β-內(nèi)酰胺類藥物對副豬嗜血桿菌流行病學(xué)臨界值的建立及耐藥性的測定

陳超群，陳佳莉，周萱儀，吳 雪，汪津丞，黃安雄，郝海紅

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 國家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部獸藥殘留檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家獸藥安全評價(jià)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(武漢)，武漢 430070)

副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)引起豬的一種傳染病，主要表現(xiàn)為豬的漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎，也可表現(xiàn)為肺炎、敗血癥和猝死。目前該病已呈世界性分布，并嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)。本菌具有明顯的地方性，相同血清型菌株的遺傳差異很大，故疫苗免疫效果并不理想，抗菌藥則成了副豬嗜血桿菌病治療的主要手段[1]。耐藥性分析可為臨床提供有效的抗生素治療方案，這也是本試驗(yàn)制定折點(diǎn)判定耐藥性的意義所在。

β-內(nèi)酰胺類抗生素是一類廣譜抗生素，分子結(jié)構(gòu)中都含有β-內(nèi)酰胺環(huán)，占全世界抗生素使用量的60%，是治療傳染病最有效的藥物之一[2]，根據(jù)它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)，β-內(nèi)酰胺可分為3種類型：頭孢菌素類、青霉素類和非典型β-內(nèi)酰胺類。因其安全性高、成本低、抗菌效果好[3]，是HPS感染的首選藥物，臨床上常用頭孢菌素治療，但隨著廣譜抗生素長期大量應(yīng)用，耐藥菌株和變異菌株日漸增多[4]。有研究顯示，長期使用β-內(nèi)酰胺類抗生素會(huì)損傷機(jī)體原有的免疫機(jī)制和菌群平衡，使患畜免疫力下降、耐藥性升高，嚴(yán)重影響臨床用藥效果[5]，故評價(jià)其抗菌活性，監(jiān)測其耐藥流行性對預(yù)防和治療副豬嗜血桿菌病有重要意義。

傳統(tǒng)的耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)主要分為微生物折點(diǎn)[6]、藥效學(xué)折點(diǎn)和臨床折點(diǎn)3種，用來進(jìn)行耐藥監(jiān)測和預(yù)測藥物臨床治療的有效性[7]。微生物折點(diǎn)的制定是通過抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)確定，是進(jìn)行細(xì)菌耐藥性監(jiān)測的主要手段。而藥效學(xué)折點(diǎn)主要是結(jié)合藥物的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)數(shù)據(jù)，科學(xué)的指導(dǎo)臨床用藥。臨床折點(diǎn)則是根據(jù)臨床上藥物的治療效果，來判斷藥物治療的有效性。為了避免發(fā)生混淆，歐洲藥敏試驗(yàn)聯(lián)合委員會(huì)(EUCAST)用流行病學(xué)(或野生型)臨界值代替了微生物學(xué)折點(diǎn)這個(gè)名詞[8]。而藥效學(xué)折點(diǎn)和臨床折點(diǎn)也統(tǒng)一規(guī)范為藥效學(xué)臨界值和臨床臨界值。折點(diǎn)則是由這3種臨界值共同決定，用于臨床實(shí)驗(yàn)室的最終報(bào)告[9]。流行病學(xué)臨界值(epidemiological cut-off values，ECOFFs)是用于區(qū)分野生型菌株和非野生型菌株的MIC值，CLSI將其定義為野生型折點(diǎn)(wild-type cutoff，COWT)，ECOFFs更為常用，其不考慮臨床效力，單純考察細(xì)菌對藥物的敏感性情況，主要目的是用于耐藥性表型的流行病學(xué)監(jiān)測[10]。并且由于不考慮臨床因素，所以該值相對穩(wěn)定，在一定時(shí)期內(nèi)，通常不隨樣本來源及不同地區(qū)而異，即流行病學(xué)臨界值在全世界范圍內(nèi)通用。

鑒于目前尚無確定的檢測副豬嗜血桿菌抗藥性的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和判定標(biāo)準(zhǔn)[11]，因此本課題參考CLSI中折點(diǎn)制作的方法，采用ECOFFinder程序分析流行病學(xué)折點(diǎn)，利用ScienceDirect、PubMed、NCBI、知網(wǎng)、百度學(xué)術(shù)等數(shù)據(jù)庫匯總不同國家不同地區(qū)的副豬嗜血桿菌對β-內(nèi)酰胺類藥物的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，分析得到β-內(nèi)酰胺類藥物對副豬嗜血桿菌的流行病學(xué)臨界值(ECOFF)，用于指導(dǎo)臨床合理用藥。

1 材料與方法

1.1 MIC數(shù)據(jù)收集

CLSI規(guī)定：要確定COWT，需要采集與臨床感染有關(guān)的各個(gè)種屬的細(xì)菌，并且每個(gè)種屬的細(xì)菌的數(shù)量不得少于500株。當(dāng)要確定某個(gè)藥物對單獨(dú)一個(gè)細(xì)菌種屬的 COWT時(shí)，如金黃色葡萄球菌或鮑曼氏不動(dòng)桿菌等，收集的臨床菌株滿足100株以上就足夠了。很多學(xué)者做過副豬嗜血桿菌對β-內(nèi)酰胺類藥物的藥敏試驗(yàn)，但大部分試驗(yàn)菌株數(shù)少于CLSI規(guī)定的100株，也很少有人根據(jù)MIC結(jié)果來制定折點(diǎn)，且不同學(xué)者做出來的MIC結(jié)果有時(shí)相差較大。本文匯總文獻(xiàn)里不同學(xué)者做出的MIC結(jié)果，匯總結(jié)果見表1。

表1 副豬嗜血桿菌藥敏結(jié)果匯總

1.2 繪制MIC分布圖

典型的MIC分布應(yīng)該是呈單峰分布或雙峰分布的，左峰為野生型菌株的MIC分布范圍，右峰則是非野生型菌株的MIC分布范圍，若此時(shí)兩峰的界限明顯，那么野生型菌株的MIC分布上限值，即是其流行病學(xué)折點(diǎn)[21]。如Turnidge和Paterson[22]所做的金黃色葡萄球菌-萬古霉素的MIC分布圖，呈典型的單峰分布，大腸桿菌-氨芐西林的MIC分布圖則呈雙峰分布(圖1)。而某些情況下，例如菌株MIC分布連續(xù)，雙峰分布不明顯或雙峰重疊，由于肉眼觀察法受主觀因素的影響較大，就難以確定此時(shí)的流行病學(xué)折點(diǎn)，這種情況則需采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析。

A.金黃色葡萄球菌-萬古霉素的MIC分布圖，呈典型的單峰分布；B.大腸桿菌-氨芐西林的MIC分布圖，呈雙峰分布。圖片引用自：John Turnidge：Setting and revising antibacterial susceptibility breakpoints

1.3 ECOFFs的測定

Turnidge和Paterson[22]使用非線性回歸分析的方法成功確定了多種藥物對不同細(xì)菌的ECOFFs，并表示該方法能夠較好地模擬菌株的MIC分布，有助于流行病學(xué)折點(diǎn)的建立，并利用Microsoft excel的宏功能，制作出了能夠根據(jù)菌株的MIC分布，自動(dòng)擬合并計(jì)算出菌株的流行病學(xué)折點(diǎn)的程序ECOFFinder。其原理也是根據(jù)菌株MIC分布，利用非線性回歸分析的方法對累積分布進(jìn)行擬合。與傳統(tǒng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析相比，該程序更為簡單和實(shí)用。

1.4 耐藥率的統(tǒng)計(jì)

根據(jù)ECOFFinder計(jì)算出的流行病學(xué)臨界值來統(tǒng)計(jì)本篇匯總的菌株總數(shù)里出現(xiàn)耐藥性的菌株所占的比例，可以初步反映副豬嗜血桿菌對β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥情況，為日后的耐藥監(jiān)測和真正的敏感性折點(diǎn)的建立提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1.5 耐藥機(jī)制的分析

HPS耐藥性的機(jī)制近幾年來不斷被學(xué)者研究，新的耐藥機(jī)制不斷被報(bào)道，HPS耐藥性產(chǎn)生的原因可能與藥物作用靶位的改變有關(guān)[23]。青霉素結(jié)合蛋白(penicillin-binding proteins，PBPs)是β-內(nèi)酰胺類抗生素的結(jié)合位點(diǎn)[24]。多種革蘭陰性菌中PBPs發(fā)生改變將導(dǎo)致其對β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性[25]。對92株HPS臨床分離菌的青霉素結(jié)合蛋白PBPs進(jìn)行基因克隆和測序，發(fā)現(xiàn)A類PBPsmrcA基因的3個(gè)突變位點(diǎn)和pbplB基因的5個(gè)突變位點(diǎn)可能改變了該蛋白與β-內(nèi)酰胺類抗生素的結(jié)合能力，從而降低了HPS對β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性。推測B類PBPsftsI和ftsI-2基因的突變位點(diǎn)降低了肽基轉(zhuǎn)移酶與β-內(nèi)酰胺類抗生素的結(jié)合能力；prc基因存在14個(gè)突變位點(diǎn)，影響了蛋白酶的活性，間接影響了PBPs的合成，從而對β-內(nèi)酰胺類抗生素不敏感。在低分子量PBPs中，dacA基因有4個(gè)突變位點(diǎn)，dacB基因有2個(gè)突變位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)這些突變位點(diǎn)可以降低PBPS與β-內(nèi)酰胺類抗菌藥的結(jié)合能力[26]。此外，生物被膜的形成也與耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)，Zhang等[27]對110株HPS進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),有73株菌有生物膜形成，對8種抗生素如青霉素、氨芐青霉素、阿莫西林等進(jìn)行藥敏試驗(yàn)證明了有生物膜比無生物膜菌株耐藥率更高。Feng等[28]通過測定臨床分離的HPS以及acrB/acrR突變體對多種抗菌藥的藥敏試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)acrB外排泵可以抵抗各種有毒化合物,包括抗菌藥物。另外，耐藥質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因在多重耐藥菌株間傳播轉(zhuǎn)移可能是細(xì)菌多重耐藥性產(chǎn)生的原因[29]，Moleres等[30]發(fā)現(xiàn)了新型blaROB-1質(zhì)粒,可以抵抗β-內(nèi)酰胺類藥物,并命名為pJMA-1,試驗(yàn)證明此耐藥基因可以轉(zhuǎn)移到其他細(xì)菌中。具有耐藥性的菌株即為非野生型菌株，其MIC應(yīng)當(dāng)大于折點(diǎn)值，因此，將其他學(xué)者研究得出的耐藥菌株的MIC與本文所制定的折點(diǎn)比較可以驗(yàn)證制定的折點(diǎn)是否合理真實(shí)。

2 結(jié) 果

2.1 MIC分布圖和擬合圖

將數(shù)據(jù)輸入到ECOFFinder程序中，可繪制出MIC原始數(shù)據(jù)分布直方圖及原始MIC分布數(shù)據(jù)趨勢線(三角形)，利用非線性回歸分析的方法對累積分布進(jìn)行擬合，得出一條擬合曲線(矩形)，將14種β-內(nèi)酰胺類藥物分為青霉素類藥物(圖2)、頭孢菌素類藥物(圖3)、碳青霉烯類和β-內(nèi)酰胺酶抑制劑藥物(圖4)。通過繪制14種藥物對副豬嗜血桿菌的MIC分布直方圖，可以看出菌株的MIC分布范圍較為廣泛，除頭孢氨芐和青霉素呈現(xiàn)較為典型的單峰分布外，其余都成雙峰或多峰分布，以第一個(gè)峰為界，其余峰視為非野生型菌株。有些峰和峰之間的界限不明顯或兩峰有重疊部分，無法用肉眼判斷臨界值，可以用ECOFFinder軟件計(jì)算得出ECOFFs。

A.阿莫西林；B.氨芐西林；C.青霉素；D.苯唑西林。橫坐標(biāo)為最小抑菌濃度MIC，縱坐標(biāo)為各MIC對應(yīng)的菌株數(shù)量。柱狀圖為原始MIC分布峰，三角形代表的曲線為原始MIC分布數(shù)據(jù)趨勢線；矩形代表的曲線為ECOFFinder軟件統(tǒng)計(jì)分析后的擬合趨勢線

A.頭孢克洛；B.頭孢吡肟；C.頭孢噻肟；D.頭孢喹肟；E.頭孢噻呋；F.頭孢氨芐。橫坐標(biāo)為最小抑菌濃度MIC，縱坐標(biāo)為各MIC對應(yīng)的菌株數(shù)量。柱狀圖為原始MIC分布峰，三角形對應(yīng)的曲線為原始MIC分布數(shù)據(jù)趨勢線；矩形代表的曲線為ECOFFinder軟件統(tǒng)計(jì)分析后的擬合趨勢線

A.阿莫西林-克拉維酸；B.克拉維酸；C.亞胺培南；D.美羅培南。橫坐標(biāo)為最小抑菌濃度MIC，縱坐標(biāo)為各MIC對應(yīng)的菌株數(shù)量。柱狀圖為原始MIC分布峰，三角形代表的曲線為原始MIC分布數(shù)據(jù)趨勢線；矩形代表的曲線為ECOFFinder軟件統(tǒng)計(jì)分析后的擬合趨勢線

根據(jù)分布擬合圖可以看出氨芐西林和苯唑西林呈雙峰和三峰分布，且峰與峰之間存在重疊，阿莫西林和青霉素呈不典型的單峰分布，根據(jù)軟件擬合的分布曲線可估計(jì)ECOFF值分別為4和8 μg·mL-1。

HPS對頭孢類藥物的MIC分布圖大多呈多峰分布，用肉眼觀察法都比較難確定ECOFF值，需要用ECOFFinder確定。

阿莫西林-克拉維酸和亞胺培南呈比較好的單峰分布，而克拉維酸由于匯總菌株較少，使得原始MIC分布圖不完整，肉眼無法判斷臨界值。

2.2 ECOFFs值

將數(shù)據(jù)輸入到ECOFFinder程序中可計(jì)算出ECOFF值(表2)。

ECOFFinder軟件可以根據(jù)菌株的MIC分布，自動(dòng)計(jì)算出不同置信區(qū)間下的ECOFF值，表2的ECOFF數(shù)據(jù)可以快速地識(shí)別非野生型菌株的出現(xiàn)，頭孢氨芐的ECOFF值最大，頭孢喹肟的ECOFF值最小。

表2 14種藥物對副豬嗜血桿菌的ECOFF值

2.3 耐藥率的計(jì)算

根據(jù)ECOFFinder計(jì)算得出的以99%為置信度的ECOFF值作為判定菌株耐藥的標(biāo)準(zhǔn)來計(jì)算匯總菌株中的耐藥率，結(jié)果見表3。

表3可以直觀地反映出國內(nèi)外的HPS對β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥情況，氨芐西林的耐藥率最高，亞胺培南和阿莫西林-克拉維酸的耐藥率最低，阿莫西林和青霉素的國內(nèi)外差異較大，氨芐西林的國內(nèi)外耐藥率相近。

表3 副豬嗜血桿菌的耐藥率(以99%ECOFF值為臨界值)

3 討 論

3.1 研究方法的可行性

根據(jù)CLSI推薦，用ECOFFinder程序分析得出了β-內(nèi)酰胺類藥物14種抗生素的流行病學(xué)折點(diǎn)。在國內(nèi)，傅嘉莉[21]用函數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法和ECOFFinder方法分別對363株雞呼吸道源大腸桿菌的MIC進(jìn)行分析，得出兩種方法分析得到的流行病學(xué)折點(diǎn)一致，雷志鑫[31]在制定泰地羅新對副豬嗜血桿菌的ECOFFs時(shí)驗(yàn)證了ECOFFinder方法的可行性，表明該軟件計(jì)算結(jié)果可靠，更加方便快捷，推薦使用。在國外，Baron等[32]用“Turnidge方法”和“Kronvall方法”(即ECOFFInder電子表格方法)計(jì)算了氣單胞菌對14種抗菌藥物的流行病學(xué)折點(diǎn)，結(jié)果完全一致或僅有一個(gè)稀釋度的差異。Cantón等[33]分析發(fā)現(xiàn)，使用不同方法所制定的ECOFFs大致相同。說明Turnidge和Paterson[22]的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析和ECOFFinder程序分析對于流行病學(xué)折點(diǎn)的建立都是可行的。

3.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較

本研究計(jì)算得出的阿莫西林的MIC50和MIC90與Zhou等[12]獲得的相同，與張悅[20]計(jì)算得出的結(jié)果也一致，MIC90較汪清峰[19]做的44株菌的結(jié)果相比偏高了1個(gè)稀釋度，分析原因可能是因?yàn)橥羟宸逅鼍陻?shù)較少，所以有一定的偏差。對于青霉素，本研究匯總516株菌后計(jì)算得出的MIC50為0.5 μg·mL-1，MIC90為4 μg·mL-1，吳佳琪[16]和張悅[20]關(guān)于青霉素的結(jié)果一致，MIC50為0.5 μg·mL-1，MIC90為1 μg·mL-1，但是Zhao等[13]從中國各地區(qū)共分離143株菌后做出來的藥敏結(jié)果顯示MIC50為1 μg·mL-1，MIC90為256 μg·mL-1，分析原因是張悅分離的菌株是上海地區(qū)的，吳佳琪[16]分離的菌株是廣州的，Zhao等[13]所用菌株是從中國東南西北中部各個(gè)地區(qū)分離得到的。不同地區(qū)分離株的藥敏結(jié)果差異較大，這也說明了本研究匯總不同來源的菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果的工作具有重要意義，制定的折點(diǎn)也更具有代表性和說服力，同時(shí)也反映了隨著青霉素在臨床上的持續(xù)應(yīng)用，副豬嗜血桿菌的敏感性也隨之降低。

3.3 ECOFFs值比較

由于CLSI和EUCAST并未對副豬嗜血桿菌的流行病學(xué)折點(diǎn)制定標(biāo)準(zhǔn)，在相關(guān)文獻(xiàn)中也很少有研究β-內(nèi)酰胺類藥物對副豬嗜血桿菌的ECOFFs，因此在這里參考CLSI中對副流感嗜血桿菌制定的標(biāo)準(zhǔn)來對比本研究制定的折點(diǎn)值。EUCAST建議，不低于99.0%的ECOFF可能更準(zhǔn)確，因?yàn)樗鼉A向于在野生型菌株的上端考慮臨界值，將更多的野生型菌株包含在制定的野生型范圍內(nèi)。本研究制定的氨芐西林的99.9%ECOFF為4 μg·mL-1，與CLSI中制定的判定副流感嗜血桿菌耐藥的標(biāo)準(zhǔn)值≥ 4 μg·mL-1結(jié)果一致。根據(jù)CLSI的解釋，氨芐西林的藥敏結(jié)果能用于預(yù)測阿莫西林的敏感性，所以制定的氨芐西林的99.9%ECOFF為4 μg·mL-1也符合標(biāo)準(zhǔn)。CLSI中對頭孢克洛的耐藥范圍作出了規(guī)定，即≥32 μg·mL-1，與本研究制定的頭孢克洛99.9%ECOFF相似，本研究制定的阿莫西林/克拉維酸的99.9%ECOFF為1 μg·mL-1，比CLSI中制定的耐藥標(biāo)準(zhǔn)低2個(gè)稀釋度，分析原因可能是本研究匯總的菌株數(shù)較少。在亞胺培南、克拉維酸和阿莫西林/克拉維酸的折點(diǎn)制定過程中，匯總的菌株數(shù)少于CLSI建議的100個(gè)分離株，但都多于建議的最少30個(gè)分離株形成高斯分布的建議數(shù)量，因此對亞胺培南、克拉維酸和阿莫西林/克拉維酸制定的ECOFFs可能會(huì)存在偏差，但是在CLSI未制定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)也有一定的參考價(jià)值，頭孢噻肟參考CLSI有關(guān)胸膜肺炎與睡眠嗜血桿菌的標(biāo)準(zhǔn)[34]，即耐藥菌株MIC≥4 μg·mL-1，而本文制定的99.9%ECOFF為0.5 μg·mL-1，相差了3個(gè)稀釋度，推測原因可能是HPS與胸膜肺炎和睡眠嗜血桿菌存在一定的差異，耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)不能完全適用。其余的β-內(nèi)酰胺類藥物在CLSI中并未有標(biāo)準(zhǔn)可以參考。整體來看，本研究制定的流行病學(xué)折點(diǎn)是有科學(xué)依據(jù)和一定參考價(jià)值的。

3.4 耐藥率比較

根據(jù)本研究得出的折點(diǎn)計(jì)算匯總菌株總的耐藥率發(fā)現(xiàn)HPS對氨芐西林、阿莫西林以及頭孢吡肟出現(xiàn)了較高的耐藥性，分別為16.3%、15.4%、15.4%，而對亞胺培南、阿莫西林-克拉維酸以及克拉維酸的耐藥率則處于較低水平。由于本研究匯總的國外菌株數(shù)較少，大多菌株都是來自國內(nèi)不同地區(qū)(如上海、廣州等地)，因此國內(nèi)外的耐藥率存在較大偏差。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，全國各地的副豬嗜血桿菌對大多數(shù)藥物都產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，從2013—2019年，貴州分離株對頭孢噻呋的耐藥率提高了324.68%，對青霉素的耐藥率上升了8.25%，對阿莫西林的耐藥率上升了4.76%[35]。西班牙和英國分離菌株對頭孢噻肟和頭孢噻呋的敏感率均為90%以上[36]；我國各地臨床分離菌株對氨芐西林、頭孢噻呋、頭孢喹肟的耐藥率分別為39.4%、5.8%和1.9%[37]。我國廣東分離菌株對頭孢噻呋和頭孢噻肟均表現(xiàn)出較好的敏感性，對氨芐西林的耐藥率為22.1%[38]。以上研究均表明副豬嗜血桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素較為敏感，但隨著藥物的不合理使用，使得β-內(nèi)酰胺類藥物已經(jīng)出現(xiàn)不同程度的耐藥性。

3.5 耐藥機(jī)制的反饋驗(yàn)證

同時(shí)，耐藥菌株的MIC值應(yīng)當(dāng)大于制定的折點(diǎn)值，萬銹琳[39]對1株多重耐藥副豬嗜血桿菌(HPS-1)與敏感菌株(HPS-2)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，HPS-1由于含有blaROB-1特異耐藥基因?qū)е翲PS-1對β-內(nèi)酰胺類藥物產(chǎn)生耐藥性，而HPS-1對苯唑西林的MIC為256 μg·mL-1，大于本文制定的折點(diǎn)值8 μg·mL-1，HPS-2對苯唑西林的MIC為2 μg·mL-1，在野生型菌株的MIC范圍內(nèi)，符合本文制定的ECOFF。Zhao等[13]對生物被膜陽性和生物被膜陰性的HPS進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，生物被膜陽性的HPS對頭孢氨芐、頭孢吡肟、頭孢噻夫和氨芐西林的MIC范圍大于512 μg·mL-1，對阿莫西林的MIC為0.25～64.00 μg·mL-1，也基本符合本文制定的判定標(biāo)準(zhǔn)。制定的頭孢克洛的折點(diǎn)為16 μg·mL-1，Millan等[40]發(fā)現(xiàn)所有耐β-內(nèi)酰胺類藥物的副豬嗜血桿菌對頭孢克洛都有很高的抗性，MIC>16 μg·mL-1，也進(jìn)一步說明了本文制定的耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)合理有效。

4 結(jié) 論

目前，CLSI和EUCAST都未對HPS制定耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)，本文匯總了前人的研究數(shù)據(jù)，采取了科學(xué)有效的折點(diǎn)制定方法，制定了14種β-內(nèi)酰胺類藥物的ECOFFs，并對比了CLSI中副流血嗜血桿菌的耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)來驗(yàn)證本研究制定折點(diǎn)的合理性。根據(jù)所制定的野生型折點(diǎn)計(jì)算所匯總菌株里的耐藥率，可以識(shí)別非野生型菌株的出現(xiàn)，有利于耐藥性監(jiān)測工作的開展。本課題頭孢吡肟、苯唑西林、氨芐西林以及阿莫西林的耐藥率較高。有些單峰分布或雙峰分布界限明顯的MIC分布圖可以較為直觀地幫助肉眼判斷非野生型菌株，如亞胺培南、青霉素。在這項(xiàng)研究中獲得的折點(diǎn)值不應(yīng)視為官方解釋標(biāo)準(zhǔn)，復(fù)雜的環(huán)境變化和細(xì)菌的不斷突變要求人們使用多種多樣的分離株來提供更精確的估算值，不斷更新ECOFFs來監(jiān)測細(xì)菌的耐藥性，指導(dǎo)臨床合理用藥。