深低溫冰凍保存血小板的研究進(jìn)展

張翡艷

摘要：血小板作為人體血液中的重要成份，在生理性止血中起著非常重要的作用。新鮮液體保存血小板，最長保存時(shí)間僅為5天，而冰凍保存血小板明顯延長了血小板保存期限，滿足了臨床急癥出血病人的需求。冰凍保存可能是維持生物細(xì)胞、組織活性的最理想的方法之一，也是許多研究人員目前致力研究的方向。然而，因?yàn)槠浔Ｗo(hù)劑選擇、保存及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等仍未能達(dá)成共識，使得冰凍血小板的使用未能形成國標(biāo)。本文對冰凍血小板國內(nèi)外研究進(jìn)展做了綜述。

關(guān)鍵詞：冰凍血小板? 二甲基亞砜? 國家戰(zhàn)略儲(chǔ)備物資

【中圖分類號】R331.1???????????? 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A???????????? 【文章編號】2107-2306（2021）11--03

在醫(yī)學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展的今天，隨著各種移植手術(shù)、高難度手術(shù)的增多，輸血治療在臨床上的作用日趨體現(xiàn)，成分輸血被廣泛運(yùn)用，特別是強(qiáng)化療和骨髓移植的迅速開展，臨床上對血小板的需求急劇增加。新鮮液態(tài)血小板的常規(guī)保存條件為（22±2）℃、震蕩保存5天，其雖具有良好的功能，但因采集新鮮液態(tài)血小板耗時(shí)長、保存期短，易造成細(xì)菌污染，使用前需要提前預(yù)約，因此無法保障臨床急診患者的需求，特別是偏遠(yuǎn)地區(qū)。深低溫冰凍保存是維持細(xì)胞、組織活性，保留新鮮血小板生理功能的較理想的方法之一，具有保存期長、可以大量儲(chǔ)備并且隨需隨取、供應(yīng)及時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，尤其可用于特殊血型血小板和自體血小板儲(chǔ)備。本文對目前冰凍血小板保護(hù)劑的選擇、制備、應(yīng)用等方面的研究進(jìn)展做綜述如下，以期為深低溫冰凍保存血小板的研究及應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 制備冰凍血小板保護(hù)劑的選擇

常用的保護(hù)劑可分為深低溫保護(hù)劑、冰凍干燥保護(hù)劑和低溫冷藏保護(hù)劑三大類。

深低溫保護(hù)劑又根據(jù)其能否通透細(xì)胞膜分為非通透性低溫保護(hù)劑和細(xì)胞膜通透性低溫保護(hù)劑。其中，常用的非通透性低溫保護(hù)劑有聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯二醇、乙烯乙二醇、白蛋白等。細(xì)胞膜通透性低溫保護(hù)劑如：二甲基亞砜、甘油等。多種深低溫冰凍保護(hù)劑聯(lián)合使用改善低溫凍存效果，滲透性和非滲透性保護(hù)劑的聯(lián)用可以改善低溫凍存效果已經(jīng)被證。通常認(rèn)為非滲透保護(hù)劑與滲透性冰凍保護(hù)劑聯(lián)用能降低冰凍保護(hù)劑的細(xì)胞毒性，但是Lawson等的研究表明：多種深低溫保護(hù)劑的聯(lián)用增加了其細(xì)胞毒性，聯(lián)用的深低溫保護(hù)劑在增加細(xì)胞毒性方面有協(xié)同作用，深低溫保護(hù)劑聯(lián)用不像以前想的那樣有益無害。

冰凍干燥保護(hù)劑常用的有海藻糖，低溫冷藏保護(hù)劑如尿嘧啶二磷酸半乳糖。有研究者將幾種保護(hù)劑混合使用，如二甲基亞砜與羥乙基淀粉聯(lián)用，還有二甲基亞砜與海藻糖聯(lián)用、二甲基亞砜與第二信使調(diào)節(jié)劑的混合物（TS）聯(lián)用等，多種低溫保護(hù)劑的聯(lián)合使用雖取得一些進(jìn)展，但未達(dá)到理想狀態(tài)，達(dá)不到設(shè)計(jì)初衷，在保護(hù)劑的選擇搭配以及濃度選擇上有待進(jìn)一步研究。盡管血小板低溫保護(hù)劑及使用方法有很多種，但是目前常用及研究最多的深低溫冰凍保護(hù)劑主要是單純選用5%-6%二甲基亞砜作為保護(hù)劑。

不論何種保護(hù)劑，其目的最主要的是在低溫處理過程中能夠保護(hù)細(xì)胞膜及細(xì)胞骨架的完整性，其次還應(yīng)該考慮細(xì)胞毒性、避免血小板激活等問題。大量研究表明二甲基亞砜有許多優(yōu)勢，如低細(xì)胞毒性、分子量小、強(qiáng)滲透性、易于穿透細(xì)胞、可使細(xì)胞內(nèi)冰點(diǎn)下降、提高包膜對水的通透性、減少細(xì)胞內(nèi)冰晶形成、可靜脈輸注等，同時(shí)還具有舒張血管、抗血小板聚集、防止微循環(huán)堵塞、消炎止痛、抑菌等優(yōu)點(diǎn)，使之成為研究首選。雖然5%-6%的二甲基亞砜冰凍保護(hù)劑無臨床輸注毒副作用，但其滲透性強(qiáng)、代謝物中有惡臭二甲基硫化物、致畸等原因，不能連續(xù)多次使用，因此在血小板冰凍保存中應(yīng)該盡量減少其用量。

2 冰凍血小板的制備

孫瑜等研究認(rèn)為75%DMSO的配制由DMSO原液與0.9%NaCl以3：1的體積比在無菌條件下配制，配好后置于-50℃冰箱保存，使用前取出，無需室溫平衡。在百級無菌室內(nèi)，以加藥件按1ml/min的速度緩慢將DMSO原液加入血小板懸液深部，邊加邊振（頻率60次/min），充分混勻，使終濃度為5%，振蕩8min后-80℃冰凍保存。

3 冰凍血小板的最佳保存溫度及保存時(shí)限

有研究表明，冰凍血小板儲(chǔ)存溫度越低，保存的時(shí)間就越長，效果越好。維持細(xì)胞生物活性、功能的最理想方法是程序降溫，即深低溫液氮（-179℃）冰凍保存，但由于該方法存在技術(shù)難度大，對設(shè)備要求高，需長期更換液氮，可能因偶然因素徹底損傷細(xì)胞等不利因素，不太適用于存量較大的血小板凍存。因此，深低溫冰箱（-80℃）凍存是維持細(xì)胞生物活性、保留新鮮血小板生理功能較理想的方法之一。深低溫凍存血小板的供給形式、數(shù)量保證和及時(shí)有效性等方面均優(yōu)于其他方法，且操作方法簡單容易，能極大地方便臨床使用。

血小板于冰凍保存期間儲(chǔ)存溫度波動(dòng)，會(huì)導(dǎo)致冰晶機(jī)械作用使血小板損傷。冰凍血小板隨著貯存時(shí)間的延長，絮狀物析出的情況有顯著改變，原因可能是保存期間低溫冰箱門被多次開啟，導(dǎo)致溫度波動(dòng)。貯存時(shí)間越長，開啟次數(shù)就越多，溫度波動(dòng)就越大，血小板損傷的概率和程度就越大。劉景漢認(rèn)為，冰凍血小板在-80℃以下保存可達(dá)6-12個(gè)月，解凍后血小板聚集功能恢復(fù)良好，臨床使用效果理想。但在實(shí)際工作中，低溫冰箱門的反復(fù)開啟是不可避免的，因此建議保存期在6個(gè)月較適宜。

冰凍血小板復(fù)融溫度和時(shí)間也有明確規(guī)定，黃彥等認(rèn)為，血小板復(fù)融溫度為37-40℃，快速復(fù)溫應(yīng)在兩三分鐘內(nèi)完成。在天氣寒冷的冬天或者周圍環(huán)境溫度較低時(shí)，融化時(shí)間應(yīng)適當(dāng)延長，但融化時(shí)間不宜超過5分鐘。

盡管冰凍血小板在制備、保存和融解等過程中，血小部分被破壞，數(shù)量有所減少，但仍具有相對完整的超微結(jié)構(gòu)和較高的回收率。冰凍血小板在復(fù)融后越早輸注止血效果越好，應(yīng)囑臨床立即用經(jīng)濾血器快速輸注，如需保存也最好置于22℃環(huán)境中，保存時(shí)間不宜過長，建議盡可能在解凍后2小時(shí)內(nèi)輸完。二甲基亞砜對細(xì)胞的毒性作用在室溫中比低溫時(shí)大，因此應(yīng)盡量縮短在室溫中的停放時(shí)間，以減少二甲基亞砜的毒性反應(yīng)。

4 冰凍血小板的功能檢查

判斷冰凍血小板的輸注效果主要通過檢測其體外功能和體內(nèi)功能來判斷，體外檢測方法多樣，比如，血小板的聚集功能、血塊收縮試驗(yàn)、粘附功能、分泌功能、膜表面促凝血活性的功能等，體內(nèi)功能主要通過檢測其數(shù)量的變化、出血情況的改善、血小板回收率及輸血療效等。

有相關(guān)研究表明，冰凍血小板在貯存到取用的過程中，將會(huì)損失超過25%的血小板。因此，新鮮液態(tài)血小板在血小板計(jì)數(shù)提升方面有明顯的優(yōu)勢。但是，陳興智認(rèn)為血小板體外功能實(shí)驗(yàn)不能正確反映冰凍血小板的體內(nèi)止血功能，尤其是對出血傾向的內(nèi)科患者或外科滲血的患者，血小板計(jì)數(shù)或CCI值并未明顯升高，但是患者出血點(diǎn)消失，病灶出血減少或明顯好轉(zhuǎn)也說明是有效的。

研究發(fā)現(xiàn)，與新鮮血小板比較，冰凍保存血小板產(chǎn)生了與冰凍前顯著不同的新亞群。冰凍后血小板中的CD62p陰性和CD62p陽性的血小板結(jié)合因子V的能力都顯著提高，特別是占低溫保存血小板總數(shù)50%的GPIb減少亞群結(jié)合V因子的能力比新鮮液體血小板高出多達(dá)5倍以上，促凝血活性明顯增強(qiáng)，低溫保存血小板的止血效果強(qiáng)于新鮮液態(tài)保存3～4天的血小板^[25]。冰凍血小板膜表面黏附受體的結(jié)合能力明顯增強(qiáng)，促凝血活酶明顯提高，新的亞群的出現(xiàn)使得血小板對V因子的結(jié)合能力大大增強(qiáng)，CD62（ Pselectin）表達(dá)明顯增高，使即刻止血效果顯著。同時(shí)凝血酶激活的CD62p陰性亞群血小板在輸入受血者體內(nèi)，可在外周血正常存活，提高受血者外周血血小板水平。血小板通過低溫保存后產(chǎn)生了新亞群，新亞群膜表面功能分子的變化與其體內(nèi)存活率減少而即刻止血功能增強(qiáng)密切相關(guān)。冰凍血小板與新鮮血小板膜表面上亞群分子不同，部分冰凍血小板被激活，細(xì)胞膜表面血小板分子或受體發(fā)生改變或丟失，可能是冰凍血小板獲得即刻止血功能明顯增強(qiáng)特性的機(jī)理之一。

新鮮血小板由于血漿蛋白或其他抗原作用，輸注新鮮血小板容易發(fā)生顏面部嚴(yán)重水腫輸血反應(yīng)，也可以發(fā)生過敏性休克。輸注新鮮液態(tài)血小板發(fā)生過敏性蕁麻疹的病例，改輸冰凍血小板后解決了患者輸血不良反應(yīng)的同題，冰凍血小板輸注后類似反應(yīng)未見有報(bào)道，可能是抗原性較強(qiáng)的血漿蛋白等物質(zhì)冷凍后抗原性減弱是冰凍保存血小板不發(fā)生類似反應(yīng)的主要原因。

截止到目前，血小板的功能檢測在臨床上仍沒有一個(gè)“金標(biāo)準(zhǔn)”，因?yàn)楸鶅霰４娴难“咫m然出現(xiàn)形態(tài)改變及功能受損，但其輸注到人體內(nèi)仍能產(chǎn)生止血作用。制定一個(gè)血小板質(zhì)量評價(jià)的最佳指標(biāo)對于正確評價(jià)血小板制品的輸注效果意義重大。

5 冰凍血小板的臨床應(yīng)用

血小板經(jīng)深低溫冰凍保存后，磷脂酰絲氨酸、CD62P等功能分子的表達(dá)、丟失和再分布，使其即刻止血效果功能明顯增強(qiáng)：產(chǎn)生了新的亞群，使其促凝血活性明顯提高，代謝基本停止，有害因子產(chǎn)生明顯降低，因而輸血反應(yīng)率降低。細(xì)胞膜表面黏附受體的結(jié)合能力明顯增強(qiáng)，使凝血活性明顯提高，大量的血小板因子被釋放出來，即刻止血效果顯著。

研究發(fā)現(xiàn)，冰凍單采血小板外科病例有效率高于新鮮單采血小板，這主要與外科多用于婦產(chǎn)科、骨科、創(chuàng)傷大出血及手術(shù)出血等病例的止血治療，冰凍單采血小板經(jīng)冰凍保存后細(xì)胞膜表面粘附受體的結(jié)合能力增強(qiáng)促凝血活性提高，且活化的血小板及其裂解產(chǎn)物同樣具有凝血、止血保護(hù)功能，即可止血效果顯著有關(guān)，同時(shí)，也進(jìn)一步印證了Antonio等認(rèn)為冰凍血小板比新鮮血小板止血功能更有優(yōu)勢的觀點(diǎn)。但冰凍單采血小板在內(nèi)科病例的無效率高于外科病例（P<0.05），而新鮮單采血小板在這方面的差異卻不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），這與內(nèi)科多用于血液系統(tǒng)、腫瘤放化療疾病等病例的預(yù)防性治療，冰凍單采血小板復(fù)蘇后容易被激活，在體內(nèi)壽命縮短，而新鮮單采血小板提升外周血血小板計(jì)數(shù)比冷凍單采血小板顯著有關(guān)。該類內(nèi)科病例因反復(fù)多次輸注出現(xiàn)免疫性血小板輸注無效，應(yīng)盡量采用HLA配合的新鮮單采血小板輸注。

可見，冰凍血小板在臨床應(yīng)用中與新鮮血小板具有同等的有效性和安全性，可廣泛用于臨床，特別是在外科止血療效上具有獨(dú)特的優(yōu)勢。但對反復(fù)輸注或血小板輸注無效病例應(yīng)優(yōu)先選擇新鮮血小板，以降低血小板輸注無效和患者出血風(fēng)險(xiǎn)，提高臨床療效，有效保護(hù)血液資源。

6 存在問題

目前，血小板的冰凍保存研究還未取得突破性進(jìn)展，-80℃的冰凍保存雖然延長了保存時(shí)間，血小板內(nèi)的生物活性物質(zhì)也受到保護(hù)，但其應(yīng)用仍然受到很大地限制。如何降低低溫貯存損傷，提高血小板的輸注效果;怎樣降低保護(hù)劑的毒性，增加血小板輸注的安全性等等，這些問題一直存在，也是冰凍保存血小板研究的難點(diǎn)。冰凍保存后的血小板輸注到人體內(nèi)雖然存活時(shí)間較長，但與新鮮液態(tài)血小板仍有一定的差距，且二甲基亞砜的細(xì)胞毒性不能避免。如何能在保證血小板質(zhì)量的情況下降低二甲基亞砜的濃度，增加輸注的安全性，也是研究者們應(yīng)該克服的一道難題。

深低溫冰凍保存血小板從制備、保存、使用到質(zhì)量檢測等指標(biāo)方面，目前均沒有明確的國際或國家標(biāo)準(zhǔn)。因此，在實(shí)際應(yīng)用中無統(tǒng)一的做法，一定程度上阻礙了冰凍血小板的推廣使用。新頒布的《全血及成分血質(zhì)量要求》（GB18469-2012）血液制劑方面并未提及冰凍血小板。血小板深低溫保護(hù)劑二甲基亞砜具有滲透性強(qiáng)、代謝物二甲基硫化物有惡臭并有致畸等毒性作用，其在臨床上的應(yīng)用受到極大的限制。針對血小板深低溫保存時(shí)所用保護(hù)劑二甲基亞砜的代謝產(chǎn)物有副作用的爭議，中國國家食品藥品監(jiān)督管理局2007年指明二甲基亞砜可用于血小板、干細(xì)胞的低溫保存和不經(jīng)洗滌的臨床輸注。

7 展望

深低溫冰凍保存血小板是長期大量保存血小板的有效方法。冰凍血小板的出現(xiàn)在很大程度上彌補(bǔ)了新鮮液態(tài)血小板在臨床上供應(yīng)不足的缺點(diǎn)，為臨床提供了保障，也為很多患者贏得了時(shí)間，尤其是在骨髓干細(xì)胞移植、急危重癥患者搶救、惡性腫瘤大劑量化療等醫(yī)學(xué)新技術(shù)的應(yīng)用中發(fā)揮著重要的作用。同時(shí)，血小板具有非常重要的戰(zhàn)略性地位，大的自然災(zāi)害、戰(zhàn)爭，都離不開血小板的及時(shí)、足量輸注。因此，深低溫冰凍血小板應(yīng)作為國家重要的戰(zhàn)略儲(chǔ)配物資。

血液制品是一種具有生物活性的特殊藥品。既是藥品，必然具有副作用，即使有副作用，仍要用于臨床。比如輸血存在經(jīng)血傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)依然要輸注;如緊急狀況下允許少量○型紅細(xì)胞的異型輸注。藥品如抗腫瘤的放化療藥，既殺死腫瘤細(xì)胞也殺死正常細(xì)胞，卻依然要推廣于臨床。所以，筆者認(rèn)為即使目前深低溫冰凍血小板保護(hù)劑的選擇等方面仍有不完善的地方，也應(yīng)該允許按一定的比例制備冰凍血小板，如控制在血小板使用總量的15%以下，以新鮮液態(tài)血小板的替補(bǔ)角色存在。因?yàn)闆]有生命，就沒有一切，生命權(quán)應(yīng)該是排第一位的。因此，目前不應(yīng)一刀切，而應(yīng)允許少量的、限制性地使用5%-6%二甲基亞砜作為保護(hù)劑的深低溫冰凍血小板，一邊優(yōu)化深低溫冰凍保存血小板的制備方案。期待不久的將來，能有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)出臺(tái)，將深低溫冰凍保存血小板技術(shù)推廣于臨床，那將是一個(gè)里程碑式的改變。

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