基于GEO數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)分析卵巢癌順鉑耐藥相關(guān)基因及意義

嚴(yán) 靜 黃益玲 黃利鳴

(1. 三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖北 宜昌 443002； 2. 三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)系， 湖北 宜昌 443002)

卵巢癌是女性常見惡性腫瘤，通常發(fā)生在圍絕經(jīng)期，其中上皮性腫瘤最為常見，約占90%以上，近年來有年輕化趨勢(shì)。因缺乏篩查和早期診斷的方法，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)患病時(shí)已處于疾病晚期，且半數(shù)在治療后16個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)，或發(fā)生化療耐藥，5年總體生存率在50%以下[1]。腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合以鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療方案仍是卵巢癌首選治療模式，臨床上將患者對(duì)鉑類化療藥物敏感程度分為鉑類敏感型、鉑類耐藥型。鉑類敏感型指對(duì)初期以鉑類藥物為基礎(chǔ)的治療有明確反應(yīng),且已經(jīng)達(dá)到臨床緩解,停用化療后12個(gè)月以上出現(xiàn)進(jìn)展或復(fù)發(fā)。鉑類耐藥型指對(duì)初期的化療有反應(yīng),但在完成化療后6個(gè)月內(nèi)病情進(jìn)展或復(fù)發(fā)[2]。卵巢癌的頑固耐藥使得傳統(tǒng)治療方法療效十分有限，對(duì)腫瘤進(jìn)展的分子機(jī)制也缺乏了解，因此需要更多關(guān)于卵巢癌的基礎(chǔ)研究。

鉑類抗癌藥物主要指順鉑、卡鉑、奧沙利鉑，是目前臨床應(yīng)用中對(duì)多種腫瘤具有較高活性的抗腫瘤藥物。順鉑(cisplatin)自從上世紀(jì)70年代被發(fā)現(xiàn)可以抑制腫瘤細(xì)胞生長后,就廣泛應(yīng)用于腫瘤化學(xué)治療，具有抗腫瘤譜廣、作用強(qiáng)、與多種抗腫瘤藥有協(xié)同作用等特點(diǎn)[3]。順鉑通過被動(dòng)擴(kuò)散或者通過轉(zhuǎn)運(yùn)子(copper transport protein 1，CTR1)運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),再進(jìn)入細(xì)胞核作用于DNA分子[4]。順鉑耐藥可能通過降低細(xì)胞對(duì)藥物的攝取、藥物的失活、通過細(xì)胞硫醇進(jìn)行藥物解毒、改變藥物靶標(biāo)和修復(fù)受損DNA等途徑產(chǎn)生[5]。

生物信息學(xué)是基于計(jì)算機(jī)模擬方法對(duì)比篩選基因芯片數(shù)據(jù)，進(jìn)行基因挖掘和功能預(yù)測(cè)[6]?；蛐酒峁┝她嫶蟮纳锘蛐畔?shù)據(jù)，包括mRNA數(shù)據(jù)、DNA甲基化數(shù)據(jù)、非編碼RNA數(shù)據(jù)等，可以高效獲取腫瘤分子標(biāo)志物，為后續(xù)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分子標(biāo)志物提供可靠依據(jù)[7,8]。本研究擬通過GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫獲取卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞系和順鉑敏感細(xì)胞系之間的差異基因(differentially expressed genes, DEGs)，尋找可靠的腫瘤分子標(biāo)記物，為卵巢癌順鉑耐藥患者的診斷和治療提供可靠基因靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集獲取

通過關(guān)鍵詞“ovarian cancer”和“drug resistance”檢索GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)數(shù)據(jù)庫，篩選以物種“人類”為研究對(duì)象且同時(shí)具有卵巢癌順鉑耐藥組和順鉑敏感對(duì)照組細(xì)胞系，獲得3個(gè)數(shù)據(jù)集：GSE58470，GSE15372，GSE33482，使用GEO篩選DEGs。GSE58470數(shù)據(jù)集基于GPL6947平臺(tái)[Illumina HumanHT-12 V3.0]，IGROV-1細(xì)胞系，包含6組順鉑耐藥組，3組順鉑敏感組。GSE15372數(shù)據(jù)集基于GPL570平臺(tái)[HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array，A2780上皮性卵巢癌細(xì)胞系，包含5組順鉑耐藥組，5組順鉑敏感組。GSE33482數(shù)據(jù)集基于GPL6480平臺(tái)[Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K G4112F]，A2780上皮性卵巢癌細(xì)胞系，包含6組順鉑耐藥組，6組順鉑敏感組。各數(shù)據(jù)集中顯著DEGs，篩選標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為：①P<0.05；②Log2|FC|(fold change)>1(即差異倍數(shù)>2倍)。為降低結(jié)果的假陽率，Venny2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.htm)在線軟件對(duì)上述3個(gè)數(shù)據(jù)集的顯著DEGs做韋恩圖取交集。

1.2 顯著差異基因GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路分析

利用DAVID(http://david. ncifcrf.gov)在線分析工具，對(duì)顯著DEGs進(jìn)行GO功能富集分析，以了解其分子功能(molecular function，MF)、參與的生物學(xué)過程和途徑(biological process，BP)及細(xì)胞組分和定位(cellular component，CC)，并進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，以P<0.05作為納入標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 構(gòu)建卵巢癌順鉑耐藥顯著DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并篩選Hub基因

將獲得的顯著DEGs導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，蛋白質(zhì)間存在高度相互關(guān)系篩選標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為：P<0.05,使用Cytoscape構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。將STRING所得的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)信息數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape中，利用MCODE插件(molecular complex detection，分子復(fù)雜性檢測(cè))篩選顯著DEGs中關(guān)鍵蛋白模塊，尋找Hub基因，篩選條件為：MCODE score>5，degree cut-off=2，node score cut-off=0.2，Max depth=100，k score=2。

1.4 Hub基因生存率分析

使用UALCAN[9]分析Hub基因與卵巢癌生存相關(guān)性，“Survival”的分析結(jié)果以P<0.05作為納入標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 篩選獲得67個(gè)卵巢癌順鉑耐藥顯著DEGs

GSE58470數(shù)據(jù)集篩選顯著DEGs 701個(gè)，其中上調(diào)450個(gè)，下調(diào)251個(gè)；GSE15372數(shù)據(jù)集篩選顯著DEGs 3336個(gè)，其中上調(diào)822個(gè)，下調(diào)2514個(gè)；GSE33482數(shù)據(jù)集篩選顯著DEGs 3359個(gè)，其中上調(diào)2034個(gè)，下調(diào)1325個(gè)。分別繪制3個(gè)數(shù)據(jù)集GSE58470、GSE15372、GSE33482基因表達(dá)的火山圖(圖1A、1B、1C)，紅色為上調(diào)基因、綠色為下調(diào)基因。將3個(gè)數(shù)據(jù)集顯著差異基因取交集制作韋恩圖(圖1D)，得到67個(gè)共表達(dá)的顯著差異基因。

注：A、B、C：分別為GSE58470、GSE15372、GSE33482數(shù)據(jù)集的火山圖； D：差異共表達(dá)基因的韋恩圖圖1 卵巢癌順鉑耐藥顯著DEGs分析

2.2 顯著DEGs涉及的主要分子功能、生物學(xué)過程、細(xì)胞組分及信號(hào)通路

使用DAVID在線網(wǎng)站分析篩選所得67個(gè)顯著DEGs，GO分析結(jié)果表明顯著DEGs主要參與分子功能包括結(jié)構(gòu)分子活性；生物學(xué)功能包括消化道發(fā)育、指甲發(fā)育、細(xì)胞對(duì)高氧反應(yīng)、細(xì)胞基質(zhì)粘附、整合素介導(dǎo)的信號(hào)通路、中胚層細(xì)胞分化、傷口愈合、成骨細(xì)胞分化、肽基絡(luò)氨酸磷酸化調(diào)控；細(xì)胞中組分包括細(xì)胞外泌體(圖2)。KEGG通路分析表明，顯著DEGs主要在局灶性黏連、調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白、心律失常性右室心肌病、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用等方面富集(表1)。

表1 卵巢癌順鉑耐藥差異基因KEGG通路富集分析

圖2 卵巢癌順鉑耐藥差異基因GO富集分析

2.3 顯著DEGs構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)并分析獲得10個(gè)Hub基因

使用STRING數(shù)據(jù)庫分析篩選所得67個(gè)顯著DEGs，獲得存在相互作用關(guān)系的PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖3A)，并獲得緊密連接度最高的基因模塊(圖3B)。Cytoscape軟件篩選PPI網(wǎng)絡(luò)信息后獲得10個(gè)Hub基因：整合素β2(integrin subunit beta 2，ITGB2)、人源黏著斑蛋白(vinculin，VCL)、整合素α2(integrin subunit alpha2，ITGA2)、整合素β4(integrin subunit beta 4，ITGB4)、鳥苷酸結(jié)合蛋白1(guanylate binding protein 1，GBP1)、Ⅵ型膠原α1(collagen type VI alpha 1 chain，COL6A1)、金屬硫蛋白2A(metallothionein 2A，MT2A)、月桂酰2-磺基轉(zhuǎn)移酶(uronyl 2-sulfotransferase，UST)、胞外基質(zhì)蛋白多糖(versican，VCAN)、硫酸皮膚素差向異構(gòu)酶(dermatan sulfate epimerase like，DSEL)。

2.4 Hub基因與患者總生存率相關(guān)性

UALCAN在線網(wǎng)站分析各Hub基因與卵巢癌生存期相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VCAN與卵巢癌生存期顯著相關(guān)(P<0.05，見圖4)。

注：A：67個(gè)顯著DEGs相互作用關(guān)系的PPI網(wǎng)絡(luò)圖；B：緊密連接度最高的基因模塊圖3 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖及緊密連接度最高的基因模塊

3 討論

卵巢癌可根據(jù)形態(tài)學(xué)分為不同類別，包括漿液性癌、粘液性癌、子宮內(nèi)膜樣癌、透明細(xì)胞癌、混合性和未分化型移行細(xì)胞癌。這些亞型在病因、細(xì)胞形態(tài)、分子生物學(xué)和預(yù)后方面各不相同，卻被視為一個(gè)整體。這種腫瘤自身異質(zhì)性，使免疫治療、小分子靶向藥物產(chǎn)生較大個(gè)體差異。PARP抑制劑(poly ADP ribose polymerase，多腺苷二磷酸核糖聚合酶) 為卵巢癌的治療帶來了重大變革，在初始治療或鉑敏感復(fù)發(fā)治療獲得完全緩解和部分緩解后應(yīng)用PARP抑制劑可顯著延長卵巢癌患者的無進(jìn)展生存期[10]。但鉑耐藥復(fù)發(fā)患者難以治愈，治療方案只能選擇姑息治療的同時(shí)維持生活質(zhì)量。鉑類藥物經(jīng)典的耐藥機(jī)制包括三方面：①藥物攝取減少，藥物泵出增加,兩者都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度減少；②谷胱甘肽(glutathione，GSH)和其他抗氧化物質(zhì)對(duì)鉑類抗癌藥物的解毒作用，GSH是細(xì)胞內(nèi)一種分子量小且大量存在的具有抗氧化和解毒作用的三肽，谷胱甘肽可以和鉑(platinum，Pt)形成Pt-GSH，阻礙Pt與DNA的結(jié)合，使得細(xì)胞內(nèi)解毒作用增強(qiáng),細(xì)胞出現(xiàn)耐藥；③增強(qiáng)DNA修復(fù)或者增加耐受[11]。

VCAN是一種聚合硫酸軟骨素蛋白多糖，該基因位于染色體5q14.2-q14.3處，編碼蛋白是組成細(xì)胞外基質(zhì)的主要部分，屬于聚集蛋白聚糖/versican蛋白聚糖家族的成員，在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中扮演著重要的角色，也參與細(xì)胞粘附、增殖和血管生成，并在組織形態(tài)發(fā)生和維持中起關(guān)鍵作用[12]。VCAN基因在腫瘤組織中高表達(dá)，抑制其表達(dá)可發(fā)揮抗腫瘤作用，主要機(jī)制可能與參與調(diào)節(jié)內(nèi)源性Toll樣信號(hào)通路、p53下游信號(hào)通路和β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。Zhang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，VCAN表達(dá)水平與乳腺癌惡性程度呈正相關(guān)，并促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Li等[14]研究發(fā)現(xiàn)，VCAN高表達(dá)是胃癌預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。Mitsui等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在Caki-2和786-O腫瘤細(xì)胞系中，敲減VCAN基因表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，參與調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α，BID和BAK等TNF相關(guān)基因信號(hào)通路；還可抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力，參與下調(diào)基質(zhì)溶解素(matrix metalloproteinase，MMP)7和CXCR4表達(dá)。Zhao等[16]發(fā)現(xiàn)，MiR-135a-5p可通過靶向調(diào)控VCAN表達(dá)，抑制甲狀腺癌的細(xì)胞增殖。Ghosh等[17]對(duì)臨床樣本進(jìn)行免疫組化分析，結(jié)果顯示VCAN高表達(dá)與總體生存率較差、無進(jìn)展生存期、鉑耐藥性以及腫瘤微血管密度(microvessel density，MVD)增加有關(guān)。

注：A～J依次為基因ITGB2、VCL、ITGA2、ITGB4、GBP1、COL6A1、MT2A、UST、VCAN、DSEL在卵巢癌中生存曲線圖圖4 UALCAN分析患者的總生存率

綜上所述，本文通過GEO數(shù)據(jù)庫、差異基因篩選工具GEO2R分析卵巢癌順鉑耐藥基因芯片，結(jié)合DAVID在線分析工具、STRING數(shù)據(jù)庫、Cytoscape軟件、UALCAN在線網(wǎng)站等分析方法，最終獲得VCAN基因與卵巢癌生存風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，并且可能參與順鉑耐藥。下調(diào)卵巢癌順鉑耐藥患者VCAN基因表達(dá)，有可能改善患者耐藥，提高患者對(duì)順鉑化療敏感性，使患者獲得更大生存希望。