曹 旭 逄 越 李慶偉 （遼寧師范大學生命科學學院，七鰓鰻研究中心，大連116081）

糖鏈是進化最快的一類復雜生物大分子，糖基化是分泌蛋白和膜結合蛋白最常見、最復雜、最具可塑性的翻譯后修飾，在進化中存在更多的結構變異，使其表現(xiàn)出顯著的多樣性并具有多種生物學作用。唾液酸（sialicacid，Sia）是一類酸性九碳單糖的總稱，其家族成員有50 多種，主要是由N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac）、N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Gc）和脫氨神經(jīng)氨酸（deaminon-euraminic acid，KDN）這3 種核心結構衍生而成。Sia 作為糖衣末端單位覆蓋于細胞表面或在分泌分子的糖鏈上附著，能穩(wěn)定胞膜及其相關分子、傳遞跨膜信號，具有自配體和非自配體的受體功能等。Neu5Ac和Neu5Gc都參與構成鞘糖脂（glycopinglipid）和神經(jīng)節(jié)苷脂（ganglioside，GS）如GM3，Neu5Gc 以單天線或雙天線型（寡唾液酸或雙唾液酸鏈）連接在GS 或糖蛋白末端，這樣的結構有利于胚胎的早期發(fā)育和抗微生物感染并且與兒童神經(jīng)發(fā)育有關，還有助于提高認知能力［1-3］；此外它能中和毒素，調(diào)節(jié)血紅蛋白［4-5］；Neu5Gc 若在碳水化合物中，則可掩蓋抗原位點和受體，又可作為配體被各種微生物和Ⅰ型凝集素識別［6］；α2-8 糖苷鍵連接的Neu5Gc 還能充當信使參與信號傳導、細胞分化、黏附等過程中，在特異性抗原表面表達。糖基化的變化是腫瘤向惡性轉(zhuǎn)化的典型特征之一，異常糖基化有很多發(fā)生機制，如各種酶的表達、酶的活性改變以及細胞內(nèi)環(huán)境的平衡，任何情況出現(xiàn)變化都可能導致異常聚糖合成，這與自身免疫病和癌癥等病理條件相關［7］。人類缺少胞苷單磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶（cytidine monoph-ospho-N-acetyl?neu-raminic acid hydroxylase，CMAH），從而無法內(nèi)源性合成Neu5Gc，且有諸多研究表明Neu5Gc 在腫瘤細胞中特異性高表達，因此其存在具有特殊性。本文綜述Sia家族中的Neu5Gc引起炎癥反應和腫瘤進程中的變化情況及其相應生物學功能，為臨床上鑒別診斷腫瘤及其治療提供指導。

1 Neu5Gc的合成代謝及調(diào)控

1.1 Neu5Gc的合成代謝 哺乳動物能夠利用糖酵解產(chǎn)生Sia，這一途徑的失調(diào)與多種代謝疾病有關，如糖尿病、阿爾茨海默病、心腦血管疾病和癌癥等［8］。在真核細胞中 Neu5Ac 由 3 種酶在胞漿中催化產(chǎn)生，然后轉(zhuǎn)運到細胞核中，并活化成單磷酸胞苷-N-乙酰神經(jīng)氨酸（cytidinemonophospho-N-acetyl?neuraminic acid，CMP-Neu5Ac），再由 CMP-Neu5Ac羥化酶（CMAH）催化形成CMP-Neu5Gc 后經(jīng)特定的轉(zhuǎn)運蛋白泵入高爾基體中，在唾液酸轉(zhuǎn)移酶的作用下形成糖復合物后進入細胞表面或從細胞中分泌出來，具體合成途徑見圖 1［9］。由于 CMP-Neu5Ac 羥化酶活性在不同物種及不同組織中有所區(qū)別，所以Neu5Gc因種屬不同而含量各異，在正常人體內(nèi)的組織中很難檢測到Neu5Gc，因為人類在進化過程中，CMAH 基因缺失了一個外顯子，導致了開放閱讀框的不完整性，CMP-Neu5Ac 羥化酶因此失活，目前該酶是唯一已知能使Neu5Ac 經(jīng)生物合成Neu5Gc 的酶，所以人體不具有從Neu5Ac合成Neu5Gc的能力，體內(nèi)的Neu5Gc 是外源性的。通過與Neu5Gc 抗體（IgY）的免疫反應卻發(fā)現(xiàn)它在人脈管系統(tǒng)的內(nèi)皮細胞、胎盤、中空器官的上皮細胞以及癌細胞中均有表達，在人類腫瘤中聚糖形式的Neu5Gc 占1%～3%［10］。食用紅肉和其他哺乳動物制品將會攝入Neu5Gc，所以大多數(shù)研究者認為Neu5Gc 是食源性攝入后被吸收利用的，并猜想兩種潛在攝取途徑：①溶酶體將細胞攝取的糖脂或糖蛋白中的Neu5Gc釋放到細胞質(zhì)中再利用，用含Neu5Gc 糖復合物的培養(yǎng)基培養(yǎng)人類上皮細胞3 d后可檢測到，即驗證了這一猜想；②食物在腸道中分解代謝產(chǎn)物為中性前體N-羥乙酰甘露糖胺（ManNGc），它經(jīng)被動擴散進入細胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為Neu5Gc。這兩種途徑都能有效地繞過人類的酶缺陷，使外源的Neu5Gc 通過唾液酸化整合到人體細胞上。

圖1 Neu5Gc及其唾液苷在真核細胞中的生物合成Fig.1 Biosynthesis of Neu5Gc and its sialosides in eukary?otic cells

對比Neu5Gc 和Neu5Ac 結構發(fā)現(xiàn)，僅一個氧原子的區(qū)別，所以它們的代謝和重復利用途徑相似。BANDA等［11］在CMAH基因敲除小鼠模型（CMAH?/?）上進行了Neu5Gc 胃腸道代謝機制的研究，游離Neu5Gc 1~2 h 后即隨尿液排出，Neu5Gc 糖蛋白則可以進入小腸壁，代謝合并到多個外周組織的糖蛋白和糖脂中，如肝臟、腎臟和小腸壁上均能檢測到，最終證明Neu5Gc 可從食物吸收代謝入體，又基于內(nèi)源機制的缺陷，所以得出結論Neu5Gc 是飲食來源的。對健康人群的研究表明，食用Neu5Gc 后，游離的Neu5Gc 4~6 h 后就被吸收或排泄出體外，僅在唾液和面部毛發(fā)還有少量殘存，但結合態(tài)就不容易被排泄出去，會不斷地在人體中積累，而營養(yǎng)不良人群比健康人更容易在體內(nèi)蓄積Neu5Gc［12］。

1.2 Neu5Gc 相關調(diào)控機制 Neu5Gc 可能參與細胞凋亡和細胞信號轉(zhuǎn)導，例如GM3鞘糖脂的Fas-Fas配體（Fas-FasL）途徑，降解多種細胞內(nèi)蛋白并激活DNase 的作用，使 DNA 片段化斷裂，GM3 與膜配體的相互作用具有酶的活性及功能，能與生長因子受體結合，對PI3K/AKT 信號通路產(chǎn)生一定抑制作用［13］。在92 例非小細胞肺癌患者中 GM3（Neu5Gc）和表皮生長因子受體（epidermal growth factor recep?tor，EGFR）有63 例（68%）共同表達，與組織亞型無關［14］。雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GD3（disialoganglioside-3，GD3）能降低線粒體膜通透性和激活細胞凋亡［15］。淋巴細胞脂筏的形成與Neu5Gc 相關，在豬的淋巴細胞中Neu5Gc 參與刺激T 細胞激活和抗原遞呈細胞成熟，但是在人類淋巴細胞表面卻不表達Neu5Gc（表1）。

表1 Neu5Gc或其組成物質(zhì)參與的相關信號轉(zhuǎn)導途徑Tab.1 Relevant signal transduction pathways in which Neu5Gc or its constituent substances participate

對Neu5Gc 的合成催化酶CMAH 基因cDNA 序列一級結構預測，發(fā)現(xiàn)該酶不具有疏水區(qū)域，不存在起協(xié)助運輸作用的信號肽，從Hela 細胞系得到該酶的cDNA 發(fā)現(xiàn)人與鼠的cDNA 在基因組上有同源序列，只是人的cDNA 缺少一個92 bp 的片段而導致其失活，比較基因組分析顯示人類CMAH 失活模型為92 bp的外顯子和內(nèi)含子的融合。Neu5Gc的缺失在某種程度上促進了人類大腦的進化，許多其他組織中高表達CMAH/Neu5Gc 的動物，大腦中卻不表達CMAH/Neu5Gc，這表明Neu5Gc 的缺失在人屬出現(xiàn)之前，這有利于保護人類免于病原體的侵擾，只人類保持著與其他物種不同的進化差異即Neu5Gc和Neu5Ac 在各組織及其分泌的聚糖?蛋白質(zhì)復合物中的比例無法調(diào)節(jié)，不能利用豐富的Neu5Gc 作為可靠的自我信號。

2 Neu5Gc的相關免疫學效應

2.1 天然免疫及選擇 天然抗體主要由B1細胞分泌，NABS 主要防御傳染性病原體，并參與腫瘤細胞的消除過程，這對早期預防腫瘤惡化非常重要。在癌癥、炎癥、感染性患者甚至是健康人體內(nèi)能檢測到抗Neu5Gc的抗體（Abs），且小鼠的B1細胞也能夠分泌這種抗體［16］，它可以是 IgA、IgM 或IgG 型，占血清Abs 總數(shù)的0.1%~0.2%，在健康人血液中存在特異性抗GM3（Neu5Gc）抗體，這些抗體通過激活補體系統(tǒng)能夠殺傷表達GM3（Neu5Gc）的腫瘤細胞，血清中抗GM3（Neu5Gc）抗體水平隨年齡的增加而降低，這表明對神經(jīng)節(jié)苷脂的先天免疫在進化上已經(jīng)固定了，也提示其對于腫瘤的免疫監(jiān)測非常重要。

在人類生命進程中，一些疾病的發(fā)病風險升高除了與人類老化有關外，還可能是人類在進化過程中表觀遺傳學固有的變化［17］，CMAH 缺失的完全固定是病原體介導的免疫選擇的結果，如流感嗜血桿菌已經(jīng)適應了Neu5Ac 的優(yōu)先利用，從而避免了Neu5Gc在細菌的細胞表面表達，與之相似的還有霍亂弧菌，也通過適應Neu5Gc 在人類進化中的丟失機制而進化為人類特有的病原體［18-19］，這種適應性的選擇壓力可能代表人類對Neu5Gc 異種抗原抗體反應；另外平衡多態(tài)性甚至是表達多態(tài)性可能發(fā)揮更大作用，通過女性生殖道中的抗體檢測精子上的Neu5Gc抗原進行性別選擇，雄性CMAH等位基因攜帶Neu5Gc，哺乳動物在直接接觸精子時會產(chǎn)生抗精子抗體，這樣的精子會被雌性子宮內(nèi)的免疫細胞吞噬［20］；此外災變選擇也是一種不能忽略的進化機制，在病毒流行中，合成相應碳水化合物抗原的父母群體滅絕，后代攜帶偶然的突變，子代體內(nèi)的天然抗體與碳水化合物抗原結合消滅病毒，使這些子代免于滅絕，這個過程發(fā)生在古人類合成Neu5Gc抗原時，導致后代缺乏Neu5Gc 并產(chǎn)生相應抗體?，F(xiàn)在很少有人會因為意外突變而失去一種常見的碳水化合物抗原，并產(chǎn)生一種天然抗體來對抗這種抗原，這類抗體在流行高毒性病毒事件中防止哺乳動物物種滅絕至關重要［21］。

2.2 免疫應答及逃逸 許多病原體依靠對宿主唾液酸不同的結合、合成和/或利用方式來逃避宿主的免疫防御，人體腸道黏膜免疫系統(tǒng)對胃腸道共生菌群有一定識別機制，某些條件下，可將其提呈并刺激淋巴細胞產(chǎn)生免疫應答，微生物或病原體細胞表面表達唾液酸分子，將自己偽裝成自體成分，從而躲避或抑制宿主的免疫應答從而達到與人類共生的目的。人體中唾液酸生物合成酶對Neu5Ac 和Neu5Gc 一視同仁，但體液免疫系統(tǒng)卻能將其區(qū)分，Neu5Gc可以說是一種獨特的抗原，進入人體后它被當作外來抗原結合在宿主細胞表面［22］，細胞生化機制識別其為“自我”，免疫系統(tǒng)識別為“非自我”，所以將其稱為“異種自身抗原”，所以人體內(nèi)Neu5Gc特異性免疫球蛋白（Ig）水平上下波動。Sia 對細胞排斥和黏附的影響已經(jīng)被廣泛研究，細胞反應性的改變和Sia 配體與互補受體唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素家族（Siglecs）的結合有關，由于人類CMAH 基因的缺失引起的Neu5Gc/Neu5Ac 比值的變化則影響其結合能力的強弱，CD33相關的Siglecs能與Sia 選擇性結合，Neu5Gc 的缺失有可能會讓它們與Neu5Ac 結合；Siglec-9 表達在人的中性粒細胞和巨噬細胞上，與組織上特定的多元配體結合［23］；Siglec-7 在 β 細胞上表達，人類 Siglec-7 的表達既可以抑制免疫激活又可以保持β 細胞功能使細胞存活，是一種新型治療策略［24］?？傊钄嗥渑cSiglecs的相互作用，還需要更多了解特定的Siglec 結合結構、表達的內(nèi)容、位置和時間等相關特性。Neu5Gc在人類免疫系統(tǒng)中的表現(xiàn)可定義為促炎分子［25］，免疫調(diào)節(jié)失調(diào)可導致機體長期處于炎癥狀態(tài)，傷口轉(zhuǎn)化為無法愈合的慢性潰瘍［26］，人體產(chǎn)生的Neu5Gc特異性抗體能夠識別以唾液酸化糖蛋白或GM3 形式整合到細胞表面的Neu5Gc 結構并產(chǎn)生免疫應答反應最終生成慢性炎癥，稱為異種唾液酸炎（xeno?sialitis），所以人類細胞的所有糖基化在接觸到其他動物血清后均可能被Neu5Gc 污染，會導致快速清除機制或觸發(fā)抗體介導的炎癥反應。用從人血清中獲得的抗Neu5Gc 抗體培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞后經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)顯示，大多數(shù)差異表達基因由預先存在的或抗人T 細胞球蛋白誘導的抗Neu5Gc 抗體共同激活，但不引起血管炎癥變化［27］。構建的CMAH基因缺陷小鼠模型，有許多類人的特征表型，研究其內(nèi)在病理生理后果，可以很好地闡明人體內(nèi)相關的異常機制[28］。免疫應答假說認為GM3（Neu5Gc）在抑制腫瘤免疫應答中起著決定性作用，GM3（Neu5Gc）具有降低人和小鼠T 淋巴細胞CD4 表達的能力，特別是非活化T 細胞，從細胞中去除GM3后，CD4 的表達即完全恢復，GM3（Neu5Gc）還可能影響小鼠樹突狀細胞（DCs）的分化以及脂多糖對DCs成熟的刺激作用。此外，許多致命性致病菌，如人流感病毒、傷寒沙門菌和惡性瘧原蟲，更偏向與Neu5Ac 結合而不是 Neu5Gc，如惡性瘧原蟲（Pf）與賴氏瘧原蟲（Pr）非常相似，但物種易感性卻很大不同，黑猩猩對Pr 易感，對Pf 不易感，人類則正好相反，這說明人類和黑猩猩的差異進化及瘧疾易感性也與Neu5Gc缺失有關［21］。

3 Neu5Gc與癌癥

Neu5Gc 在非人類Sia 中是獨一無二的，在人類癌癥免疫中具有重要作用，盡管由于CMAH 的功能喪失，人類不能合成Neu5Gc，但其仍可蓄積到由人細胞表達的聚糖中，含Neu5Gc 的糖蛋白可被培養(yǎng)的上皮細胞吸收，食物中的Neu5Gc 尤其是紅肉和加工的肉制品的攝入被認為具有致癌和影響癌癥變化的潛在風險，最近提出的一個假設是基于Neu5Gc和遺傳毒性化合物的聯(lián)合作用，影響腫瘤的發(fā)生進程［29］，而抗 Neu5Gc 抗體同樣可以刺激或抑制癌癥進展。絕大多數(shù)（幾乎100%）的人類具有與pAECs 結合的抗 Neu5Gc IgM 和 IgG 抗體，大約 50%的人具有與 pRBC 結合的抗 Neu5Gc 抗體［30］，人類對Neu5Gc的抗原性并不是來自母系，而是由出生后食用含Neu5Gc 的牛奶后，由細胞表面常見的共生細菌所呈現(xiàn)出來的，這種通過抗體和補體介導的異種自身抗原誘導免疫應答后引起慢性炎癥，增加了CMAH?/?小鼠形成癌癥的風險［31］。體外實驗顯示，從飲食中加入Neu5Gc，最終能在一些上皮細胞和內(nèi)皮細胞表面上呈現(xiàn)［32］，而在包括肺癌、肝癌、結腸癌、腎癌、乳腺癌、皮膚癌、卵巢癌、喉癌和惡性淋巴瘤等多種癌癥病理學中，Neu5Gc已被報告為潛在抗原（圖2）。

圖2 Neu5Gc的攝入、積累和炎癥的產(chǎn)生及對癌癥的作用Fig.2 Absorption and accumulation of Neu5Gc，with generation of inflammation and their effects on cancer

在癌癥進展期間腫瘤細胞常常能夠產(chǎn)生免疫逃逸機制，主要通過表達低免疫原性抗原、抑制免疫細胞活化或者誘導免疫抑制微環(huán)境等方式，這些途徑中的一些關鍵步驟可以為癌癥靶向免疫治療提供切入點。與免疫監(jiān)視功能不同，免疫系統(tǒng)的炎癥作用激活后反而會促進癌癥進展，炎癥還可以通過活性氧引起DNA 損傷，這是腫瘤發(fā)生過程中的致癌促進劑，由感染性和非感染性疾病引起的慢性炎癥對于腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一種重要病因，炎癥不僅在癌變過程中起促進作用，在免疫監(jiān)視下生長的腫瘤反過來也會引起炎癥，尤其是髓系細胞，如中性粒細胞和單核/巨噬細胞會促進癌癥的浸潤過程，因此，當免疫系統(tǒng)進行大量的免疫監(jiān)視以消除腫瘤細胞時，炎癥途徑卻被腫瘤細胞用來促進癌癥的進展。腫瘤細胞表面異常糖基化是一種常見的癌癥特征，其利用某些結構的損失或增益來實現(xiàn)糖基化重大改變，如截短結構的存在、前驅(qū)體的積累和新結構的合成，典型表現(xiàn)就是增加細胞表面的唾液酸，這不僅增加了總唾液酸含量，其修飾作用也有明顯變化，與此同時Neu5Gc 在相應腫瘤組織中也高表達，Neu5Gc 能優(yōu)先積累在惡性組織中，在缺氧的條件下，給 CMAH?/?小鼠飲用含 Neu5Gc 的水，與野生型相比基因缺失小鼠對Neu5Gc 的攝入明顯升高。綜上所述，腫瘤微環(huán)境越來越具有免疫抑制作用，導致腫瘤細胞存活和轉(zhuǎn)移，腫瘤細胞糖基化通過“自我”樣的方式誘導產(chǎn)生耐受性免疫細胞表型屏蔽效應細胞，促進免疫逃逸，最終導致腫瘤進展［33］。

4 應用前景

4.1 腫瘤的免疫診斷 腫瘤的早期診斷是降低癌癥死亡率的關鍵，而無創(chuàng)分析或微創(chuàng)分析則是臨床診斷最期望達到的理想狀態(tài)，依賴于尿液或血清中腫瘤標志物水平變化來診斷是目前學者積極探索的方向［34］。由于假陰性或者假陽性較高，傳統(tǒng)癌癥生物標記物不能用于癌癥的診斷，所以人們不斷探索新的可靠的體液中可檢測到的其他癌癥生物標記物包括糖蛋白和抗異常聚糖抗體檢測，抗異常聚糖抗體是一種保護性糖蛋白，對體內(nèi)的外源性抗原具有高度的親和力和特異性，最終導致抗原的消除［35-40］。異常唾液酸化主要表現(xiàn)為腫瘤抗原的增加，在健康組織中唾液酸的O-縮醛化可能影響其唾液酸化，在小鼠模型中的異種唾液酸炎在癌癥發(fā)展中具有潛在危險，由于這種外源唾液酸的來源是飲食，所以避免含Neu5Gc 的食物攝入可能降低癌癥風險，富含Neu5Gc 的紅肉增加了炎癥誘導癌癥的風險，而Neu5Gc 消耗的減少也可能是干擾癌癥進展的因素。Neu5Gc經(jīng)代謝吸收進入人體內(nèi)，被當作抗原來識別，產(chǎn)生Neu5Gc的抗體，當含有Neu5Gc的多糖遇到體液循環(huán)中的抗Neu5Gc 抗體時，就會觸發(fā)炎癥反應，從而促進腫瘤的生長［41］。有研究顯示，在癌癥患者中，產(chǎn)生H-D 抗體的患者發(fā)病率增加，隨著唾液酸成分及其不同功能的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)有一類含有Neu5Gc 末端結構的物質(zhì)是人類某些腫瘤疾病中的一種特異性標志物，主要提示H-D抗原存在，含Neu5Gc 的糖基化合物作為人類的一種異體抗原，是一種癌胚抗原，也有稱為Forssman抗原或H-D抗原，因此可考慮將循環(huán)抗Neu5Gc抗體作為一種腫瘤標志物來監(jiān)測癌癥患者血清變化情況。與健康組織中的細胞相比，腫瘤細胞表面上唾液酸的含量顯著增加，唾液酸化的上調(diào)可能是因為攝入的Neu5Gc 優(yōu)先在癌癥組織中積聚。在胎兒、胎糞和某些實體腫瘤中均可檢測到此抗原，唾液酸聚糖微陣列顯示Neu5Gc 的抗體顯著上調(diào)，這表明這種抗體可能起特定的腫瘤生物標志物的作用，如果該表位確實是相對癌癥特異性的抗原，它可以用作治療的靶點或用于藥物遞送的治療工具。包括GM3 在內(nèi)的含Neu5Gc 的神經(jīng)節(jié)苷脂，最初被描述為 H-D 抗體的表位，GM3（Neu5Gc）是腫瘤聯(lián)合抗原，單克隆抗體能夠結合多種惡性組織，包括皮膚癌、神經(jīng)外胚層腫瘤、泌尿生殖系統(tǒng)癌癥、非小細胞肺癌和胃腸道腫瘤等，但目前還沒有嘗試控制患者飲食攝入Neu5Gc的試驗。通過分析抗Neu5Gc抗體對不同Neu5Gc 聚糖表位的特異性，將70 多個化學酶法合成的Neu5Gc和Neu5Ac聚糖微陣列用以分析乳腺癌患者該抗體的結合特性，確定Neu5Gc 修飾的哪一種聚糖結構能夠被識別。此外還利用含有20 個Neu5Gc 聚糖的靶標芯片，進一步分析了血清中抗體的結合特性，并在更多的樣本中進行了驗證，篩選出其中4 種糖基聚糖作為能區(qū)分正常人和前列腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、結腸癌、肺癌等各種癌癥患者的潛在標志物，血清中各種類型的總抗Neu5Gc抗體與癌癥風險呈正相關，這些發(fā)現(xiàn)也提示抗Neu5Gc 抗體作為腫瘤標志物的可能性，其中最顯著的一個癌癥相關表位是Neu5Gc 替代了Neu5Ac［42］?？?Neu5Gc 抗體的分析可以用天然的Neu5Gc 進行，將聚糖與聚丙烯酰胺等聚合物偶聯(lián)，并采用ELISA 方法檢測抗體含量，這種便宜簡單的方法可作為篩查工具用于監(jiān)測疾病進展或治療反應，而對Neu5Gc 抗體水平與腫瘤風險和進展的相關性通過數(shù)據(jù)庫分析也是十分必要的。近年來，有諸多學者對Neu5Gc 及其抗體的定量檢測不斷付諸多種實踐，在Neu5Gc 和Neu5Ac 電子結構參數(shù)和反應活性的研究中有效的區(qū)分僅有一個氧原子之差的這兩種唾液酸結構［43］。NAGAI 等［44］利用親水相互作用色譜-柱后衍生-熒光檢測法測定血樣中的唾液酸，MARTINS 等［45］利用高效液相色譜（HPLC）對Neu5Ac和Neu5Gc進行了分離、鑒定和定量，并系統(tǒng)地描述了優(yōu)化后的HPLC 方法，將分布在肺膜上的唾液酸進行鑒別、分離和定量。還有學者建立了一種基于超分子質(zhì)譜（MS）的方法對Neu5Gc 進行鑒定和定量，這是一種可靠的無衍生的Neu5Gc 分析方法，識別出Neu5Gc 和Neu5Ac 之間細微的結構差異［46］。此外還有人開發(fā)了糖隊列，基于同位素標記然后通過反相高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜分析（RPHPLC-MS）用于特定同分異構體的結構識別和唾液酸聚糖的定量，而將特異性唾液酸鏈全甲基化用于MALDI-TOF MS 方法，分析蛋白質(zhì)糖基化作用中SSAP衍生化，同時與MALDI-TOF MS聯(lián)用在糖組學分析中顯示出獨特的優(yōu)勢，并在治療蛋白的糖基化圖譜和臨床糖鏈生物標志物的發(fā)現(xiàn)方面顯示出一定 的潛 力［47-50］。 GONG 等［51］研制 了 一 種 用 于Neu5Gc可視化檢測的納米顆粒免疫層析試劑盒，利用Neu5Gc 和互補DNA 之間結合，與DNA 適配體進行競爭性反應，反應快速、靈敏，在Neu5Gc 相關癌癥診斷方面具有巨大的潛力。除了對Neu5Gc 本身的檢測和定量，各方學者還對抗Neu5Gc 抗體在異種排斥過程中的作用及如何利用Neu5Gc 結構復雜性來設計新的診斷方式以檢測抗Neu5Gc 抗體展開研究［52］。CHENG 等［53］開發(fā)并合成了 3 種唾液酸形式的9-疊氮基類似物，可以在哺乳動物的細胞表面糖基中代謝，產(chǎn)生可識別含有Neu5Gc 的唾液聚糖抗體，表明唾液酸類似物可用于免疫學研究。使用聚糖微陣列來分別研究靜脈注射的免疫球蛋白（IVIG）或混合的人類IgA 中的抗Neu5Gc IgGs 和IgAs，與 Neu5Gc-聚糖結合/Neu5Ac-聚糖結合的微陣列結合模式，不同的IVIG 制劑具有高度特異性的抗Neu5Gc IgG 反應，這種不同的抗Neu5Gc IgG/IgA序列在個體中可能對人類疾病有不同影響［54-55］。

4.2 腫瘤的免疫治療 近年來在癌癥治療中免疫療法展現(xiàn)了一定優(yōu)勢，其基本原理為誘導或擴大宿主對癌細胞的免疫反應，從而區(qū)分癌癥和正常細胞之間的細微差別，目前主要有3種常見的免疫療法：靶向細胞療法、免疫檢查點阻斷（如針對PD-1 或PD-L1 的單克隆抗體進行阻斷）和具有治療性的癌癥疫苗，疫苗可刺激腫瘤特異性T 細胞和腫瘤相關抗原抗體產(chǎn)生適應性免疫應答，目前瓶頸在于目標抗原的識別非常困難，所以獲得成功的腫瘤疫苗寥寥無幾［56-63］。

碳水化合物免疫原性較差，但其作為治療靶點有巨大潛力，糖鏈廣泛存在于細胞表面，被抗體和免疫受體識別、保護或清除。與正常細胞相比，癌細胞表現(xiàn)出異常的糖基化模式，而腫瘤相關糖抗原可以通過直接凋亡、Fc-陽性效應細胞或互補作用等方式對腫瘤細胞進行殺傷［64-65］，腫瘤相關的糖基化變化產(chǎn)生碳水化合物新抗原，是免疫治療的理想候選靶點，而Sia 作為覆蓋在細胞表面的多糖，經(jīng)常改變癌細胞上與癌癥進展和/或轉(zhuǎn)移相關的表達，特別是Neu5Gc，這種抗原在人類癌癥上積累，產(chǎn)生了一系列癌癥新抗原［66-67］。基于靶向抗原的低抗原性、腫瘤異質(zhì)性和某些癌癥中只有少數(shù)新抗原的低突變負擔等限制，科學家希望尋找疫苗的其他潛在抗原，設計出一種有活性的癌癥疫苗。采用高通量唾液酸多糖微陣列的方法監(jiān)測疫苗效力，結果顯示免疫反應動力學和疫苗質(zhì)量是直接影響疫苗療效的主要因素［68-70］。此外還有研究者開發(fā)利用以GM3（Neu5Gc）為靶點的疫苗，其主要機制是造成細胞質(zhì)膜較大損傷，使其膜完整性喪失，胞內(nèi)容物釋放，促進提呈細胞對某些免疫原分子的識別、活化，在腫瘤部位引起炎癥反應，激活和增殖T淋巴細胞，這個機制不依賴能量，不需要蛋白質(zhì)重新合成，不受代謝抑制劑的影響［71］。此外，還有研究者通過技術手段得到一種特定的人源化GM3（Neu5Gc）神經(jīng)節(jié)苷脂抗體14F7hT，驗證其對幾個不同器官腫瘤組織的識別能力和潛在的抗腫瘤效應，同樣證明GM3（Neu5Gc）可作為腫瘤免疫治療的靶點，而14F7hT也有望成為一種新型抗癌藥物［72］。

5 總結與展望

蛋白質(zhì)糖基化的改變對疾病的所有階段都有決定性的影響，在惡性轉(zhuǎn)化過程中，糖基化作用與健康組織相比發(fā)生了嚴重改變。惡性組織中，唾液酸化聚糖在細胞表面上調(diào)尤其是Neu5Gc 的增加，是異常糖基化的一個關鍵變化，表明這些抗體可能作為特定的腫瘤生物標志物發(fā)揮作用，如果這種表位確實是一種相對于癌癥的特異性抗原，它有望成為靶點和藥物傳遞的治療工具。在功能上，癌癥相關的高唾液酸修飾直接影響腫瘤細胞與微環(huán)境的相互作用，人體中Neu5Gc 是通過食物來源（特別是紅肉）代謝進入組織的，自嬰兒期接觸含有Neu5Gc的奶制品導致產(chǎn)生抗Neu5Gc 抗體開始，這一過程持續(xù)存在于所有正常個體中，抗原抗體的免疫反應會產(chǎn)生慢性炎癥，進而誘導癌癥的發(fā)生和發(fā)展。這種錯綜復雜的相互作用為激活Neu5Gc 相關的致癌途徑提供了分子基礎，也提供了相關糖基化表位的重要來源，癌癥特異性的蛋白糖基化改變所創(chuàng)造的特征分子可能被用來靶向腫瘤細胞，或者在腫瘤部位分泌或脫落到體液中然后作為非侵入性生物標志物。聚糖在不同的組織中具有多種作用，含有Neu5Gc的聚糖也可能是治療的靶點，抗聚糖抗體的水平與疾病預后、生存率和監(jiān)測疾病復發(fā)相關［73］，那么抗Neu5Gc 抗體和/或Neu5Gc 組織負荷能否預測癌癥的產(chǎn)生風險，降低Neu5Gc 負荷能否降低患癌風險，由紅肉的攝入、異種唾液酸炎的產(chǎn)生和癌癥風險之間的聯(lián)系可知，減少Neu5Gc 的攝取或抑制其合成相關聚糖能夠減少異種唾液酸炎的發(fā)生以及加強對癌癥的預防，考慮到對人類疾病預防和治療的潛在影響，Neu5Gc及其相互作用需要進一步的實驗和轉(zhuǎn)化研究。許多關于人類Sia 生物學的問題仍然沒有得到探索或報道，希望這些研究能夠進一步突出唾液酸的重要性并促進治療學的進一步研究，因此糖生物學領域應繼續(xù)朝著糖基化在癌癥生物學、疾病的進展過程中的分子機制及其發(fā)揮的相關功能方面進行深入研究。