維生素K3對(duì)14日齡北京鴨凝血時(shí)間和維生素K依賴蛋白的影響

申仲健，郝永勝，吳永保，張 博，唐 靜，侯水生，謝 明

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

維生素K是動(dòng)物體生命活動(dòng)不可缺少的一種脂溶性維生素[1-2]，畜牧業(yè)中常用維生素K3作為畜禽維生素K補(bǔ)充劑[3]。維生素K具有多種生理功能，如參與凝血過(guò)程[4]、維持骨代謝穩(wěn)態(tài)[5]、抑制血管鈣化[6]等，其中，凝血作用是維生素K最經(jīng)典也是最基本的生理作用。臨床研究上常用凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)和凝血酶時(shí)間(thrombin time，TT)的長(zhǎng)短診斷是否存在凝血功能障礙[7]，當(dāng)機(jī)體缺乏維生素K時(shí)，部分凝血酶原無(wú)法活化將導(dǎo)致PT延長(zhǎng)[8]。維生素K主要通過(guò)參與羧化維生素K依賴蛋白發(fā)揮生理作用，此過(guò)程中維生素K作為γ-谷氨酸羧化酶的輔助因子將維生素K依賴蛋白的特定谷氨酸殘基轉(zhuǎn)化為羧基谷氨酸殘基[9]。目前，已發(fā)現(xiàn)多種維生素K依賴蛋白，如與凝血功能相關(guān)的凝血酶原前體蛋白(protein induced in the vitamin K absence or antagonism-factor II，PIVKA-II)[4]、與骨代謝中成骨細(xì)胞活性相關(guān)的骨鈣素(osteocalcin，OC)[10]、與血管鈣化及軟骨發(fā)育相關(guān)的基質(zhì)Gla蛋白(matrix gamma-carboxyglutamate protein，MGP)[11]，三種維生素K依賴蛋白在血液循環(huán)中的羧化不全形式常被用來(lái)評(píng)價(jià)機(jī)體凝血功能[12]、預(yù)測(cè)骨折[13]和血管鈣化[14]風(fēng)險(xiǎn)，同樣也可以作為評(píng)價(jià)維生素K營(yíng)養(yǎng)狀況的參照指標(biāo)。美國(guó)NRC(1994)家禽營(yíng)養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)和中國(guó)肉鴨飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(2012)中推薦不同生長(zhǎng)階段北京鴨維生素K營(yíng)養(yǎng)需要量分別為0.5和2.0 mg·kg-1，但目前尚未發(fā)現(xiàn)肉鴨維生素K試驗(yàn)研究作為理論支撐。同時(shí)，家禽飼糧中維生素K3實(shí)際添加量往往是美國(guó)NRC(1994)推薦量的數(shù)倍[15]。因此，本試驗(yàn)通過(guò)研究不同添加水平維生素K3對(duì)14日齡北京鴨凝血時(shí)間和維生素K依賴蛋白的影響，探討血液中反映肉鴨維生素K營(yíng)養(yǎng)狀況的敏感指標(biāo)，并采用折線模型估算育雛期北京鴨飼糧維生素K3適宜添加量，為肉鴨飼料配制中維生素K的合理有效使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼糧

試驗(yàn)采用玉米-大豆分離蛋白型飼糧為基礎(chǔ)飼糧，飼料原料常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分參考中國(guó)飼料成分及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值表(2018)，基礎(chǔ)飼糧營(yíng)養(yǎng)水平參考中國(guó)肉鴨飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(2012)，飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。試驗(yàn)采用單因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)在基礎(chǔ)飼糧中添加6個(gè)不同水平的亞硫酸氫鈉甲萘醌(0、0.98、1.96、3.92、5.88和7.84 mg·kg-1，甲萘醌含量為51%)配制成6種維生素K3添加水平(0、0.5、1、2、3和4 mg·kg-1)的試驗(yàn)飼糧。將180只1日齡健康雄性北京鴨按照每處理每重復(fù)鴨只初始體重基本一致的原則隨機(jī)分為6個(gè)處理，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，每重復(fù)6只鴨，試驗(yàn)期為14 d。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)鴨網(wǎng)上平養(yǎng)，自由飲水，自由采食相應(yīng)的試驗(yàn)飼糧，24 h光照，育雛期舍內(nèi)溫度從1日齡32 ℃逐漸降低至14日齡26 ℃，每隔兩天通過(guò)調(diào)整供暖設(shè)備溫度和通風(fēng)量的方式下調(diào)舍內(nèi)溫度1 ℃左右。

1.3 生長(zhǎng)性能測(cè)定

于14日齡，稱(chēng)取各處理組各重復(fù)鴨只空腹體重和剩余飼料重，計(jì)算1～14日齡鴨平均日增重(average daily gain，ADG)、平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)和料重比(feed/gain，F(xiàn)/G)。

1.4 凝血時(shí)間測(cè)定

于14日齡，從每處理每重復(fù)隨機(jī)挑選試驗(yàn)鴨2只，使用無(wú)抗凝劑真空采血管頸靜脈采血5 mL，立即精確吸取全血2.7 mL置于裝有0.3 mL枸櫞酸鈉溶液的離心管中，3 500 r·min-1離心15 min，分離血漿，-80 ℃保存，并使用上海太陽(yáng)UP1500全自動(dòng)凝血分析儀測(cè)定PT、APTT和TT。

1.5 血清維生素K依賴蛋白測(cè)定

采血管中剩余血液制備血清，于-20 ℃保存，用于測(cè)定血清PIVKA-II、羧化不全骨鈣素(undercarboxylated osteocalcin，ucOC)和羧化不全基質(zhì)Gla蛋白(undercarboxylated matrix Gla protein，ucMGP)含量，三種血清維生素K依賴蛋白含量均采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定，使用BiotekEpoch酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，并根據(jù)吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中維生素K依賴蛋白含量。分別采用上海酶聯(lián)公司生產(chǎn)的PIVKA-II、ucOC試劑盒和江蘇酶免公司生產(chǎn)的ucMGP試劑盒進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，使用SAS 9.4軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，按照單因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)用GLM程序進(jìn)行方差分析，運(yùn)用Duncan氏法進(jìn)行組間的多重比較，并且采用折線模型擬合曲線從而預(yù)測(cè)維生素K3需要量。

2 結(jié) 果

2.1 不同維生素K3添加水平對(duì)1～14日齡北京鴨生長(zhǎng)性能的影響

如表2所示，各處理組之間ADG、ADFI和F/G均無(wú)顯著差異，因此飼糧中添加不同水平維生素K3對(duì)1～14日齡北京鴨ADG、ADFI和F/G均未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。

表2 不同維生素K3添加水平對(duì)1～14日齡北京鴨生長(zhǎng)性能的影響

2.2 不同維生素K3添加水平對(duì)14日齡北京鴨凝血時(shí)間的影響

如表3所示，0和0.5 mg·kg-1維生素K3添加組PT顯著高于2、3、4 mg·kg-1維生素K3添加組(P<0.05)；不同維生素K3添加水平對(duì)APTT和TT均未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。

表3 不同維生素K3添加水平對(duì)14日齡北京鴨凝血時(shí)間的影響

2.3 不同維生素K3添加水平對(duì)14日齡北京鴨血清維生素K依賴蛋白的影響

如表4所示，0 mg·kg-1維生素K3添加組血清PIVKA-II含量顯著高于其他組(P<0.05)；0 mg·kg-1維生素K3添加組血清ucOC含量顯著高于2、3、4 mg·kg-1維生素K3添加組(P<0.05)；不同維生素K3添加水平對(duì)血清ucMGP含量未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。

表4 不同維生素K3添加水平對(duì)14日齡北京鴨血清維生素K依賴蛋白的影響

2.4 1～14日齡北京鴨維生素K3需要量估算

如表5所示，采用折線模型估算1～14日齡北京鴨維生素K3需要量，以PT、血清PIVKA-II和ucOC含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)估算結(jié)果分別為2.00、0.56和1.27 mg·kg-1。

表5 折線模型估算1～14日齡北京鴨維生素K3需要量

3 討 論

3.1 不同維生素K3添加水平對(duì)1～14日齡北京鴨生長(zhǎng)性能的影響

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加維生素K3對(duì)各類(lèi)畜禽及魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)性能的影響較為有限，試驗(yàn)結(jié)果基本一致。Marchetti等[3]在生長(zhǎng)育肥豬飼糧中添加不同水平的維生素K3，與未添加維生素K3的對(duì)照組相比，添加維生素K3組生長(zhǎng)豬ADG、ADFI、F/G均無(wú)顯著差異；Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，提高飼糧維生素K3添加水平對(duì)1～5周齡肉雞生長(zhǎng)性能無(wú)顯著影響；Cheng等[17]在魚(yú)類(lèi)上的研究也表明，飼糧中添加維生素K3無(wú)法顯著提高大黃魚(yú)的生長(zhǎng)速率。目前尚無(wú)飼糧添加維生素K3對(duì)肉鴨生長(zhǎng)性能的研究，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在玉米-大豆分離蛋白型基礎(chǔ)飼糧中添加不同水平維生素K3對(duì)1～14日齡北京鴨ADG、ADFI和F/G均無(wú)顯著影響，這與上述維生素K3對(duì)不同動(dòng)物生長(zhǎng)性能無(wú)顯著影響的研究結(jié)果相符。因此，評(píng)價(jià)肉鴨維生素K營(yíng)養(yǎng)狀況還需要從維生素K對(duì)動(dòng)物生理生化方面的影響為切入點(diǎn)進(jìn)一步深入探究。

3.2 不同維生素K3添加水平對(duì)14日齡北京鴨凝血時(shí)間的影響

維持機(jī)體正常凝血功能是維生素K最早被發(fā)現(xiàn)的生理功能，維生素K因此也被稱(chēng)為凝血性維生素[18]，在臨床研究上常用PT、APTT和TT作為評(píng)價(jià)凝血時(shí)間的檢測(cè)指標(biāo)[7]，其中PT延長(zhǎng)是由凝血酶原的缺乏導(dǎo)致的凝血時(shí)間延長(zhǎng)，而維生素K與凝血酶原的活化有著直接的聯(lián)系，因此，PT相較于另外兩種凝血指標(biāo)能夠更加準(zhǔn)確地反映由維生素K缺乏導(dǎo)致的凝血時(shí)間延長(zhǎng)的情況[8,19-20]。Ferland等[21]通過(guò)給雄性小鼠飼喂不同維生素K水平的飼糧，發(fā)現(xiàn)飼喂低維生素K水平飼糧組的小鼠PT較高維生素K水平組延長(zhǎng)，但小鼠體重?zé)o顯著差異。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著飼糧維生素K3添加水平的降低PT顯著延長(zhǎng)，APTT和TT無(wú)顯著變化。這一結(jié)果表明，飼糧低維生素K3添加水平組中14日齡北京鴨由于維生素K缺乏導(dǎo)致PT延長(zhǎng)，需要在基礎(chǔ)飼糧中添加維生素K3增強(qiáng)育雛期肉鴨的凝血功能。

3.3 不同維生素K3添加水平對(duì)14日齡北京鴨血清維生素K依賴蛋白的影響

維生素K發(fā)揮其生理生化作用的方式主要是通過(guò)作為γ-谷氨酸羧化酶的輔助因子參與羧化反應(yīng)使維生素K依賴蛋白活化，獲得生理活性[1]，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的維生素K依賴蛋白主要包括PIVKA-II、骨鈣素和基質(zhì)Gla蛋白[22]。PIVKA-II也被用于評(píng)價(jià)機(jī)體凝血功能和維生素K營(yíng)養(yǎng)狀況[4, 20]，PIVKA-II經(jīng)維生素K羧化為具有生物活性的凝血酶原，從而參與凝血過(guò)程。研究表明，維生素K攝入量與血清PIVKA-II水平呈高度負(fù)相關(guān)[23]，本試驗(yàn)結(jié)果也顯示，飼糧添加維生素K3可顯著降低14日齡北京鴨血清PIVKA-II水平。

骨鈣素作為骨形成標(biāo)志物，同時(shí)是維生素K依賴蛋白，在骨骼礦化的生理過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[24]，骨鈣素由成骨細(xì)胞分泌后部分進(jìn)入血液，當(dāng)體內(nèi)缺乏維生素K時(shí)，部分骨鈣素?zé)o法羧化，失去結(jié)合羥基磷灰石能力[25-26]。Vergnaud等[27]研究發(fā)現(xiàn)，ucOC水平伴隨著衰老會(huì)逐漸升高，并與骨折風(fēng)險(xiǎn)顯著正相關(guān)；也有研究表明，在飲食中補(bǔ)充維生素K，血清ucOC水平較未補(bǔ)充組顯著降低，增強(qiáng)骨形成，降低骨吸收能力[28]；ELISA法測(cè)定血清ucOC水平可預(yù)測(cè)中老年婦女髖骨骨折風(fēng)險(xiǎn)[13]。因此，血清ucOC水平也能夠方便和靈敏地評(píng)價(jià)維生素K營(yíng)養(yǎng)狀況。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧添加維生素K3可顯著降低血清ucOC含量，間接促進(jìn)肉鴨骨骼發(fā)育并降低骨折風(fēng)險(xiǎn)。

基質(zhì)Gla蛋白也是一種維生素K依賴蛋白，主要在軟骨細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)和產(chǎn)生[29]，羧化基質(zhì)Gla蛋白通過(guò)與鈣晶體結(jié)合抑制異位礦化，在血管和軟骨中起到抑制鈣化的作用[30]，機(jī)體缺乏維生素K可能會(huì)導(dǎo)致患心血管疾病[11]。Cranenburg等[14]發(fā)現(xiàn)，患有心血管疾病或有血管鈣化傾向的患者，其循環(huán)ucMGP水平明顯較低。同樣地，Silaghi等[31]采用ELISA法測(cè)定血清ucMGP含量，發(fā)現(xiàn)膝關(guān)節(jié)炎患者血清ucMGP水平顯著低于非炎癥組。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧添加維生素K3對(duì)14日齡北京鴨血清ucMGP含量無(wú)顯著影響，這可能與機(jī)體維生素K缺乏程度未導(dǎo)致血管鈣化和軟骨異位鈣化有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

3.4 1～14日齡北京鴨維生素K3需要量的確定

PT和PIVKA-II均能較好地反映機(jī)體的凝血功能[7]，血清ucOC水平常被用來(lái)評(píng)估骨折風(fēng)險(xiǎn)[13]。本試驗(yàn)采用上述三個(gè)指標(biāo)進(jìn)行折線模型擬合需要量，結(jié)果顯示，以PT和血清PIVKA-II為評(píng)價(jià)指標(biāo)擬合曲線的P值小于0.05，PT作為評(píng)價(jià)指標(biāo)估算維生素K3需要量為2.00 mg·kg-1，在此維生素K3添加水平下肉鴨血清PIVKA-II和ucOC可維持較低水平。因此，以PT為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用折線模型估測(cè)1～14日齡北京鴨維生素K3需要量為2.00 mg·kg-1。

4 結(jié) 論

提高飼糧維生素K3添加水平可顯著提高肉鴨凝血功能，降低PIVKA-II、ucOC等維生素K依賴蛋白水平，并且以PT為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用折線模型估測(cè)1～14日齡北京鴨維生素K3需要量為2.00 mg·kg-1。