外泌體源性miRNAs在心肌缺血再灌注損傷中的研究進(jìn)展

翟玉紅 楊 俊 楊 簡 張 靜 李 奇 鄭 濤 范致星

(三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 心血管內(nèi)科 & 三峽大學(xué) 心血管病研究所， 湖北 宜昌 443003)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是目前人類死亡和致殘的主要原因，及時(shí)行再灌注治療(如經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)和早期溶栓等)是挽救AMI患者最有效的方法。但是，再灌注治療的同時(shí)常伴隨心肌頓抑、再灌注心律失常、微血管功能障礙等一系列心臟相關(guān)不良事件發(fā)生，造成心肌損傷進(jìn)一步加重，這一現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[1]。外泌體是細(xì)胞內(nèi)多囊體與質(zhì)膜融合后釋放至細(xì)胞外的囊泡樣小體，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，通過轉(zhuǎn)運(yùn)miRNAs、circRNAs、mRNAs、DNAs和脂質(zhì)等生物分子成為細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)[2]。新近研究發(fā)現(xiàn)，心血管病患者外泌體miRNAs差異性表達(dá)可操控多種基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，干預(yù)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、凋亡等病理生理過程，逐漸成為心血管疾病治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)[3]。本文就外泌體源性miRNAs在MIRI發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展進(jìn)行歸納總結(jié)。

1 外泌體miRNAs

1.1 外泌體miRNAs的結(jié)構(gòu)及功能

外泌體是直徑為30～150 nm，由各種類型的真核細(xì)胞釋放到血液、腦脊液、唾液、膽汁等細(xì)胞外液中的杯狀脂質(zhì)雙層膜泡，通過傳遞蛋白質(zhì)、糖、脂類、mRNAs、miRNAs和lncRNAs形成巨大的通訊網(wǎng)絡(luò)，參與包括發(fā)育、免疫、組織穩(wěn)態(tài)、腫瘤和神經(jīng)退行性疾病的調(diào)節(jié)[4]。深入研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中含有大量miRNAs，其中異質(zhì)性胞核核糖核蛋白A2B1和KRAS基因在外泌體選擇性富集miRNs的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。外泌體miRNAs是一類內(nèi)生的、長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNAs，是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后的主要因子，在外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊中有著十分重要的意義[6]。外泌體通過質(zhì)膜融合、細(xì)胞胞飲以及特異性受體依賴途徑將miRNAs轉(zhuǎn)運(yùn)、釋放至靶細(xì)胞，隨后miRNAs以完全或不完全配對(duì)方式結(jié)合至靶mRNAs的3’非編碼區(qū)和/或5’非編碼區(qū)及開放閱讀框參與調(diào)節(jié)基因表達(dá)，其中，由2～7個(gè)核苷酸組成“miRNA種子序列”是影響功能靶點(diǎn)的重要因素[7, 8]。外泌體miRNAs的主要功能是參與靶基因水平的負(fù)向調(diào)控，單個(gè)miRNA可以調(diào)節(jié)多個(gè)靶基因位點(diǎn)，同時(shí)單個(gè)mRNA也可被多個(gè)miRNAs調(diào)控。如果miRNAs與靶mRNAs完全匹配，導(dǎo)致靶mRNAs降解；反之，則會(huì)抑制靶基因翻譯[9]。此外，部分外泌體miRNAs還具有與toll樣受體結(jié)合，激活免疫細(xì)胞的能力[10]。

1.2 外泌體miRNAs的生物學(xué)特性

外泌體的磷脂雙分子膜結(jié)構(gòu)使外泌體miRNAs在細(xì)胞外液中高度穩(wěn)定且易于檢測(cè)，將外泌體置于4℃儲(chǔ)存96 h或在-70℃儲(chǔ)存1個(gè)月后，外泌體miRNAs的表達(dá)譜仍未發(fā)生明顯的改變[11]。外泌體廣泛參與器官/組織間信號(hào)通路交叉串?dāng)_，其中miRNAs的表達(dá)水平與細(xì)胞功能紊亂密切相關(guān)。由于泛素、轉(zhuǎn)運(yùn)必需內(nèi)體分選復(fù)合物、Y-box蛋白27等調(diào)節(jié)蛋白的存在，患者和正常個(gè)體中的外泌體miRNAs含量存在顯著差異[12, 13]。當(dāng)機(jī)體受到損傷時(shí)，組織中特異性外泌體miRNAs釋放入外周血循環(huán)，致使血漿中miRNAs的表達(dá)譜發(fā)生改變。值得注意的是，其變化常出現(xiàn)在某些疾病的早期階段，相比常規(guī)檢查具有更高的敏感性和特異性，并且這些miRNAs可通過多種機(jī)制改變靶細(xì)胞的活性，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[14]。富集血漿外泌體進(jìn)行分離和鑒定發(fā)現(xiàn)，AMI后大量miRNAs的表達(dá)水平升高；其中miR-21、miR-26和miR-328主要參與心臟重構(gòu)；心肌細(xì)胞特異性外泌體miR-208a則隨細(xì)胞凋亡程度發(fā)生動(dòng)態(tài)改變[15]。Pan等[16]在研究肥胖癥小鼠體內(nèi)脂肪細(xì)胞炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗的分子機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞分泌的外泌體miR-34a以旁分泌的方式進(jìn)入巨噬細(xì)胞，靶向調(diào)節(jié)KLF4轉(zhuǎn)錄，抑制M2巨噬細(xì)胞極化，從而成為調(diào)控炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)。同時(shí)，胰腺β細(xì)胞來源的外泌體miR-15a可直接與視網(wǎng)膜細(xì)胞Akt3基因的3’非編碼區(qū)結(jié)合，通過抑制PI3K途徑減少細(xì)胞中活性氧的積累[17]。小膠質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體miR-124-3p是靶向下調(diào)FIP200介導(dǎo)的細(xì)胞自噬，減輕創(chuàng)傷性腦損傷的重要靶點(diǎn)[18]。因此，外泌體miRNAs通過不同路徑參與疾病的發(fā)生發(fā)展，可能在MIRI病變中起到重要的作用。

2 外泌體miRNAs在MIRI中的研究

近年來，大量研究表明，外泌體miRNAs通過自分泌、旁分泌、遠(yuǎn)距分泌的方式，參與調(diào)控MIRI過程中凋亡、炎癥、自噬、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙等多種病理反應(yīng)，發(fā)揮積極的保護(hù)作用，成為心血管領(lǐng)域研究的重點(diǎn)[19, 20]。

2.1 外泌體miRNAs與細(xì)胞死亡

自噬和凋亡是缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)誘導(dǎo)損傷細(xì)胞死亡的主要途徑，并在心臟損傷病理演變過程中占有重要地位。減少I/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡和心功能障礙是改善MIRI的有效方法[21]。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是降低心臟疾病風(fēng)險(xiǎn)、提供心血管保護(hù)的有利因素。Hou等[22]鑒定出運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練衍生的血漿外泌體中部分miRNAs的表達(dá)上調(diào)，隨后在缺氧復(fù)氧(hypoxia reoxygenation，H/R)模型中評(píng)估這部分miRNAs對(duì)心肌細(xì)胞功能的影響，發(fā)現(xiàn)miR-342-5p可以顯著降低caspase9和JNK2蛋白水平，抑制LDH的釋放，從而減少心肌細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞活力。Chen等[23]研究表明，當(dāng)發(fā)生MIRI時(shí)，缺氧誘導(dǎo)因子-1α促進(jìn)心肌細(xì)胞釋放大量外泌體miR-30a，通過抑制自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和Atg12的活性來減少心肌細(xì)胞死亡。然而，Xu等[24]使用外泌體miR-30a抑制劑處理I/R大鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-30a抑制劑能顯著降低ULK1和Beclin-1的蛋白水平，通過減少自噬抑制心肌凋亡。上述研究提示，外泌體miRNAs的來源可能是影響缺血再灌注損傷的重要因素。

研究表明，成人心肌細(xì)胞的增殖和自我修復(fù)能力有限，干細(xì)胞移植治療成為心臟修復(fù)和再生的新趨勢(shì)[25]。干細(xì)胞來源的外泌體作為細(xì)胞間信息交流的載體，具有低免疫原性、高穩(wěn)定性和良好的生物相容性，且外泌體攜帶的miRNAs可直接到達(dá)心臟表面，發(fā)揮保護(hù)作用，成為干細(xì)胞治療MIRI的重要方式[26, 27]。Wang等[28]將誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的外泌體通過心肌注射的方式遞送至AMI小鼠的局部缺血區(qū)域，隨后再灌注24 h，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞高度富集外泌體源心肌保護(hù)性miR-21和miR-210，從而表現(xiàn)出低caspase3活性。同時(shí)，Li等[29]發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體富含miR-29c，將外泌體通過心尖注射處理I/R大鼠，發(fā)現(xiàn)外泌體miR-29c通過抑制PTEN基因表達(dá)和激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路，降低過度自噬導(dǎo)致的再灌注心肌損傷。

2.2 外泌體miRNAs與炎癥反應(yīng)

炎癥反應(yīng)對(duì)延緩疾病發(fā)展具有重要意義，巨噬細(xì)胞極化在I/R組織炎癥損傷和修復(fù)進(jìn)程中扮演重要角色[30]。Dai等[31]發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞來源的外泌體能提高H/R乳鼠心肌細(xì)胞存活率，維持細(xì)胞膜的完整性。同時(shí)，微陣列分析提示M2型巨噬細(xì)胞外泌體是導(dǎo)致乳鼠心肌細(xì)胞miR-148a表達(dá)水平升高的主要原因，miR-148a可下調(diào)硫氧還蛋白互作蛋白表達(dá)，干預(yù)TLR4/NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而抑制NLRP3炎癥小體激活。Wei等[32]利用miR-181a的免疫抑制效應(yīng)和干細(xì)胞源性外泌體與細(xì)胞靶向結(jié)合的能力，將過表達(dá)miRNA-181a的間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體注射到I/R小鼠的心肌組織，發(fā)現(xiàn)miRNA-181a可下調(diào)c-Fos蛋白水平，限制樹突狀細(xì)胞遷移，促進(jìn)外周血單個(gè)核細(xì)胞Treg極化，減輕MIRI炎癥反應(yīng)。

2.3 外泌體miRNAs與氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激與miRNAs之間的相互作用是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要方式，同時(shí)，這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)在I/R中也發(fā)揮著重要作用。已有研究報(bào)道，miR-150和miR-21參與調(diào)控氧化應(yīng)激介導(dǎo)的MIRI[33]。缺血預(yù)處理導(dǎo)致血漿中外泌體miR-21表達(dá)水平明顯上升，Wen等[34]發(fā)現(xiàn)外泌體miR-21可顯著減少過氧化氫處理的H9C2細(xì)胞凋亡和大鼠MIRI，由此證明外泌體miR-21參與心肌I/R過程中的氧化應(yīng)激反應(yīng)。Wang等[35]分別在過氧化氫和氯化鈷誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞急性H/R模型中發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-126與 ErbB受體反饋抑制物1靶向結(jié)合，減少心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累，通過清除氧自由基和穩(wěn)定線粒體膜電位來抑制心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激。

2.4 外泌體miRNAs的其他作用機(jī)制

多種機(jī)制貫穿MIRI的全過程，外泌體miRNAs傳遞信息的同時(shí)也參與了組織修復(fù)、心室重塑和血管生成的調(diào)節(jié)。其中血管的快速再生是延長受損心肌存活的關(guān)鍵。在健康志愿者和缺血性心臟病患者血漿外泌體miRNAs調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞功能的研究中，Li等[36]發(fā)現(xiàn)缺血誘導(dǎo)的血漿外泌體miR-939-5p下調(diào)，可減輕對(duì)iNOS活性和內(nèi)皮NO產(chǎn)生的抑制，最終促進(jìn)血管新生。應(yīng)用大鼠I/R模型，結(jié)合主成分分析算法和偏最小二乘回歸方法評(píng)估嬰幼兒心臟祖細(xì)胞外泌體miRNAs的作用，結(jié)果顯示心臟祖細(xì)胞外泌體中miR-29c、miR-96、miR-182和miR-185參與改善梗死區(qū)域周邊心肌肥大及心肌纖維化程度，miR-27a可促進(jìn)血管再生，miR -138和miR-25則參與減少心肌細(xì)胞凋亡[37]。Emanueli等[38]發(fā)現(xiàn)，接受冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)的急性心?；颊?，心臟會(huì)釋放大量外泌體miR-210，miR-133a/b至血液循環(huán)，觸發(fā)組織適應(yīng)性修復(fù)。

3 展望和總結(jié)

外泌體miRNAs在心血管領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，干細(xì)胞是其主要的來源之一。同時(shí)，研究表明，高通量電刺激預(yù)處理干細(xì)胞是一種優(yōu)化外泌體miRNAs心臟修復(fù)功能的有效方式[39]。人工體外合成外泌體miRNAs也是一種治療缺血性心臟疾病的有效策略。miR-322的靶基因CULLIN2可負(fù)調(diào)控HIF-1α的表達(dá)，發(fā)揮促血管生成作用[40]。Youn等[41]通過電穿孔將miR-322載入心臟祖細(xì)胞源性外泌體中，用于治療AMI的小鼠，發(fā)現(xiàn)外泌體miR-322可顯著縮小梗死面積，促進(jìn)梗死邊緣區(qū)域血管新生。但是，如何個(gè)體化選擇需要修飾的miRNA，提高外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)效率、明確外泌體miRNAs的含量與療效之間的關(guān)系、以及降低治療的副作用等都是我們需要考慮的問題?？傊?，隨著研究的不斷深入，體外編輯或干預(yù)外泌體miRNAs的技術(shù)有望取得重大突破，為治療MIRI提供新方法。

外泌體作為細(xì)胞間信息交流的信使，通過轉(zhuǎn)運(yùn)miRNAs調(diào)節(jié)MIRI發(fā)展過程中炎癥、自噬、凋亡、氧化應(yīng)激等病理反應(yīng)。但是，目前我們對(duì)外泌體miRNAs干預(yù)MIRI發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)有限，外泌體miRNA的提取、純化、修飾、人工處理以及檢測(cè)等技術(shù)仍有待提升，相關(guān)臨床實(shí)驗(yàn)還需進(jìn)一步完善。因此，外泌體miRNAs在MIRI的研究應(yīng)用仍有待更深入的探索。