靜脈滴注心房利鈉肽對(duì)阿勒泰羊血液脂代謝激素的影響及尾脂轉(zhuǎn)錄組分析

馬 昕，楊 光,李翔宇,劉越越,陳 勇*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆肉乳用草食動(dòng)物營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052)

阿勒泰羊作為典型的地方脂尾型綿羊，尾脂脂肪過度沉積不僅影響畜產(chǎn)品品質(zhì)，還明顯降低飼料轉(zhuǎn)化率[1]，減少尾部脂肪沉積正成為養(yǎng)羊業(yè)重要的研究領(lǐng)域之一[2]。

心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide, ANP)主要由心房心肌作為前體激素產(chǎn)生和分泌，已證實(shí)ANP可調(diào)節(jié)水鹽平衡和血壓穩(wěn)定，且表現(xiàn)出強(qiáng)效的脂解作用[3]。ANP促進(jìn)脂肪細(xì)胞褐變、脂肪分解、脂質(zhì)氧化和脂肪因子分泌，已成為能量消耗和代謝的重要調(diào)節(jié)因子。盡管ANP曾被認(rèn)為僅能促進(jìn)靈長類動(dòng)物脂肪細(xì)胞的脂解[4]，且ANP在人和嚙齒動(dòng)物表達(dá)中具有同源性[5]，但也有研究證實(shí)，綿羊也產(chǎn)生ANP[6]，本實(shí)驗(yàn)室也已發(fā)現(xiàn)ANP會(huì)影響綿羊脂肪代謝，但其作用機(jī)制尚不清楚[7]。本研究利用Illumina高通量測序技術(shù)，根據(jù)靜脈滴注ANP后阿勒泰羊尾脂基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，確定ANP對(duì)參與綿羊脂解主要通路和關(guān)鍵基因表達(dá)規(guī)律的影響，為闡明綿羊尾部脂肪沉積的分子調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

ANP由蘇州強(qiáng)耀生物科技有限公司合成，分子量為3 960.48，純度為98.83%。ANP、脂聯(lián)素(adiponectin，ADPN)、胰島素(insulin，INS)、瘦素(leptin，LEP)和環(huán)鳥苷酸(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)ELISA檢測試劑盒購自上海篤瑪生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

在新疆畜牧科學(xué)院綿羊繁育試驗(yàn)基地選取平均體重為(45.6±6.5)kg、健康狀況良好的1.5歲阿勒泰母羊8只。采用自身對(duì)照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)照期在晨飼前頸靜脈滴注生理鹽水，試驗(yàn)期在晨飼前頸靜脈滴注ANP溶液。滴注時(shí)，綿羊側(cè)臥在人工授精保定臺(tái)上。對(duì)照期時(shí)，在(45±2)min內(nèi)滴注完畢100 mL生理鹽水，連續(xù)滴注4 d；試驗(yàn)期時(shí)，將濃度為562.5 μg·mL-1的ANP母液以1.125 μg·kg-1BW的劑量溶解在100 mL生理鹽水中滴注[8]，滴注方式與時(shí)間同對(duì)照期。滴注結(jié)束后自由采食、飲水，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(以干物質(zhì)計(jì))

1.3 樣品采集與處理

每期的第4天分別在滴注前(0 min)和滴注開始后15、30、45、60、90、120 min采集空腹血液，分離血漿并于-20 ℃保存。各期最后一次血樣采集結(jié)束后，以鹽酸普魯卡因?qū)ξ膊烤植柯樽砗笫中g(shù)采集尾脂0.2 g左右，剪碎后儲(chǔ)存于RNAstore保存液中，于4 ℃過夜后-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 激素的測定

ANP、脂聯(lián)素、胰島素、瘦素和環(huán)鳥苷酸ELISA測定按照產(chǎn)品說明進(jìn)行。

1.5 RNA提取、cDNA文庫構(gòu)建及高通量測序

TRIzol法提取脂肪組織總RNA，并檢測純度及完整性。從對(duì)照期和試驗(yàn)期各隨機(jī)選取5個(gè)合格樣本送至北京諾禾致源科技股份有限公司，利用Illumina的NEBNext?UltraTM RNA Library Prep Kit試劑盒構(gòu)建樣品的cDNA文庫，經(jīng)檢測合格的文庫再進(jìn)行準(zhǔn)確定量。隨后使用Illumina HiseqTM 2500平臺(tái)進(jìn)行測序。

1.6 生物信息學(xué)分析

測序下機(jī)原始數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控后得到有效數(shù)據(jù)，計(jì)算有效數(shù)據(jù)的容錯(cuò)率以及Q20、Q30、GC的含量，再由HISAT2比對(duì)軟件比對(duì)序列到參考基因組，獲得比對(duì)數(shù)及比對(duì)率?；虮葘?duì)后，通過DESeq2軟件對(duì)兩組測序文庫的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，以校正后的P(Padj)<0.05且差異表達(dá)倍數(shù)值|log2fold change|>1為標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異表達(dá)基因。并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路富集分析。

1.7 qRT-PCR驗(yàn)證

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，選取7個(gè)與脂肪代謝相關(guān)的基因，采用熒光定量PCR進(jìn)行相對(duì)定量(2-ΔΔCt)，驗(yàn)證高通量測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。在GenBank中搜索綿羊的水通道蛋白7(AQP7)、脂肪酸結(jié)合蛋白4(FABP4)、脂滴包被蛋白基因5(PLIN5)、脂聯(lián)素受體2(ADIPOR2)、單酸甘油酯脂肪酶(MGLL)、胰島素降解酶(IDE)及長鏈脂酰輔酶A合成酶1(ACSL1)基因mRNA序列信息，以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因，使用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，PCR引物序列見表2。

表2 驗(yàn)證基因及其引物信息

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)分析，GraphPad Prism 8.0進(jìn)行做圖，所有數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)”表示，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 靜脈滴注ANP對(duì)血漿激素含量的影響

由表3可知，滴注ANP后，血漿中ANP在30、90 min時(shí)，試驗(yàn)期顯著高于對(duì)照期(P<0.05)；脂聯(lián)素在30 min時(shí)，試驗(yàn)期顯著高于對(duì)照期(P<0.05)，90 min時(shí)，試驗(yàn)期血漿中脂聯(lián)素含量極顯著高于對(duì)照期(P<0.01)；在30、90 min時(shí)，試驗(yàn)期環(huán)鳥苷酸含量極顯著高于對(duì)照期(P<0.01)，在45、60 min 時(shí)，試驗(yàn)期cGMP含量顯著高于對(duì)照期(P<0.05)；胰島素在開始滴注后0、30、120 min時(shí)，試驗(yàn)期極顯著高于對(duì)照期(P<0.01)，15、45、60、90 min時(shí)，試驗(yàn)期胰島素含量顯著高于對(duì)照期(P<0.05)；瘦素在0、15 min時(shí)，試驗(yàn)期顯著高于對(duì)照期(P<0.05)，30 min時(shí)，試驗(yàn)期瘦素含量極顯著高于對(duì)照期(P<0.01)。

表3 滴注ANP對(duì)阿勒泰羊血漿脂代謝相關(guān)激素含量的影響

2.2 轉(zhuǎn)錄組分析

2.2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)檢 測序獲得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控后平均每個(gè)樣本的有效數(shù)據(jù)為5 407萬條，數(shù)據(jù)量為8.11G，樣本容錯(cuò)率均在0.03%以下，Q20、Q30分別超過97%和94%，表明獲得了較高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)；質(zhì)控后的有效數(shù)據(jù)與參考基因組比對(duì)后，總比對(duì)率>88%，唯一比對(duì)率>79%，表明所選參考基因組可以滿足信息分析的需求。

2.2.2 差異表達(dá)基因的篩選 以P<0.05且|log2fold change|>1為標(biāo)準(zhǔn)，篩選滴注ANP前后的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)共有差異基因3 686個(gè)，其中1 482個(gè)基因上調(diào)表達(dá)、2 204個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，總體基因的表達(dá)情況可見火山圖(圖1)。由差異基因熱圖(圖2)可見，組內(nèi)兩兩樣品的基因表達(dá)量基本趨于一致，而組間樣品則存在顯著的基因表達(dá)變化，證明樣品間相關(guān)性良好，聚類效果較好。表4所示為對(duì)照期與試驗(yàn)期之間脂代謝相關(guān)差異基因，PLIN5、PLIN1、MGLL、FABP4、ADIPOR2、AQP1、IDE等與脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)量差異極顯著(P<0.01)，表明滴注ANP對(duì)阿勒泰羊尾脂中與脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)量產(chǎn)生了一定影響。

表4 滴注ANP對(duì)阿勒泰羊尾脂脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)量(FPKM)的影響

圖1 差異基因火山圖

圖2 差異基因熱圖

2.3 轉(zhuǎn)錄組功能注釋

2.3.1 差異基因的GO功能富集分析 對(duì)差異基因進(jìn)行GO分析共富集到118個(gè)生物學(xué)功能，其中77.1%為生物過程(biology process, BP)、17.0%為細(xì)胞組分(cellular component, CC)、5.9%為分子功能(molecular function, MF)。各功能中富集最顯著的前10條通路見圖3。其中表達(dá)上調(diào)基因在BP中主要顯著富集在電子傳遞鏈、核苷酸代謝過程、線粒體復(fù)合體I的組裝和生物發(fā)生及氧化磷酸化相關(guān)；在CC中主要顯著富集在核糖體組成部分、線粒體、線粒體膜及呼吸鏈；在MF中主要顯著富集在核糖體的構(gòu)成部分、NADH脫氫酶活性、rRNA結(jié)合位點(diǎn)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性及氧化還原酶活性(圖4A)。表達(dá)下調(diào)基因在BP中主要顯著富集在白細(xì)胞活化、淋巴細(xì)胞活化、免疫反應(yīng)激活及免疫應(yīng)答調(diào)控；在CC中主要顯著富集在濃縮染色體及中心體；在MF中主要顯著富集在酶激活劑活性、核苷三磷酸酶調(diào)節(jié)劑活性、GTP酶激活劑及GTP酶調(diào)節(jié)劑活性、糖蛋白結(jié)合(圖4B)。

圖3 差異表達(dá)基因的GO功能富集

A.表達(dá)上調(diào)基因；B.表達(dá)下調(diào)基因

2.3.2 差異基因的KEGG通路富集分析 通過KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照期相比，表達(dá)上調(diào)基因共富集到262條信號(hào)通路中，其中15條通路顯著富集；表達(dá)下調(diào)基因共富集到284條信號(hào)通路中，其中31條通路顯著富集。(除去疾病)其中表達(dá)上調(diào)基因顯著富集到核糖體、氧化磷酸化、產(chǎn)熱、逆行內(nèi)源性大麻素信號(hào)、細(xì)胞色素P450代謝、調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞中的脂肪分解等通路(圖5A)；表達(dá)下調(diào)基因顯著富集到溶酶體、Toll樣受體信號(hào)、B細(xì)胞受體信號(hào)、NOD樣受體信號(hào)、吞噬體、趨化因子信號(hào)等通路(圖5B)。其中，與脂代謝和能量相關(guān)的主要通路見表5，核糖體、產(chǎn)熱、氧化磷酸化通路極顯著富集(P<0.01)；cAMP信號(hào)通路、調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞中的脂肪分解、逆行內(nèi)源性大麻素信號(hào)通路顯著富集(P<0.05)，表明滴注ANP可能通過調(diào)控上述通路實(shí)現(xiàn)脂解作用。

表5 滴注ANP對(duì)阿勒泰羊尾脂脂肪代謝相關(guān)KEGG通路的影響

A.表達(dá)上調(diào)基因；B.表達(dá)下調(diào)基因

2.4 差異表達(dá)基因的驗(yàn)證

根據(jù)功能及代謝通路選取RNA-seq中5個(gè)表達(dá)上調(diào)基因(AQP7、FABP4、PLIN5、ADIPOR2、MGLL)和2個(gè)表達(dá)下調(diào)基因(IDE、ACSL1)，經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果如圖6顯示，7個(gè)功能候選基因表達(dá)水平變化趨勢與RNA-seq結(jié)果基本一致。通過qRT-PCR分析可以看出，IDE、ACSL1在滴注ANP后的表達(dá)分別顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)下調(diào)；ADIPOR2在滴注ANP后的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，AQP7、FABP4、MGLL和PLIN5則極顯著上調(diào)(P<0.01)(圖7)。

圖6 差異基因qRT-PCR驗(yàn)證

*.差異顯著(P<0.05)；**.差異極顯著(P<0.01)

3 討 論

在人體皮下組織中注射ANP可誘導(dǎo)脂肪分解并增加局部血流量，從而增強(qiáng)脂質(zhì)代謝[9]。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)期血漿ANP含量均高于對(duì)照期，在人與豬模型中輸注適宜劑量ANP后均發(fā)現(xiàn)了類似效應(yīng)[10-11]，表明滴注外源ANP對(duì)血漿ANP含量產(chǎn)生了一定影響。胰腺α和β細(xì)胞上存在ANP受體NPRA(natriuretic peptide receptor A)，滴注ANP后可能刺激生成更多受體[12]，Birkenfeld等[8]的研究結(jié)果表明，受試者胰島素濃度隨著ANP注射的增加而增加，本研究中試驗(yàn)全期胰島素含量均顯著增加(P<0.05)。ANP和腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARγ)的表達(dá)來調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪分布，促進(jìn)脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素的分泌[13]。研究表明，BNP可能通過釋放脂肪因子發(fā)揮部分代謝作用，BNP與ADPN水平呈正相關(guān)[14]，由此推測，BNP的代謝效應(yīng)可能部分是由脂聯(lián)素介導(dǎo)的。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)全期血漿中ADPN平均水平顯著高于對(duì)照期(P<0.05)，Wang等[15]研究也表明，ANP顯著增加了總脂聯(lián)素含量，ANP與BNP有類似生物活性，表明ANP也可能是脂聯(lián)素分泌的主要刺激因素。NPRA和NPRB與鳥苷酸環(huán)化酶受體偶聯(lián)，可促進(jìn)GTP轉(zhuǎn)化為二級(jí)信使cGMP，從而提高尿液和血漿中cGMP的水平，升高的細(xì)胞內(nèi)cGMP進(jìn)而激活下游效應(yīng)因子蛋白激酶G(PKG)促進(jìn)激素敏感脂肪酶和脂滴包被蛋白的磷酸化[16]，本試驗(yàn)中，就全期平均水平來看，試驗(yàn)期血漿中cGMP含量極顯著高于對(duì)照期(P<0.01)，其他學(xué)者研究也有類似結(jié)果[17]，表明滴注ANP后，cGMP含量升高刺激脂肪組織脂解。研究表明，瘦素的分泌與脂肪組織中儲(chǔ)存的能量成正比，可通過增強(qiáng)脂肪細(xì)胞的生物活性，促進(jìn)瘦素的釋放[18]。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)期血漿瘦素含量顯著高于對(duì)照期(P<0.05)，ANP刺激脂肪細(xì)胞釋放瘦素，高瘦素水平增加脂肪酸氧化，同時(shí)減少葡萄糖攝取，導(dǎo)致心臟胰島素抵抗和從葡萄糖向游離脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)變[19]。但瘦素與血漿BNP之間的聯(lián)系還受其他神經(jīng)激素共同調(diào)控[20]，同理推及ANP與瘦素之間互作效用還有待探討。較高的胰島素水平和較高的葡萄糖濃度可能通過誘導(dǎo)人脂肪細(xì)胞中清除受體NPRC(natriuretic peptide receptor C)的表達(dá)，導(dǎo)致ANP介導(dǎo)的脂解減少，從而導(dǎo)致胰島素抵抗[21]，但增加脂聯(lián)素的分泌可間接改善ANP的胰島素增敏效果[22]。由此可見，血漿ANP、脂聯(lián)素、cGMP、胰島素和瘦素的共同調(diào)控可能是聯(lián)系A(chǔ)NP和糖脂代謝活動(dòng)之間的關(guān)鍵效用。

研究人員基于RNA-seq技術(shù)比較分析同種基因在尾型不同綿羊脂肪組織的相對(duì)表達(dá)量，以期鑒定遺傳決定因素[23]。為揭示差異表達(dá)基因的潛在生理功能，本研究對(duì)篩選到的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能與KEGG通路富集分析。GO功能主要富集在核糖體與線粒體功能，脂代謝受蛋白與能量共同調(diào)控，ANP可能間接調(diào)控關(guān)鍵脂肪細(xì)胞分化，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子(PPARγ、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBPα)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP-1)等)功能，促使能量代謝相關(guān)過程的上調(diào)表達(dá)基因顯著富集。表達(dá)下調(diào)的基因主要富集在免疫功能中，表明ANP可能通過某些下調(diào)基因參與免疫調(diào)節(jié)代謝過程。通過KEGG通路富集分析顯示，氧化磷酸化、產(chǎn)熱通路與核糖體及能量產(chǎn)生密切相關(guān)，與本研究GO功能富集結(jié)果相對(duì)應(yīng)；Carper等[24]發(fā)現(xiàn)，ANP是哺乳動(dòng)物非顫抖產(chǎn)熱的生理性內(nèi)分泌激活劑，生熱脂肪細(xì)胞可通過部分線粒體解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein 1，UCP1)將化學(xué)能散失為熱量，以p38MAPK依賴的方式增加棕色脂肪和線粒體標(biāo)志物的表達(dá)。脂肪代謝相關(guān)KEGG通路中，cAMP調(diào)節(jié)胰島素分泌，瘦素直接刺激醛固酮的分泌[25]。表達(dá)下調(diào)顯著富集的KEGG通路中多數(shù)通路與免疫反應(yīng)通路相關(guān)，與本研究GO功能富集分析下調(diào)表達(dá)結(jié)果相對(duì)應(yīng)。

在前期研究滴注ANP后，阿勒泰羊血液中甘油、甘油三酯、游離脂肪酸含量均有不同程度的增加，促進(jìn)了脂解[7]。Guo等[26]的研究表明，可通過PPAR信號(hào)通路依賴方式增強(qiáng)AQP7在脂肪組織中的表達(dá)，減輕體重，介導(dǎo)脂肪細(xì)胞甘油輸出，改善糖脂代謝。FABP4的表達(dá)受PPARγ和C/EBPα在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控[27]，F(xiàn)ABP4通過下調(diào)PPARγ信號(hào)通路顯著抑制了脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴的積累和成脂細(xì)胞的形成[28]。本研究中，F(xiàn)ABP4的上調(diào)表達(dá)可能與ANP介導(dǎo)脂肪組織(腹脂和內(nèi)臟脂肪)向尾脂轉(zhuǎn)運(yùn)更多脂肪酸有關(guān)。PLIN5在脂肪酸氧化程度較高的組織中含量豐富，在cAMP/PKA介導(dǎo)的脂解刺激下，優(yōu)先與單不飽和脂肪酸結(jié)合[29]，Wang等[30]研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌中PLIN5過表達(dá)促進(jìn)了PPARγ和PPARγ輔活化子-1α(PGC-1α)共同控制下脂肪酸分解代謝。有研究表明，ANP通過激活A(yù)MPKα2亞基活性刺激脂解作用[31]，ADIPOR2參與AMPK信號(hào)通路，介導(dǎo)AMPKα2亞基活性和PPAR活性的升高，ADIPOR2還可介導(dǎo)脂聯(lián)素激活，刺激PPARα配體表達(dá)，導(dǎo)致胰島素敏感性增加，從而調(diào)節(jié)糖脂代謝[32]。刺激MGLL被抑制后，體內(nèi)主要的內(nèi)源性大麻素-2-花生四烯酰甘油酯分泌水平隨之增加[33]，與本研究KEGG中逆行內(nèi)源性大麻素信號(hào)通路上調(diào)結(jié)果一致。IDE最初被認(rèn)為具有降解胰島素的能力，后來發(fā)現(xiàn)可與ANP相互作用，已經(jīng)有研究表明，IDE可作為某些疾病的治療靶點(diǎn)，通過抑制IDE來增強(qiáng)胰島素的活性[34]。ACSL1的高表達(dá)通過PPARβ途徑減少脂肪酸γ氧化，參與甘油三酯生物合成及脂肪酸代謝通路從而提高甘油三酯水平，ACSL1下調(diào)后甘油三酯水平下降[35]，已證實(shí)靜脈滴注ANP 45 min后血漿中甘油三酯水平有降低趨勢[7]?？赡苡捎诒狙芯繘]有直接評(píng)估蛋白質(zhì)表達(dá)水平，也沒有直接評(píng)估脂肪酸通量，相對(duì)的基因表達(dá)量并不一定意味著蛋白質(zhì)將被翻譯或具有功能。因此，后續(xù)的研究應(yīng)該同時(shí)測量蛋白質(zhì)水平和脂代謝基因的活性。

4 結(jié) 論

4.1靜脈滴注ANP后，阿勒泰羊血漿中ANP、脂聯(lián)素、cGMP、胰島素和瘦素含量均有不同程度的增加，ANP在一定程度上促進(jìn)了阿勒泰羊的脂肪動(dòng)員，增加了脂肪分解。

4.2靜脈滴注ANP后尾脂組織中有1 482個(gè)基因上調(diào)，2 204個(gè)基因下調(diào)；GO富集分析顯示，差異基因主要富集在氧化磷酸化相關(guān)的生物過程；KEGG富集分析顯示，差異基因主要富集在核糖體、產(chǎn)熱、氧化磷酸化和調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞中的脂肪分解等信號(hào)通路上。表明外源ANP通過增加氧化磷酸化和產(chǎn)熱促進(jìn)脂肪分解。