王猛 劉剛 路聊東 王東偉

摘要 目的：運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法探討“杜仲-牛膝”藥對(duì)治療骨質(zhì)疏松的分子機(jī)制。方法：通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）篩選杜仲、牛膝含有的活性成分及作用靶點(diǎn);利用GeneCards、DisGeNET和CTD數(shù)據(jù)庫(kù)收集骨質(zhì)疏松（OP）相關(guān)靶點(diǎn)基因;采用Cytoscape 3.8.0軟件和STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析;FunRich3.1.3軟件DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG） 富集分析（P<0.05）;運(yùn)用Maestro version 11.5對(duì)主要活性成分及靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果：獲得“杜仲-牛膝”藥對(duì)治療OP的活性成分共42個(gè)和133個(gè)有效靶點(diǎn);獲得251條GO生物過(guò)程和90條相關(guān)信號(hào)通路，涉及PI3K-AKT、TNF、Wnt、HIF-1、MAPK信號(hào)通路等。結(jié)論：“杜仲-牛膝”藥對(duì)可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、分化與凋亡、骨代謝來(lái)治療OP，具有多成分、多靶點(diǎn)、多系統(tǒng)的特點(diǎn)，為系統(tǒng)闡明“杜仲-牛膝”藥對(duì)主要成分治療OP的分子機(jī)制提供了參考。

關(guān)鍵詞 杜仲;牛膝;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對(duì)接;骨質(zhì)疏松;分子機(jī)制

Abstract Objective：To explore the molecular mechanism of Cortex Eucommiae-Achyranthes bidentata in the treatment of osteoporosis by network pharmacology and molecular docking.Methods：TCMSP database was used to screen the active components and action targets of Cortex Eucommiae-Achyranthes bidentata.We used GeneCards，DisGeNET and CTD database to collect osteoporosis（Osteoporosis，OP） related target genes; used Cytoscape 3.8.0 software and STRING database to construct and analyze the “drug-active ingredient-target” network and PPI network; FunRich3.1.3 Software DAVID database were used forGO analysis and KEGG enrichment analysis（P<0.05）; we used Maestro version 11.5 to perform molecular docking of the main active ingredients and target proteins.Results：We obtained a total of 42 active ingredients and 133 effective targets of “Cortex Eucommiae-Achyranthes bidentata” drug for the treatment of OP; and obtained 251 GO biological processes and 90 related signal pathways，involving PI3K-AKT，TNF，Wnt，HIF-1，MAPK signal pathway etc.Conclusion：Cortex Eucommiae-Achyranthes bidentata drug pair may treat OP by regulating cell proliferation，differentiation and apoptosis，and bone metabolism.It has the characteristics of multi-component，multi-target and multi-system，which provides a reference for systematically elucidating the molecular mechanism of Cortex Eucommiae-Achyranthes bidentata drug pair in treating OP.

Keywords Cortex Eucommiae; Achyranthes bidentata; Network pharmacology; Molecular docking; Osteoporosis; Molecular mechanism

中圖分類號(hào)：R285.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.20.002

骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis，OP）是最常見(jiàn)的骨骼疾病，是以全身性骨量減少，骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，表現(xiàn)為單位體積的骨量降低，礦鹽和骨基質(zhì)比例減少，生物脆性上升，導(dǎo)致骨的力學(xué)強(qiáng)度衰減，骨折風(fēng)險(xiǎn)上升的一種全身性骨代謝疾病[1]。2001年美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（USA National Institutes of Health，NIH）將其定義為以骨折風(fēng)險(xiǎn)概率增加和骨的生物力學(xué)強(qiáng)度下降為特征的骨骼疾病，并提示骨量降低是骨質(zhì)疏松性骨折的主要危險(xiǎn)因素，但還存在其他危險(xiǎn)因素。我國(guó)OP的總患病率為6.6%～19.3%，平均為13%，其中約20%的患者會(huì)發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折[2]。許多臨床研究結(jié)果表明，臨床上常用的抗OP的西藥均具有一定的不良反應(yīng)，如長(zhǎng)期使用激素治療的患者，其患骨壞死、冠心病、乳腺癌等疾病的概率將有不同程度的升高[3]。骨質(zhì)疏松的臨床癥狀與中醫(yī)疾病“骨痿”中的“不通則痛”“腰脊不舉”“兩足軟弱”“不任其身”等表現(xiàn)相符。中醫(yī)以“骨痿”論治骨質(zhì)疏松，重溫補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋壯骨，兼以通經(jīng)活絡(luò)、祛風(fēng)除濕、補(bǔ)氣養(yǎng)血[4]。

杜仲味辛、平，性甘、溫，無(wú)毒，具有補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，安胎等功效，《本草會(huì)言》曰：“腰膝之痛，非杜仲不除……補(bǔ)肝益腎，誠(chéng)為要藥?！迸Ｏノ犊唷⑺?，性甘平，主逐瘀通經(jīng)，補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，《醫(yī)學(xué)衷參西錄》認(rèn)為：“牛膝為補(bǔ)益之品而善引氣血下注，故善治腎虛腰痛，或腿痿不能任地?！監(jiān)P的主要病機(jī)在“腎虛”，腎為先天之本，人體的生長(zhǎng)壯老皆由腎氣的盛衰所主導(dǎo)[5]。而杜仲、牛膝補(bǔ)益肝腎、壯腰膝、強(qiáng)筋骨的功效顯著，其藥性溫和、不易產(chǎn)生不良反應(yīng)，是治療OP的優(yōu)選中藥[6]。此兩藥最早配伍使用可追溯到《壽親養(yǎng)老新書(shū)》中“不老丸”一方?！岸胖?牛膝”藥對(duì)是治療OP的常用組方藥對(duì)，但兩藥配對(duì)應(yīng)用后其多靶點(diǎn)作用機(jī)制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是生物信息領(lǐng)域高速發(fā)展的一門新興學(xué)科，它集成了虛擬計(jì)算，高通量的基因組分析和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋等方法，其基于系統(tǒng)生物學(xué)和藥物多靶標(biāo)多通路理論構(gòu)建“藥材-成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)，分析通路機(jī)制，為藥物新方向預(yù)測(cè)和疾病的多向治療提供了導(dǎo)向[7]。分子對(duì)接是經(jīng)由受體的特性以及受體和藥物小分子之間的互相效用形式來(lái)施行藥物設(shè)計(jì)的門徑。主要探討分子間（如配體和受體）的相互作用，并預(yù)測(cè)其連接式樣和親和力的一種理論仿效方法[8]。本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)，探討“杜仲-牛膝”藥對(duì)中有效成分與靶標(biāo)蛋白之間的互作關(guān)系，研究其藥對(duì)配伍后治療OP的可能作用機(jī)制，為后續(xù)的研究驗(yàn)證提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 藥材中所含活性成分的篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）以“杜仲”“牛膝”為關(guān)鍵詞，搜索杜仲、牛膝中含有的已知化學(xué)成分[9]。以藥物動(dòng)力學(xué)原理為基礎(chǔ)，口服生物利用度（OB）是經(jīng)口服用的藥物中所含有的有效成分或活性物質(zhì)被人體吸收到達(dá)體循環(huán)的速度與程度，類藥性（DL）則是用以評(píng)價(jià)藥物分子成藥性高低的指標(biāo)[10]。結(jié)合文獻(xiàn)研究，將OB≥30%，DL≥0.18作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出杜仲、牛膝中的活性成分[11]。

1.2 藥物靶點(diǎn)的篩選及“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將1.1項(xiàng)下篩選出的活性成分導(dǎo)入TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，查找出藥物靶標(biāo)蛋白，通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/）進(jìn)行靶標(biāo)蛋白以及基因信息的校正。將藥物活性成分、靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行顯著性分析，篩選出關(guān)鍵活性成分。

1.3 “杜仲-牛膝”治療OP的潛在作用靶點(diǎn)獲取 ? 在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、DisGeNET（http：//www.disgenet.org/）以及Comparative Toxicogenomics Database數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//ctdbase.org/）中以“Osteoporosis”或“OP”為關(guān)鍵詞，設(shè)定物種為“Homo Sapiens”檢索與OP相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，通過(guò)韋恩圖將“1.2”中篩選出的藥物靶點(diǎn)與相關(guān)疾病靶點(diǎn)映射篩選出共同靶點(diǎn)，從而確定“杜仲-牛膝”藥對(duì)治療OP的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析 將1.3項(xiàng)中篩選得到的治療OP潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING Version：11.0數(shù)據(jù)庫(kù)[12]（https：//string-db.org/），Organism（種屬）設(shè)為“Homo Sapiens（人類）”，得到PPI關(guān)系，保存數(shù)據(jù)為TSV格式。運(yùn)用Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并分析篩選出核心靶點(diǎn)。

1.5 靶點(diǎn)富集分析與可視化 將“杜仲-牛膝”藥對(duì)治療OP的潛在作用靶點(diǎn)輸入到FunRich3.1.3軟件進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析，設(shè)定閾值為P<0.05，分別選取生物學(xué)過(guò)程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）、細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）中顯著性前6的條目通過(guò)“Analysis”功能構(gòu)建圖形可視化。使用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）富集分析[13]，設(shè)置P<0.05，通路分析選取與OP關(guān)聯(lián)的且顯著性較高的信號(hào)通路借助Omicshare（http：//omicshare.com/）進(jìn)行可視化。

1.6 分子對(duì)接 將1.2項(xiàng)下篩選出的主要活性成分輸入到ZINC（http：//zinc.docking.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載其3D結(jié)構(gòu)，保存為“mol2”格式文件。將1.4項(xiàng)下篩選的核心蛋白靶點(diǎn)通過(guò)RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rcsb.org/）下載靶點(diǎn)蛋白的3D結(jié)構(gòu)，保存為“pdb”格式文件，將靶點(diǎn)蛋白及活性成分的3D結(jié)構(gòu)導(dǎo)入到MAESTRO version 11.5中，靶點(diǎn)蛋白通過(guò)“Protein preparation”套件去水、加氫生成pH值為7.0±2的小分子構(gòu)象，活性成分通過(guò)“Ligprep”進(jìn)行預(yù)處理，“Receptor Grid Gener”套件確定活性位點(diǎn)，運(yùn)用“Ligand Docking”面板進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接方式為半柔性對(duì)接，以對(duì)接評(píng)分“Docking Score”評(píng)價(jià)“杜仲-牛膝”藥對(duì)主要活性成分與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合情況。

2 結(jié)果

2.1 藥物中主要化學(xué)成分的篩選 檢索得到“杜仲-牛膝”藥對(duì)中共290個(gè)化合物（5個(gè)為共有化合物），其中杜仲119個(gè)，牛膝176個(gè)。篩選出42個(gè)活性化合物，其中25個(gè)來(lái)自杜仲，20個(gè)來(lái)自牛膝，3個(gè)為共有化合物。見(jiàn)圖1。“杜仲-牛膝”藥對(duì)中部分活性化合物基本信息見(jiàn)表1。

2.2 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 ? 該網(wǎng)絡(luò)共有177個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中包含2個(gè)藥物節(jié)點(diǎn)、42個(gè)活性成分節(jié)點(diǎn)和133個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，共有885條邊。其中藍(lán)色菱形代表杜仲、牛膝，黃色三角形代表活性成分，紅色箭頭代表靶點(diǎn)，每條邊表示節(jié)點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。見(jiàn)圖2。借助“Network Analyze”功能對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?。篩選度值（Degree）較大的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，這些節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中起到了樞紐作用，可能是關(guān)鍵化合物或靶點(diǎn)。該網(wǎng)絡(luò)中活性成分的平均度值為21.07。從活性成分方面分析，有51%的活性成分作用靶點(diǎn)≥21個(gè)，其中槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、漢黃芩素、刺桐靈堿、豆甾醇分別能與20個(gè)以上的靶點(diǎn)蛋白發(fā)生作用，這些可能是“杜仲-牛膝”藥對(duì)中治療OP的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.3 “杜仲-牛膝”藥對(duì)治療OP的潛在作用靶點(diǎn) ? 基于GeneCards收集到26個(gè)OP靶點(diǎn)，DisGeNET收集到63個(gè)，CTD收集到820個(gè)，三者合并去重后篩選共得到847個(gè)OP相關(guān)靶點(diǎn)，將“杜仲-牛膝”藥對(duì)調(diào)控靶點(diǎn)和OP疾病靶點(diǎn)經(jīng)過(guò)Venny在線平臺(tái)（http：//www.interactivenn.net/）分析后，獲得74個(gè)交集靶點(diǎn)，即為藥物治療OP的潛在作用靶點(diǎn)。見(jiàn)圖3。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?圖4顯示該網(wǎng)絡(luò)共有74個(gè)節(jié)點(diǎn)、856條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值為23.14，圖中節(jié)點(diǎn)的大小、顏色和度值是正相關(guān)關(guān)系，節(jié)點(diǎn)的度值越大，顯示的節(jié)點(diǎn)越大且顏色越深。度值越大說(shuō)明與其他蛋白相互作用更強(qiáng)一些，可能在發(fā)揮生物學(xué)功能中起著重要的作用。度值排名前10的靶點(diǎn)為白細(xì)胞介素6（IL6）、腫瘤壞死蛋白P53（TP53）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）、腫瘤壞死因子（TNF）、JUN蛋白（JUN）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、過(guò)氧化氫合成酶2（PTGS2）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8），這些靶點(diǎn)可能是“杜仲-牛膝”藥對(duì)發(fā)揮治療OP功效的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.5 靶點(diǎn)富集分析 通過(guò)FunRich3.1.3軟件共篩選得到GO條目343個(gè)（P<0.05），其中BP條目251個(gè)，MF條目64個(gè)，CC條目28個(gè)。其中BP主要涉及序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞增殖、凋亡過(guò)程、血管生成等;MF主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)均二聚活性、ATP結(jié)合、鋅離子結(jié)合等方面;CC方面主要涉及核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外空間、胞質(zhì)溶膠、質(zhì)膜等方面。各類別前6的條目見(jiàn)圖5。

通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到90條（P<0.05）KEGG富集信號(hào)通路。主要涉及癌癥信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、PI3K-AKT、TNF、Wnt、cAMP、HIF-1等信號(hào)通路。富集顯著性前30的信號(hào)通路見(jiàn)圖6。縱軸代表通路名稱，橫軸代表富集因素的百分比;氣泡的大小和顏色分別代表富集靶點(diǎn)數(shù)和P值，顏色越紅P值越小。杜仲-牛膝”藥對(duì)和“PI3K-AKT信號(hào)通路的交集靶點(diǎn)見(jiàn)圖7。

2.6 分子對(duì)接 選取PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名前3的靶點(diǎn)蛋白，分別為IL6、TP53、VEGFA，與“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中度值排名前3的活性成分，分別為槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚，利用Maestro Version 11.5軟件進(jìn)行分子對(duì)接。見(jiàn)表2。Docking Score的絕對(duì)值越大，化合物與靶點(diǎn)結(jié)合力越強(qiáng)，分子構(gòu)象越穩(wěn)定。根據(jù)對(duì)接分?jǐn)?shù)大小評(píng)判，絕對(duì)值>4.25代表結(jié)合活性一般，絕對(duì)值>5.0代表結(jié)合活性比較好，絕對(duì)值>7.0代表結(jié)合活性較強(qiáng)[14]。分子對(duì)接結(jié)果顯示IL6與槲皮素、山柰酚的親和力最強(qiáng)，山柰酚與VEGFA的結(jié)合能力最強(qiáng)。圖8可以觀察到藥物活性成分與靶點(diǎn)蛋白相結(jié)合的具體位點(diǎn)，黃色連線為二者之間的氫鍵相互作用力，為促使分子結(jié)合到活性位點(diǎn)的主要作用力。

3 討論

隨著人口老齡化進(jìn)程的加速，OP的發(fā)病率緊隨心血管病、糖尿病，已躍居至慢性疾病的第3位，成為世界的常見(jiàn)病和多發(fā)病[15]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)OP的治療主要為雌激素替代療法，但雌激素的長(zhǎng)期使用會(huì)增加乳腺癌、冠心病等疾病的患病概率，其他臨床上使用的化學(xué)合成藥物均存在一定的不良反應(yīng)[16]。而中藥治療OP具有不良反應(yīng)小、療效明確、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)小的特點(diǎn)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為OP歸屬于“骨痿”“骨枯”“骨痹”等范疇。腎主骨生髓，腎精充盈，則骨髓生化有源，腎氣虧虛，則骨髓失養(yǎng)。由此，腎精虧損是該病的主要病機(jī)。而肝主筋，約束骨骼;脾主百骸，榮養(yǎng)四肢關(guān)節(jié);因此骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制以腎虛為本，與肝虛、脾虛、血瘀密切相關(guān)[17]。杜仲、牛膝均可補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨。用于肝腎不足，腰膝酸痛，筋骨無(wú)力?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，杜仲的化學(xué)成分主要有黃酮類、苯丙素類化合物以及多種氨基酸和微量元素，具有抗疲勞、抗骨質(zhì)疏松等多種藥理作用[18]。

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果可以看出，槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇、黃芩素、刺桐靈堿、小檗堿是“杜仲-牛膝”藥對(duì)中主要的活性成分?；诜肿訉?duì)接模擬其結(jié)合活性，結(jié)果顯示槲皮素、山柰酚與IL6、TP53、VEGFA對(duì)接均具有較好的結(jié)合活性。槲皮素和山柰酚均為黃酮類化合物。鄭紅等[19]研究表明，槲皮素能夠有效促進(jìn)成骨分化，并通過(guò)上調(diào)BMP2和Smad4的表達(dá)改善OP。小鼠模型經(jīng)槲皮素處理后測(cè)定骨質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其骨鈣素含量上升，骨源性堿性磷酸酶（NBAP）及雌二醇的含量減少[20]。山柰酚能夠增加骨密度，改善骨微結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)研究表明Ca2+代謝可被高劑量的山柰酚所影響，通過(guò)調(diào)節(jié)代謝平衡來(lái)促進(jìn)構(gòu)造蛋白質(zhì)生成，改善骨小梁丟失以達(dá)到治療骨質(zhì)疏松的目的[21]。付方勝等[22]認(rèn)為黃芩素可以抑制破骨細(xì)胞的形成以及抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能，從而預(yù)防OP的發(fā)生。并且在一定程度上減緩骨流失并部分恢復(fù)骨量，同時(shí)在體外可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）的增殖和成骨分化[23]。小檗堿可以促進(jìn)p-AKT蛋白的表達(dá)，并通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)前成骨細(xì)胞的分化與礦化[24]。

本研究通過(guò)對(duì)“杜仲-牛膝”藥對(duì)治療OP的PPI網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)IL6、TP53、VEGFA、TNF、JUN、MAPK1、EGF、PTGS2、EGFR、MAPK8等靶點(diǎn)是“杜仲-牛膝”藥對(duì)治療OP的主要作用靶點(diǎn)。其中IL6在成骨偶聯(lián)過(guò)程中發(fā)揮多重作用，成骨細(xì)胞與單核細(xì)胞均可合成IL6，IL6被合成后又直接作用于破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，影響破骨細(xì)胞的活性，加速了OP的發(fā)生與發(fā)展[25]。VEGFA通過(guò)激活MAPK通路可以誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)了成骨。TNF屬于炎癥介質(zhì)，它可以刺激破骨細(xì)胞分化形成，促進(jìn)分解代謝和骨細(xì)胞的破壞，是導(dǎo)致OP的重要環(huán)節(jié)[26]。TP53基因是一種腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞應(yīng)激活動(dòng)中起重要作用。它通過(guò)激活多種細(xì)胞保護(hù)途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，參與成骨破骨過(guò)程[27]。EGF稱為表皮生長(zhǎng)因子，Vary等[28]研究發(fā)現(xiàn)，成骨分化中的標(biāo)志基因血清堿性磷酸酶和Ocn的表達(dá)可被EGF抑制，說(shuō)明EGF可能影響成骨分化的負(fù)調(diào)控。JUN屬于JUN蛋白家族中的一種，而JUN蛋白是轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1（Activatorprotein1，AP-1）家族中4個(gè)亞家族中的1個(gè)，研究發(fā)現(xiàn)AP-1可通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)，來(lái)影響細(xì)胞的凋亡過(guò)程，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，加快破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化[29-30]。MAPK1、MAPK8均屬于絲裂原活化蛋白激酶家族，其可通過(guò)對(duì)成骨細(xì)胞增殖和分化過(guò)程的促進(jìn)，進(jìn)而誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的形成來(lái)發(fā)揮對(duì)OP的防治作用[31]。EGFR是ERK2的上游信號(hào)分子，具有酪氨酸激酶活性，可以通過(guò)與表皮生長(zhǎng)因子組合，啟動(dòng)細(xì)胞核內(nèi)基因，從而促進(jìn)細(xì)胞分裂[32]。

KEGG通路富集分析得到與OP較為相關(guān)的通路有PI3K-AKT、TNF、Wnt、HIF-1、MAPK信號(hào)通路。研究表明，PI3K-AKT信號(hào)通路參與骨質(zhì)疏松、骨性關(guān)節(jié)炎、骨壞死等病理性骨病，并參與調(diào)控破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖、分化及凋亡[33]。正常生理情況下，PI3K-AKT信號(hào)通路可以選擇性的影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的生理功能，保護(hù)骨小梁結(jié)構(gòu)，降低破骨細(xì)胞分化，通過(guò)降低Caspases-9活性，從而減輕細(xì)胞損傷所致的細(xì)胞凋亡，影響破骨細(xì)胞形成[34]。腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞活性及骨吸收的作用，其中分離出的糖蛋白骨保護(hù)素（Osteoprotegerin，OPG）對(duì)骨也具有積極的保護(hù)作用[35-36]。Wnt信號(hào)通路可以通過(guò)抑制MSCs向軟骨和成脂譜系的分化，來(lái)增強(qiáng)成骨細(xì)胞譜系分化[37-38]。成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的Wnt信號(hào)通過(guò)OPG的分泌從而間接抑制破骨細(xì)胞的分化和骨吸收[39]。Wnt信號(hào)通路直接或間接地對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控，在控制骨量與OP的發(fā)生發(fā)展方面具有重要作用。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接相結(jié)合的方法，篩選出“杜仲-牛膝”藥對(duì)治療OP的活性成分，關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)“杜仲-牛膝”藥對(duì)可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、分化與凋亡、骨代謝來(lái)治療OP，具有多成分、多靶點(diǎn)、多系統(tǒng)的特點(diǎn)，并基于分子對(duì)接初步模擬其可能的分子作用機(jī)制，為“杜仲-牛膝”藥對(duì)治療OP機(jī)制研究提供了理論依據(jù)和線索。鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)的局限性，其預(yù)測(cè)結(jié)果還需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

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（2020-08-27收稿 責(zé)任編輯：魏慶雙，徐穎）