甘露糖化殼聚糖納米粒靶向巨噬細(xì)胞的應(yīng)用研究進(jìn)展①

嚴(yán)麗麗 謝 勇 閔衛(wèi)平③ （南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南昌330006）

巨噬細(xì)胞源自單核細(xì)胞，存在于各種組織中，與全身的疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)，在體內(nèi)發(fā)揮先天性免疫和細(xì)胞免疫作用。由于其表型和功能具有多樣性特點(diǎn)，靶向巨噬細(xì)胞并調(diào)控其功能已成為治療疾病的重要方法［1-2］。其中通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞相關(guān)受體，由受體介導(dǎo)的靶向系統(tǒng)治療相關(guān)疾病已成為研究熱點(diǎn)［3-4］。殼聚糖（chitosan，CS）作為非病毒載體具有良好的生物相容性和安全性，且負(fù)載效率高，可作為優(yōu)良載體的首選材料［5］。對(duì)CS 進(jìn)行配體修飾，枝接甘露糖，可得到由巨噬細(xì)胞表面高表達(dá)的甘露糖受體（mannose receptor，MR）介導(dǎo)的主動(dòng)靶向巨噬細(xì)胞的基因和藥物遞送系統(tǒng)。近年來，新型藥物的出現(xiàn)及外來基因編輯對(duì)許多復(fù)雜性疾病具有巨大的治療潛力，甘露糖化殼聚糖納米載體經(jīng)靶向遞送將攜帶的基因或藥物遞送至目標(biāo)部位，能夠達(dá)到更加安全高效的治療效果［6］。

1 甘露糖化殼聚糖納米粒的特性

納米材料具有生物相容性好和靶向性特點(diǎn)，可通過與生物大分子（多肽、糖類、葉酸等）間的特異性相互作用提高靶向性能，因此被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究和靶向遞送［7］。其中殼聚糖納米粒作為負(fù)載藥物和基因的優(yōu)良載體，成為近年來生物材料的研究熱點(diǎn)，并在醫(yī)藥、生化和生物醫(yī)學(xué)工程等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用［8］。

CS又稱脫乙酰甲殼素，化學(xué)名稱為聚葡萄糖胺（1-4）-2-氨基-B-D 葡萄糖，相其對(duì)分子質(zhì)量從數(shù)十萬(wàn)到數(shù)百萬(wàn)［9］。由于CS 是自然界唯一的聚陽(yáng)離子堿性多糖，具有低毒性、生物相容性、結(jié)構(gòu)易修飾等特點(diǎn)，可作為良好的生物納米材料。但CS作為載體缺乏細(xì)胞特異性和主動(dòng)靶向性，不能發(fā)揮特異性靶向作用。在生物大分子納米材料中，甘露糖基納米材料在靶向治療方面取得了很大進(jìn)展，并為免疫調(diào)節(jié)治療提供了有效靶點(diǎn)［10］。MR 屬于多凝集素受體，可通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答，對(duì)于有效治療各種疾病至關(guān)重要［11-12］。MR 作為該家族的原型，已成為配體靶向的模型受體，通過與優(yōu)良載體結(jié)合，負(fù)載基因、藥物和疫苗等方法被廣泛研究［13-14］。因此，對(duì)CS 進(jìn)行配體修飾，得到甘露糖化殼聚糖納米粒（manno?sylated chitosan nanoparticles，MCS-NPs），通過巨噬細(xì)胞表面高表達(dá)的MR 介導(dǎo)的主動(dòng)靶向作用，可作為安全高效、特異性靶向的優(yōu)良載體。

靶部位、目的基因或藥物、轉(zhuǎn)運(yùn)載體三者的特異性結(jié)合是靶向遞送系統(tǒng)治療疾病的關(guān)鍵。由于納米粒子的表面效應(yīng)和小尺寸效應(yīng)，對(duì)藥物具有可控性釋放作用以及能夠保護(hù)基因免受核酸酶的降解，已用于多種疾病尤其是癌癥方面的治療［15-16］。因此，利用納米載體與配體結(jié)合制備的MCS-NPs，不僅生物相容性及穩(wěn)定性良好，毒性低，并且能夠使藥物或基因特異性靶向，增加靶部位的攝取量，從而提高藥物的生物利用度和基因的轉(zhuǎn)染效率，達(dá)到更加安全高效的治療效果。

2 MCS-NPs的制備方法

目前制備殼聚糖納米粒的主要方法有復(fù)凝聚法、聚電解質(zhì)絡(luò)合法、離子凝膠法、微乳液法、共價(jià)交聯(lián)法、溶劑蒸發(fā)法、共沉淀法等［17］。CS 及其衍生物經(jīng)修飾后制備納米粒的方法與殼聚糖納米粒相似，其中復(fù)凝聚法和離子凝膠法是制備CS及其衍生物最常用的兩種方法。STIE 等［18］用離子凝膠法制備了180~280 nm 的殼聚糖納米粒，裝載BSA 和p53至人皮膚黑色素瘤細(xì)胞。研究表明，利用離子凝膠法制備的納米粒能夠有效促進(jìn)細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的攝取，該方法制備的藥物或基因遞送系統(tǒng)在體內(nèi)外的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中具有重要價(jià)值。YAO 等［19］利用復(fù)凝聚法制備了甘露糖化殼聚糖（MCS）包裹胃泌素釋放肽（pGRP）質(zhì)粒，形成了約為210 nm 的MCS-pGRP-NPs，以抗原提呈細(xì)胞為靶點(diǎn)，經(jīng)小鼠鼻腔黏膜給藥，通過納米載體提高疫苗接種效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MCS-NPs 是一種高效的靶向基因傳遞載體，MCS-pGRP-NPs 能夠與巨噬細(xì)胞上的C 型凝集素受體結(jié)合，通過MR 介導(dǎo)的內(nèi)吞作用增強(qiáng)細(xì)胞攝取，對(duì)抗腫瘤免疫治療具有潛在應(yīng)用前景。納米粒子的大小、穩(wěn)定性及毒性等都與制備工藝有關(guān)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，選擇合適的制備方法，達(dá)到研究目的。

3 殼聚糖納米載體負(fù)載基因和藥物的作用機(jī)制

CS是天然存在的陽(yáng)離子聚合物，其結(jié)構(gòu)中的游離氨基使其帶有正電荷，生物黏膜表面的類脂層荷負(fù)電，易與CS 中的陽(yáng)離子發(fā)生靜電吸附，增強(qiáng)被負(fù)載基因和大分子藥物透過黏膜吸收的能力［20］。殼聚糖納米粒子在酸性溶液中帶正電荷，能夠與帶有負(fù)電荷的DNA 通過電荷間的相互吸引迅速渦旋混合形成納米級(jí)復(fù)合物。因其靜電吸引通過空間位阻效應(yīng)，使得DNA 免受核酸酶的降解，并且形成的納米級(jí)復(fù)合物有利于細(xì)胞對(duì)基因的攝取，延長(zhǎng)了藥物在體內(nèi)的滯留時(shí)間，減少胃腸道對(duì)藥物的降解，提高藥物的生物利用度，使得納米遞送系統(tǒng)在疾病治療中發(fā)揮重要作用［21-22］。

因此通過對(duì)CS進(jìn)行配體修飾得到MCS-NPs，由甘露糖受體介導(dǎo)攜帶藥物和基因特異靶向巨噬細(xì)胞的遞送系統(tǒng)，能夠發(fā)揮更高效的治療作用［23-24］。

4 MCS-NPs在疾病中的治療作用

4.1 MCS-NPs 藥物遞送系統(tǒng)在疾病中的治療作用 納米載體藥物遞送系統(tǒng)由于其優(yōu)良的性能，在疾病治療應(yīng)用方面日益擴(kuò)大，在治療腫瘤相關(guān)疾病方面尤為突出［25］。經(jīng)配體修飾后的納米載體，不僅能夠促進(jìn)藥物吸收，改善藥物在體內(nèi)的分布，還能高效靶向目標(biāo)部位，從而提高藥物的生物利用度，達(dá)到更好的治療效果［26-27］。

圖1 MCS-NPs負(fù)載基因或藥物系統(tǒng)靶向巨噬細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of MCS-NPs gene/drug delivery system targeting macrophages

ESFANDIARI 等［28］及 AFZAL 等［29］研究 了 口服巴龍霉素（PM）對(duì)內(nèi)臟利什曼病的治療效果。由于PM 的口服吸收率低，半衰期短，藥物效價(jià)低，因此，ESFANDIARI 等［28］合成了MCS，包裹PM，與右旋糖苷制備成MCS-dex-PM-NPs。實(shí)驗(yàn)表明該納米傳遞系統(tǒng)對(duì)巨噬細(xì)胞具有高效靶向性，低細(xì)胞毒性，對(duì)利什曼原蟲感染具有良好的治療效果。AFZAL等［29］利用甘露糖-硫醇化殼聚糖（MTC）與聚乙酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）包裹PM 制備MTC-PLGA-PMNPs，與游離的 PM 相比，MTC-PLGA-PM-NPs 在利什曼原蟲感染的巨噬細(xì)胞模型中，巨噬細(xì)胞對(duì)其攝取能力和殺蟲能力增強(qiáng)。體內(nèi)研究顯示MTC-PLGAPM-NPs 治療后杜氏利什曼原蟲感染的BALB/c 小鼠模型中的寄生蟲的數(shù)量大大降低。CHAUBEY等［30］合成了 MCS，包裹姜黃素，制備成 Cur-MCNNPs，研究其對(duì)利什曼原蟲的療效和毒性評(píng)價(jià)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與殼聚糖納米粒包裹的姜黃素及直接作用的姜黃素相比，Cur-MCN-NPs 對(duì)治療利什曼病具有更顯著的效果。

XU等［31］將MCS包裹牛血清白蛋白（BSA），并利用聚丙烯酸樹脂腸溶包衣制備成BSA-MCS-Edu-NPs。研究表明，該納米粒在胃腸液中具有良好的穩(wěn)定性，被負(fù)載的BSA 主要通過M 細(xì)胞促進(jìn)其在PP結(jié)中的積累量以及提高對(duì)抗原提呈細(xì)胞的靶向能力，從而誘導(dǎo)較強(qiáng)的系統(tǒng)性免疫應(yīng)答，為口服疫苗的接種提供新的思路。黃燕等［32］研究了甘露糖化羧甲基殼聚糖包裹依替膦酸形成納米粒子靶向M2型巨噬細(xì)胞治療惡性腫瘤。結(jié)果顯示，甘露糖化羧甲基殼聚糖與依替膦酸復(fù)合物對(duì)M2 型巨噬細(xì)胞具有靶向能力，MCS-NPs 靶向巨噬細(xì)胞作為治療腫瘤的研究靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。

細(xì)菌感染仍然是死亡的主要原因之一，細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)對(duì)人類健康構(gòu)成了巨大的威脅。COYA等［33］利用甘露糖修飾的三甲基殼聚糖納米粒（MTCNPs）研究巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌感染的反應(yīng)，應(yīng)用新的納米治療策略提高療效。作者使用結(jié)核分枝桿菌作為細(xì)菌感染的模型，研究MCS 納米載體對(duì)人體巨噬細(xì)胞反應(yīng)的影響機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，MTC-NPs 在很大程度上改變了結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞的反應(yīng)，通過mRNA 測(cè)序顯示，由于MTC-NPs 的攝入，近900個(gè)基因出現(xiàn)差異表達(dá)。進(jìn)一步結(jié)果分析顯示，這組被調(diào)控的基因參與細(xì)胞代謝，尤其是氧化磷酸化和糖代謝途徑。因此，將具有調(diào)節(jié)代謝的納米顆粒與藥物相結(jié)合，是治療該類疾病的一種有效策略。

殼聚糖及其衍生物本身作為一種藥物輔料具有較理想的安全性能，使得CS和納米粒子作為藥物載體的研究在多領(lǐng)域迅速發(fā)展［34］。隨著MCS-NPs載體的優(yōu)良特性逐漸展現(xiàn)，在治療各種疾病中起到了良好的應(yīng)用。

4.2 MCS-NPs 基因遞送系統(tǒng)在疾病中的治療作用 基因治療是指將外源基因?qū)氚屑?xì)胞，通過基因表達(dá)來治療或預(yù)防疾病的潛在方法［35］。制備安全有效的基因載體是基因治療的關(guān)鍵，MCS 作為可降解、低細(xì)胞毒性的非病毒基因載體，在基因治療中發(fā)揮重要作用［36］。

ASTHANA 等［37］將 MCS 包 裹 反 義 寡 核 苷 酸（AON）制備成納米粒靶向遞送至巨噬細(xì)胞，考察其納米粒復(fù)合物的特性，以及AON 體外轉(zhuǎn)染至巨噬細(xì)胞的效率。研究發(fā)現(xiàn)，MCS 作為巨噬細(xì)胞的靶向載體，具備基因遞送系統(tǒng)的理化性質(zhì)，MCS-NPs 是一種安全有效的基因載體，對(duì)RAW264.7 細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性，并且具有較高的基因轉(zhuǎn)染效率。YAO等［19］利用 MCS 裝載 pGRP 質(zhì)粒制備成納米粒，研究其對(duì)巨噬細(xì)胞的靶向能力和轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，MCS 能夠保護(hù)pGRP 不被核酸酶降解，與CS 相比，MCS 通過MR 介導(dǎo)的內(nèi)吞作用能夠提高轉(zhuǎn)染效率。因此，以巨噬細(xì)胞MR 為靶點(diǎn)的MCS 納米載體具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

HE 等［38］利用雙靶向納米載體遞送寡核苷酸（ODN）至巨噬細(xì)胞克服腫瘤相關(guān)免疫抑制。由于甘露糖受體和CD44 受體在巨噬細(xì)胞表面高表達(dá)，作者制備了雙靶向甘露糖化羧甲基殼聚糖-透明質(zhì)酸-硫酸魚精蛋白/寡核苷酸納米粒（MCMC/HA/PS/ODN/NPs），與單靶向的 HA/PS/ODN/NPs、MCMC/PS/ODN/NPs 及非靶向的 CMC/PS/ODN/NPs 相比，在靶向性評(píng)價(jià)、細(xì)胞毒性、腫瘤抑制等方面，雙靶向MCMC/HA/PS/ODN/NPs 可實(shí)現(xiàn)巨噬細(xì)胞的高效靶向，低毒性，并能顯著增強(qiáng)免疫刺激。因此，雙靶向載體負(fù)載的CpG-ODN 在腫瘤治療中具有良好的應(yīng)用前景。DENG 等［39］通過納米載體將 miR-146b遞送到腸道巨噬細(xì)胞治療潰瘍性結(jié)腸炎。作者通過甘露糖修飾三甲基殼聚糖包裹miR-146b，制備成MTC-miR-146b-NPs，研究了miR-146b 在小鼠結(jié)腸炎模型黏膜修復(fù)過程中的表達(dá)水平、DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中對(duì)小鼠黏膜的再生情況及miR-146b?/?小鼠CAC的抑制作用。結(jié)果顯示，MTC-miR-146b-NPs具有高的包封效率和延時(shí)作用，可選擇性地靶向腸道巨噬細(xì)胞而無細(xì)胞毒性，可作為腸道疾病研究的有效載體。MTC-miR-146b-NPs 可作為口服給藥的有效候選藥物，提高潰瘍性結(jié)腸炎和結(jié)腸炎相關(guān)癌癥的免疫治療效果。

基因治療的有效性在很大程度上取決于基因遞送系統(tǒng)的優(yōu)良特性：靶向性強(qiáng)、細(xì)胞毒性低、基因免受核酸酶降解、基因轉(zhuǎn)染效率高等特點(diǎn)?；贑S及其衍生物，經(jīng)配體修飾后由受體介導(dǎo)的靶向載體具有很大的治療潛力，近年逐漸成為疾病治療的熱點(diǎn)研究方向。

5 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，CS 作為非病毒載體，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，形成受體介導(dǎo)的靶向遞送系統(tǒng)，已經(jīng)被廣泛嘗試應(yīng)用于基因和藥物遞送。MCS-NPs 安全高效，提高了藥物的利用度和基因轉(zhuǎn)染效率，在疾病治療中發(fā)揮重要作用。但配體枝接CS 主動(dòng)靶向系統(tǒng)也存在一些局限性，例如工藝過程中目的產(chǎn)物產(chǎn)率，納米復(fù)合物的穩(wěn)定性，如何精確控制納米粒徑，對(duì)工藝參數(shù)的優(yōu)化和從實(shí)驗(yàn)室到中試工廠再到生產(chǎn)水平的規(guī)?；葐栴}還有待進(jìn)一步研究?，F(xiàn)有的研究大多局限于細(xì)胞和動(dòng)物水平的研究，仍需要進(jìn)行更多臨床試驗(yàn)相關(guān)的體內(nèi)外研究。然而，經(jīng)配體修飾的主動(dòng)特異性靶向遞送系統(tǒng)已在疾病治療中顯示出了良好的性能，具有潛在的應(yīng)用前景和臨床價(jià)值。