲取

為了進(jìn)一步明確參芪扶正注射液和NSCLC的共同靶點(diǎn)，經(jīng)過對(duì)獲得的非小細(xì)胞肺癌相關(guān)差異基因2 861個(gè)及藥物的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)210個(gè)進(jìn)行比較篩選后，篩選出二者共同作用靶點(diǎn)58個(gè)。見圖3。具體基因名及entrez ID見表2。

2.5 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)

將獲取到的58個(gè)交集靶點(diǎn)蛋白輸入String平臺(tái)，設(shè)置置信度為Highest≥0.9，并剔除獨(dú)立于網(wǎng)絡(luò)以外的靶點(diǎn)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。見圖4。根據(jù)相互作用關(guān)系性高低，利用R語言繪制最高的前20項(xiàng)基因的柱狀圖，獲取核心蛋白。見圖5。

2.6 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

制作黨參、黃芪與對(duì)應(yīng)藥物活性成分、活性成分與關(guān)鍵靶基因、關(guān)鍵靶基因與非小細(xì)胞肺癌相互作用關(guān)系以及節(jié)點(diǎn)屬性文件，并導(dǎo)入到Cytoscape構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。見圖6。使用CentiScape計(jì)算藥物活性成分Degree值，該值越大說明對(duì)應(yīng)的節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要。其中，根據(jù)與非小細(xì)胞肺癌的關(guān)系度值由高至低排名前5的藥物成分：槲皮素（Quercetin）為44、木犀草素（Luteolin）為20、刺芒柄花素（Formononetin）為12、山柰酚（Kaempferol）為12、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇（7-O-methylisomucronulatol）為10。見表3。

2.7 GO富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子功能、細(xì)胞組分和生物過程3個(gè)方面的GO分析，綜合校正后的P值及富集在該功能區(qū)基因數(shù)目。見圖7。分別選擇排名靠前的條目借助Omicshare平臺(tái)作條形圖呈現(xiàn)。見圖8。分析結(jié)果顯示，上述蛋白在生物過程方面主要涉及對(duì)類固醇激素、氧化應(yīng)激反應(yīng)、多種化學(xué)物理因素對(duì)細(xì)胞的刺激反應(yīng)等過程的調(diào)節(jié);細(xì)胞組分方面主要是影響細(xì)胞膜的小凹、微區(qū)、膜筏以及細(xì)胞核染色質(zhì)體等;在分子功能方面主要是調(diào)控類固醇激素及結(jié)合、DNA轉(zhuǎn)錄激活、多種肽酶活性功能。推測(cè)參芪扶正注射液可能通過以上功能過程在NSCLC的治療中發(fā)揮其扶正益氣、養(yǎng)精補(bǔ)血的功效。

2.8 KEGG通路富集分析

對(duì)58個(gè)抗癌關(guān)鍵基因進(jìn)行KEGG分析。見圖9。共富集64條通路，根據(jù)校正后P值進(jìn)行排序，選擇前20項(xiàng)通路繪制氣泡圖展示，主要涉及腫瘤轉(zhuǎn)錄失控（Transcriptional Misregulation in Cancer）、癌癥中的MicroRNAs（MicroRNAs in Cancer）、多種病毒感染、細(xì)胞衰老和細(xì)胞周期（Cellular Senescence，Cell cycle）、前列腺癌（Prostate Cancer）、非小細(xì)胞肺癌（Non-small Cell Lung Cancer）等信號(hào)通路。排除廣泛通路后，前15條信號(hào)通路見表4，其中腫瘤壞死因子（TNF）通路涉及PTGS2、MMP9、JUN、IL6、ICAM1、SELE等基因;松弛素（Relaxin）信號(hào)通路涉及EGFR、VEGFA、MMP9、JUN、MMP1、MMP13等基因;白細(xì)胞介素-17（IL-17）通路涉及PTGS2、MMP9、JUN、IL6、MMP1、MMP13等基因;磷脂酰肌醇3-羥激酶-蘇氨酸激酶（PI3K-AKT）信號(hào)通路涉及EGFR、VEGFA、CDKN1A、IL6、IL2、NOS3等基因;雌激素（Estrogen）信號(hào)通路涉及ESR1、EGFR、MMP9、JUN、FOS、NOS3、CTSD基因。

2.9 藥物成分-靶基因-信號(hào)通路共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用Cytoscape繪制參芪扶正注射液核心成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-主要信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖。見圖10。可見藥物活性成分分別作用于單個(gè)或多個(gè)靶點(diǎn)基因，并通過對(duì)應(yīng)的信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)控作用，證明了參芪扶正注射液治療NSCLC具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的機(jī)制。

2.10 分子對(duì)接

對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖中Degree值前4的藥物有效成分與PPI網(wǎng)絡(luò)中相互作用度值最高的前4位核心蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，Autodock軟件對(duì)接結(jié)果見表5。配體與蛋白相結(jié)合時(shí)所需結(jié)合效能<0則說明二者可以自發(fā)結(jié)合，且二者親和力越強(qiáng)，所需的結(jié)合效能越低。對(duì)接結(jié)果顯示，前4位藥物有效成分與所選取的核心蛋白之間的結(jié)合能均低于-5 kJ/mol，表明具有較好的結(jié)合活性，證明參芪扶正注射液主要通過上述活性成分作用于對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵蛋白發(fā)揮抗NSCLC的治療作用。最后利用Pymol軟件對(duì)其進(jìn)行可視化分析處理，從而進(jìn)一步研究這些小分子成分與蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系。見圖11。

3 討論

非小細(xì)胞肺癌是肺癌分型中占比最大、預(yù)后最差的一種類型。中醫(yī)學(xué)將其歸于“肺積”“息賁”等范疇，并認(rèn)為它的發(fā)生是由于內(nèi)因（正氣虛損）、外因（癌毒侵襲）等多種因素共同作用的結(jié)果[11]。因此，扶正固本，活血化瘀祛痰為NSCLC的重要治療原則。參芪扶正注射液是以黨參、黃芪為組成成分的中藥制劑，其中黃芪為君藥補(bǔ)中益氣、健脾益肺;黨參為臣藥補(bǔ)氣固表、活血化瘀。二者合用使扶正固本、益氣健脾肺的功效得到增強(qiáng)，從而與非小細(xì)胞肺癌的病機(jī)相契合[8]。但為了更全面地研究參芪扶正注射液對(duì)NSCLC的治療作用，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合分子對(duì)接技術(shù)對(duì)其有效成分、潛在靶點(diǎn)和具體作用機(jī)制進(jìn)行研究。

3.1 藥物核心有效成分

通過獲取參芪扶正注射液活性成分并根據(jù)“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖所顯示：黃芪、黨參主要活性成分中槲皮素（Quercetin）、木犀草素（Luteolin）、刺芒柄花素（Formononetin）、山柰酚（Kaempferol）為拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)中與抗NSCLC靶點(diǎn)度值最高的化合物，即最核心的節(jié)點(diǎn)，提示這幾種活性成分在治療NSCLC中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。1）槲皮素是一種生物類黃酮，對(duì)NSCLC具有抗增殖和抗侵襲活性。研究證明槲皮素通過抑制熱休克蛋白70的表達(dá)，從而抑制A549肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。并且槲皮素及其代謝產(chǎn)物能通過抑制Src/Fn14/NF-kB信號(hào)通路，上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR-γ）的表達(dá)，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）的活性和表達(dá)，從而顯著抑制非小細(xì)胞肺癌的侵襲和遷移[12-13]。另有研究表明槲皮素能提高肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物吉西他濱的敏感性。因此，槲皮素在NSCLC治療中可能作為一種抗增殖和化療藥物增敏劑[14]。2）木犀草素是一種天然類黃酮，其抗腫瘤作用與多條信號(hào)通路及下游因子密切相關(guān)。研究表明，木犀草素可通過激活JNK信號(hào)通路、增強(qiáng)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）從而誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞周期G2期停滯及細(xì)胞凋亡[15-16]。另有研究證明，木犀草素能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的E-鈣黏蛋白（Cadherin）下降，從而抑制肺癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[17]。3）刺芒柄花素是一種具有抗腫瘤作用的植物異黃酮，可降低多種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)抑癌基因P53及凋亡蛋白bax的表達(dá)，誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞周期G1期停滯，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[18]。此外，刺芒柄花素被證明為一種EGFR抑制劑，在非小細(xì)胞肺癌中通過抑制EGFR-AKT-Mcl-1信號(hào)通路，抑制腫瘤生長(zhǎng)[19]。4）山柰酚是一種天然的膳食類黃酮，能提高放療對(duì)NSCLC癌細(xì)胞的殺傷作用，并通過上調(diào)MMP-2及E-cadherin從而發(fā)揮抑制肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要作用[20-21]。

3.2 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因

對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)IL-6、JUN、CCNA2、CCNB1、EGFR基因相互作用關(guān)系最緊密，處于網(wǎng)絡(luò)的核心地位，可視為治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。1）IL-6是一種多效性細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)和腫瘤免疫方面發(fā)揮重要作用。JAK和STAT3是其調(diào)控的重要下游基因，研究表明IL-6通過激活JAK2/STAT3信號(hào)途徑促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和肺癌干細(xì)胞樣特性的形成[22]。此外，IL-6受體拮抗蛋白或司妥昔單抗都能阻斷IL-6/JAK/STAT3信號(hào)通路有效抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[23-24]。血清高水平的IL-6與NSCLC患者較差的生存率明顯相關(guān)[25]。故抗IL-6治療在NSCLC綜合治療中意義重大。2）c-Jun是一種重要的致癌基因，常與c-Fos組成二聚體復(fù)合物活化蛋白-1（AP-1），是促進(jìn)多種腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)，c-Jun基因（-1 318T>G和2 673T>C）多態(tài)性，通過與環(huán)境因素（吸煙或飲酒）的相互影響，增加了中國地區(qū)該基因型攜帶者對(duì)肺癌的易感性[26]。3）CCNB1及CCNA2屬于細(xì)胞周期蛋白家族，是參與肺癌細(xì)胞周期調(diào)控、影響癌細(xì)胞增殖的重要因子。研究發(fā)現(xiàn)，CCNB1可以預(yù)測(cè)NSCLC患者的預(yù)后，CCNB1水平越高，生存期越短且預(yù)后越差[27]。并且抑制CCNB1表達(dá)后，癌細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，克隆性增殖減少，腫瘤體積縮小[28]。另外，CCNA2的過表達(dá)與早期NSCLC患者較差的無復(fù)發(fā)生存率明顯相關(guān)[29]。4）EGFR通過多條下游信號(hào)途徑影響肺癌細(xì)胞周期誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，并促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。同時(shí)，EGFR作為肺癌治療的重要靶點(diǎn)，針對(duì)其研發(fā)的EGFR-酪氨酸激酶抑制劑作為EGFR突變型非小細(xì)胞肺癌患者的治療具有高度的敏感性和顯著的療效[30]。

3.3 GO及KEGG富集分析

GO富集分析表明參芪扶正注射液主要是通過對(duì)類固醇激素及與受體結(jié)合、DNA轉(zhuǎn)錄的激活、多種肽酶活性、氧化應(yīng)激反應(yīng)等功能過程的調(diào)節(jié)來發(fā)揮抗NSCLC作用。

KEGG通路結(jié)果顯示參芪扶正注射液的治療過程涉及多條與腫瘤炎癥反應(yīng)、血管生成、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號(hào)通路。1）TNF信號(hào)通路：腫瘤壞死因子α（TNF-α）是迄今為止發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤作用最強(qiáng)大的細(xì)胞因子。TNF-α通過激活SAKP/JNK信號(hào)通路增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性并抑制了肺癌轉(zhuǎn)移[31]。研究發(fā)現(xiàn)，TNF作為抗血管生成藥物，其減毒增效突變體聯(lián)合化療藥物在晚期NSCLC患者的治療中具有顯著療效[32]。2）Relaxin信號(hào)通路：松弛素（Relaxin，RLN）是一種結(jié)構(gòu)類似于胰島素的多肽類激素，近年來研究發(fā)現(xiàn)松弛素對(duì)多種癌癥的增殖和侵襲具有促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn)通過RLN2/RXFP1（松弛素受體1）信號(hào)通路誘導(dǎo)鈣黏蛋白表達(dá)降低和β-連環(huán)蛋白（β-catenin）磷酸化增加，從而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲性增加[33]。此外，對(duì)于前列腺癌，RLN能促血管生成，并產(chǎn)生NO擴(kuò)張血管從而增加腫瘤血流量，促進(jìn)腫瘤發(fā)展[34]。目前關(guān)于松弛素與NSCLC的研究較少，可能有望成為治療的新方向。3）IL-17信號(hào)通路：該通路的激活導(dǎo)致外周血IL-17水平升高并與NSCLC分期相關(guān)。NSCLC組織中IL-17及IL-17R表達(dá)升高能增強(qiáng)癌細(xì)胞侵襲潛能，IL-17基因敲除小鼠的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移性明顯下降[35]。4）P13K/AKT信號(hào)通路：P13K/AKT信號(hào)通路是非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展過程中最重要的途徑之一，其通過參與或激活多條相關(guān)信號(hào)通路如PI3K/AKT/mTOR，IGF-1/PI3K/AKT及PI3K/AKT/NF-κB等，促進(jìn)NSCLC的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，抑制P13K/AKT通路在NSCLC的綜合治療中有著至關(guān)重要的意義。5）Estrogen信號(hào)通路：雌激素主要通過雌激素受體α和β的表達(dá)在NSCLC的增殖和轉(zhuǎn)移中起著重要作用，但通過不同受體發(fā)揮作用的機(jī)制和通路不同，ERα可以激活CCL2/CCR2/MMP9信號(hào)通路，促進(jìn)癌組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，從而增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞的侵襲性，并與較差的生存率相關(guān)[36]。ERβ介導(dǎo)肺癌組織中IGF-1R表達(dá)上調(diào)并與之協(xié)同作用促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖[37]。因此，抗雌激素及其受體治療可能為NSCLC綜合治療的重要組成部分。

4 結(jié)語

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合分子對(duì)接的方法，對(duì)參芪扶正注射液治療NSCLC的核心有效成分、關(guān)鍵作用靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行獲取，并對(duì)交集靶標(biāo)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，闡明了參芪扶正注射液通過多化合物、多靶點(diǎn)、多通路作用于NSCLC，為臨床應(yīng)用提供了科學(xué)理論。但由于本研究基于大數(shù)據(jù)挖掘，具有一定的局限性，故仍需要臨床研究及體內(nèi)外研究以驗(yàn)證我們的發(fā)現(xiàn)。

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（2020-12-03收稿 責(zé)任編輯：馬雪玲，徐穎）