穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑對(duì)人工感染大腸桿菌致肉雞腹瀉的藥效評(píng)價(jià)

李江北，楊 霞，傅嘉莉，李美娣，邱 電，陳建新，武 力

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 廣東省獸藥研制與安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642)

雞大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的一種常見(jiàn)的多發(fā)性傳染病[1]，可發(fā)生于各日齡雞群，該病嚴(yán)重影響雞的成活率及生長(zhǎng)性能，已成為制約我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展的重要疫病[2]。大腸桿菌性腹瀉是雞大腸桿菌病的其中一種類(lèi)型，是腸毒素性大腸桿菌ETEC入侵機(jī)體后，在小腸中定殖并釋放出腸毒素，從而引起嚴(yán)重的腹瀉[3]，發(fā)病雞只還表現(xiàn)精神沉郁、食欲減退或廢絕[4]、體溫升高、體重下降等癥狀[5]。該病發(fā)病率高達(dá) 29%～71%，病死率可達(dá) 4%～42%[6]。由于多年來(lái)抗生素在雞養(yǎng)殖業(yè)上的長(zhǎng)期、廣泛使用，使得細(xì)菌耐藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重[7]，現(xiàn)有抗生素難以有效防控該疾病，抗生素替代物的開(kāi)發(fā)已逐漸成為雞養(yǎng)殖業(yè)的迫切需求和研究熱點(diǎn)[8]。臨床實(shí)踐表明，穿心蓮及復(fù)方制劑對(duì)腹瀉有較好的防治效果，并具有低殘留、低毒性、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)[9]。曹雨辰等[10]發(fā)現(xiàn)，以苦參和穿心蓮為主要藥材制備的“參蓮口服液”對(duì)臨床生長(zhǎng)豬和肉雞的腹瀉具有顯著療效；嚴(yán)永武等[11-12]報(bào)道，穿心蓮末灌服對(duì)綿羊腹瀉具有顯著療效；Li等[13]研究表明，蓮香散能降低大腸桿菌感染肉雞的死亡率，改善肉雞生長(zhǎng)性能。但由于穿心蓮質(zhì)量容易因產(chǎn)地、氣候、耕作條件及加工方式的不同而發(fā)生變化，從而影響穿心蓮提取物及復(fù)方的質(zhì)量和藥效的穩(wěn)定性[14-15]。以穿心蓮活性成分為原料的獸藥制劑具有有效成分確切可控，療效穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，因而比穿心蓮及其復(fù)方具有更好的應(yīng)用前景[16]。

穿心蓮內(nèi)酯是清熱解毒類(lèi)中藥穿心蓮的主要有效成分[17]，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、降糖、降壓等藥理活性[18]，對(duì)細(xì)菌性與病毒性上呼吸道感染及細(xì)菌性痢疾有顯著療效，被譽(yù)為“天然抗生素藥物”[19]。張程亮等[20]研究發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯可改善由瀉葉和蓖麻油導(dǎo)致的小鼠腹瀉；Guo等[21]報(bào)道，穿心蓮內(nèi)酯可通過(guò)干擾細(xì)菌群體感應(yīng)降低禽致病性大腸桿菌及其毒素對(duì)雞Ⅱ型肺細(xì)胞的損傷。但穿心蓮內(nèi)酯對(duì)雞大腸桿菌腹瀉的治療未見(jiàn)報(bào)道。人醫(yī)上，穿心蓮內(nèi)酯有滴丸、分散片、軟膠囊等制劑[22]，但獸醫(yī)上只批準(zhǔn)穿心蓮內(nèi)酯作為原料藥，尚沒(méi)有任何獸用制劑獲得批準(zhǔn)，阻礙了該藥的臨床應(yīng)用[23]。本試驗(yàn)依據(jù)穿心蓮內(nèi)酯的理化性質(zhì)研制出穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑，評(píng)價(jià)該干混懸劑對(duì)肉雞大腸桿菌感染的臨床藥效，為穿心蓮內(nèi)酯抗肉雞大腸桿菌感染的臨床使用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要藥品與試劑 穿心蓮內(nèi)酯購(gòu)于四川恒瑞通達(dá)生物科技有限公司，尿素購(gòu)于福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司，變性淀粉購(gòu)于安徽華明太合生物工程有限公司，微晶纖維素-羧甲基纖維素鈉(CL-611)購(gòu)于杜邦營(yíng)養(yǎng)與生物科技，LB瓊脂和肉湯購(gòu)于廣東凱微生物科技有限公司，粘菌素由清遠(yuǎn)容大生物工程有限公司贈(zèng)送，血清生化試劑盒購(gòu)于邁瑞生物醫(yī)療電子有限公司，丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)菌株 產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌ETECO101，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院藥理教研室曾振靈教授課題組贈(zèng)送。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 1日齡嶺南黃快長(zhǎng)型商品代肉雞，由溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司提供。

1.1.4 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院的試驗(yàn)雞舍內(nèi)進(jìn)行，試驗(yàn)雞采用籠養(yǎng)方式。試驗(yàn)開(kāi)始前1周對(duì)雞舍進(jìn)行全面清掃消毒。試驗(yàn)初始溫度保持在33 ℃，隨后每周降2～3 ℃，最后維持在24～26 ℃；相對(duì)濕度保持在65%～75%。試驗(yàn)期間雞自由采食及飲水，給藥期間確保藥水飲完后再自由飲水。按照常規(guī)程序免疫，定期進(jìn)行消毒，人工定時(shí)清糞，保持雞舍環(huán)境衛(wèi)生，每日觀察和記錄雞群健康狀況、死亡情況，及時(shí)清除死亡雞只。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑的制備 稱(chēng)取13 g尿素置于燒杯中，加入200 mL水?dāng)嚢柚寥芙猓缓蠹尤?3 g變性淀粉攪拌至溶解，再加入4 g微晶纖維素-羧甲基纖維素鈉(CL-611)，高速剪切機(jī)以12 000 r·min-1轉(zhuǎn)速乳化10 min。稱(chēng)取10 g穿心蓮內(nèi)酯原料藥加入溶液中攪拌至均勻分散，高速剪切機(jī)以12 000 r·min-1轉(zhuǎn)速乳化10 min。所得含藥混懸液在高壓均質(zhì)機(jī)低壓200～300 bar下循環(huán)5次，依次逐漸加壓至400、600、800和1 000 bar的壓力下各循環(huán)5次，然后以壓力1 200 bar循環(huán)20次，制得穿心蓮內(nèi)酯混懸液。以300 mL穿心蓮內(nèi)酯混懸液為基量，出風(fēng)溫度100 ℃，進(jìn)風(fēng)溫度180 ℃和進(jìn)料速度14 mL·min-1進(jìn)行噴霧干燥，得到穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑。

1.2.2 菌種制備 取-70 ℃冷凍儲(chǔ)存的受試細(xì)菌ETECO101接種于LB平板，并于 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，使其長(zhǎng)出合適大小的單菌落；挑取單菌落菌株接種于錐形瓶?jī)?nèi)100 mL LB肉湯中，置于 37 ℃、210 r·min-1轉(zhuǎn)速的搖床中振蕩培養(yǎng)12 h，使細(xì)菌生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，4 ℃預(yù)冷離心機(jī)內(nèi)1 500 ×g離心8 min，棄掉上清液，然后用生理鹽水重懸稀釋?zhuān)咕鹤罱K含菌量大約為 5 × 108cfu·mL-1，備用。

1.2.3 動(dòng)物分組與試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將1日齡嶺南黃快長(zhǎng)型商品代肉雞飼養(yǎng)至12日齡，選取健康試驗(yàn)雞300只，隨機(jī)分為5個(gè)組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15只。第1組為空白對(duì)照組(CON組)，第2組為大腸桿菌攻毒組(ETECO101組)，第3、4、5組均為大腸桿菌攻毒加受試藥物組。分別在第3、4試驗(yàn)組雞的飲水中添加穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑(AG)，使得飲水中藥物濃度分別為100和200 mg·L-1，在第5組試驗(yàn)組雞的飲水中添加粘菌素(colistin, CS)，藥物濃度為60 mg·L-1。提前3 d連續(xù)給藥直至攻菌后第3天停止給藥，早、晚各給藥1次，每次每個(gè)重復(fù)700 mL。于肉雞15日齡攻毒，除空白對(duì)照組外，各組腹腔注射0.2 mL含5×108cfu·mL-1ETECO101的生理鹽水，空白對(duì)照組腹腔注射0.2 mL 生理鹽水。其中，每組3個(gè)重復(fù)(3×15只，以每個(gè)重復(fù)為單位)用于計(jì)算存活率、糞便評(píng)分、平均日增重和平均日采食量，以評(píng)價(jià)藥物的藥效，試驗(yàn)至感染后第7天結(jié)束；每組剩余的1個(gè)重復(fù)(15只)于攻菌后24 h和第5天分別取6只雞進(jìn)行采血、剖檢和組織取樣。具體分組及處理見(jiàn)表1。

表1 動(dòng)物分組與試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

1.3 樣品采集及指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 存活率及生長(zhǎng)性能 在ETECO101感染后以每個(gè)重復(fù)為單位每天記錄死亡率、體重和采食量，通過(guò)平均日采食量(ADFI)和平均日增重(ADG)計(jì)算飼料/增重比(FCR)。

1.3.2 腹瀉 在ETECO101感染后24和36 h，通過(guò)觀察糞便形態(tài)，判定腹瀉評(píng)分，分為4個(gè)等級(jí)(表2)：0-正常，無(wú)拉稀，糞便正常，形狀規(guī)則；1-輕微，糞便周?chē)幸蝗?，形狀?guī)則；2-中等，拉稀，糞便水樣，形狀無(wú)規(guī)則；3-嚴(yán)重，拉稀嚴(yán)重，糞便水樣噴射狀，帶血絲，形狀無(wú)規(guī)則。并根據(jù)評(píng)分系統(tǒng)，由與試驗(yàn)無(wú)關(guān)人員進(jìn)行盲評(píng)，通過(guò)糞便得分進(jìn)行腹瀉判定。

表2 肉雞腹瀉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.3 血清及組織樣本采集 在細(xì)菌感染后24 h 和第5天，每組的第4個(gè)重復(fù)中隨機(jī)選取6只肉雞，通過(guò)翼靜脈穿刺收集血液樣本，收集到真空采血管(5 mL)中，靜置30 min，然后將血樣在3 000×g4 ℃下離心15 min以收集血清，并在-80 ℃下儲(chǔ)存以備分析。處死后取空腸用冰冷的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗，并固定在4%多聚甲醛中以進(jìn)行組織學(xué)分析。脾和法氏囊組織稱(chēng)重，并將肝固定在4%多聚甲醛中以進(jìn)行組織學(xué)分析。

1.3.4 免疫器官指數(shù) 通過(guò)稱(chēng)量所采脾和法氏囊的重量，計(jì)算出各個(gè)器官的免疫指數(shù)，計(jì)算公式如下:

1.3.5 腸道形態(tài) 將小腸組織置于4%的多聚甲醛溶液中固定2 d后，用石蠟包埋，然后用切片機(jī)切成厚度為5～10 μm的圓形切片，將切片用蘇木精和曙紅染色以觀察腸道形態(tài)。測(cè)量每個(gè)樣品5個(gè)定向良好的隱窩-絨毛單位的絨毛高度和隱窩深度，并計(jì)算絨毛高度與隱窩深度之比。

1.3.6 血清生化指標(biāo) 采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、尿素(UREA)、葡萄糖(GLU)和肌酐(CREA)含量。

1.3.7 血清氧化應(yīng)激狀態(tài) 使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒測(cè)定血清中丙二醛(MDA)的含量，測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 8中的方差分析(ANOVA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，然后采用T test比較對(duì)照組與所有其他組。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05表示具有顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 臨床特征與死亡情況

ETECO101感染后，與正常組相比，發(fā)病雞精神沉郁，羽毛雜亂，嚴(yán)重者靜臥嗜睡、抱團(tuán)，腹瀉嚴(yán)重，肛門(mén)四周有糞便玷污，拉黃綠色稀糞，呈噴射狀，不規(guī)則。與感染組相比，各給藥組臨床癥狀相對(duì)較輕。

ETECO101感染后12～24 h，肉雞出現(xiàn)死亡(圖1)，24 h后死亡明顯減少。細(xì)菌感染后第7天，ETECO101組的存活率為68.9%，100 mg·L-1穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑組與粘菌素組的存活率為82.2%，200 mg·L-1穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑組的存活率為86.7%。相對(duì)于ETECO101組，100 mg·L-1穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑組與粘菌素組使肉雞存活率提高13.3%(P<0.05)，200 mg·L-1穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑組使肉雞存活率提高17.8%(P<0.05)。

*表示與感染組相比差異顯著，P<0.05。下同

2.2 穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

從生長(zhǎng)性能來(lái)看(表3)，攻毒后7 d內(nèi)，相對(duì)于ETECO101組，各給藥組均顯著增加了肉雞ADG(P<0.01)和ADFI(P<0.01)。

表3 穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑對(duì)ETECO101感染肉雞生長(zhǎng)性能的影響(n=3)

2.3 穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑對(duì)肉雞腹瀉的影響

從糞便評(píng)分來(lái)看(圖2)，相對(duì)于空白組，ETECO101感染后的24和36 h，肉雞腹瀉顯著升高；相對(duì)于ETECO101組，在24和36 h，200 mg·L-1穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑組顯著抑制了肉雞腹瀉(P<0.05)；在36 h時(shí)，200 mg·L-1穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑和粘菌素組顯著抑制了肉雞腹瀉(P<0.05)。

腹瀉評(píng)分基于每組3個(gè)重復(fù)進(jìn)行打分

2.4 病理剖檢與肝組織病理學(xué)

病理剖檢發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，感染組肉雞腹腔腥臭味，充滿(mǎn)黃綠色水樣或黏稠液體。肝腫大，淤血或散在出血，表面覆有纖維素性黃色薄膜；心腫大，心包炎；脾腫大，充血；腸道脹氣，腸壁變薄，腸黏膜脫落嚴(yán)重，有大量的出血點(diǎn)。與感染組相比，給藥組癥狀相對(duì)較輕。

對(duì)肝組織進(jìn)行組織病理學(xué)分析，結(jié)果表明(圖3)，對(duì)照組肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝索結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞呈多邊形，細(xì)胞核仁明顯；大腸桿菌攻毒組肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞之間界限不清，肝索結(jié)構(gòu)消失，部分區(qū)域可見(jiàn)均質(zhì)粉染，細(xì)胞發(fā)生碎裂的壞死灶；穿心蓮內(nèi)酯組和粘菌素組肝細(xì)胞形態(tài)較細(xì)菌攻毒組改善。

圖3 穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑對(duì)ETECO101感染肉雞第5天后肝組織病理變化的影響(400×)

2.5 穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑對(duì)肉雞免疫器官指數(shù)的影響

從免疫器官指數(shù)來(lái)看(圖4)，相對(duì)于空白組，ETECO101組顯著降低了感染后24 h肉雞法氏囊指數(shù)(P<0.01)，但第5天差異不顯著；相對(duì)于ETECO101組，200 mg·L-1穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑組顯著增加了感染后24 h肉雞脾臟指數(shù)(P<0.01)；相對(duì)于ETECO101組，各給藥組均顯著增加了感染后24 h肉雞法氏囊指數(shù)(P<0.01)。

圖4 穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑對(duì)ETECO101感染肉雞免疫器官指數(shù)的影響(n=6)

2.6 穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑對(duì)肉雞血清生化指標(biāo)的影響

采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清TP、ALB、GLB、UREA、GLU和CREA含量，結(jié)果見(jiàn)表4。從血清生化分析來(lái)看，相對(duì)于空白組，感染后24 h ETECO101組肉雞血清中TP(P<0.01)、ALB(P<0.01)、GLB(P<0.05)和GLU(P<0.01)含量顯著降低，UREA(P<0.01)含量顯著上升，對(duì)CREA水平影響不大。相對(duì)于ETECO101組，200 mg·L-1穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑組顯著增加了血清中TP(P<0.01)和ALB(P<0.01)含量，粘菌素組增加TP(P<0.01)和ALB(P<0.05)含量的效果次之，100 mg·L-1穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑組顯著增加TP含量(P<0.01)，但不增加ALB含量。200 mg·L-1穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑組和粘菌素組顯著降低了血清中UREA(P<0.01)含量。

表4 穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑對(duì)ETECO101感染肉雞血清生化指標(biāo)的影響(n=6)

相對(duì)于空白組，感染后第5天ETECO101組肉雞血清中TP(P<0.01)、ALB(P<0.01)和GLB(P<0.01)含量顯著升高，而UREA(P<0.01)、GLU(P<0.01)和CREA(P<0.01)含量顯著下降。相對(duì)于ETECO101組，各給藥組顯著降低了血清中GLB(P<0.01)含量，顯著增加了血清中UREA(P<0.01)含量，200 mg·L-1穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑組顯著增加了血清中GLU(P<0.01)含量。

2.7 穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑對(duì)肉雞血清丙二醛(MDA)含量的影響

穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑對(duì)肉雞血清MDA含量的影響(圖5)，相對(duì)于空白組，ETECO101組顯著地增加了感染后24 h(P<0.01)和第5天肉雞血清MDA的含量(P<0.05)；相對(duì)于ETECO101組，200 mg·L-1穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑組顯著地降低了感染后24 h(P<0.01)和第5天(P<0.05)肉雞血清MDA的含量；粘菌素組顯著地降低了感染后24 h 肉雞血清MDA的含量(P<0.01)。

圖5 穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑對(duì)ETECO101感染肉雞血清MDA含量的影響(n=6)

2.8 穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑對(duì)肉雞血清超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響

穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑對(duì)肉雞血清SOD活力的影響(圖6)，相對(duì)于空白組，ETECO101組顯著降低了感染后第5天肉雞血清SOD活力(P<0.01)，但感染后24 h差異不顯著；相對(duì)于ETECO101組，粘菌素組顯著升高了感染后24 h肉雞血清SOD活力(P<0.01)，200 mg·L-1穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑組升高效果次之(P<0.05)；各給藥組均顯著升高了感染后第5天肉雞血清SOD活力(P<0.01)。

圖6 穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑對(duì)ETECO101感染肉雞血清SOD活力的影響(n=6)

2.9 穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑對(duì)肉雞血清谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活力的影響

穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑對(duì)肉雞血清GSH-Px活力的影響見(jiàn)圖7。相對(duì)于空白組，ETECO101組顯著降低了感染后24 h肉雞血清GSH-Px活力(P<0.01)，但感染后第5天差異不顯著；相對(duì)于ETECO101組，200 mg·L-1穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑組顯著升高了感染后24 h肉雞血清GSH-Px活力(P<0.001)；粘菌素組顯著升高了感染后第5天肉雞血清GSH-Px活力(P<0.01)，200 mg·L-1穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑組升高效果次之(P<0.05)。

圖7 穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑對(duì)ETECO101感染肉雞血清GSH-Px活力的影響(n=6)

2.10 穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑對(duì)肉雞腸道組織形態(tài)的影響

穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑對(duì)肉雞空腸組織形態(tài)的影響見(jiàn)圖8及表5，相對(duì)于空白組，ETECO101組顯著降低了感染后24 h肉雞空腸絨毛高度(P<0.05)和絨毛高度與隱窩深度的比例(P<0.01)，顯著增加了肉雞空腸隱窩深度(P<0.05)；相對(duì)于ETECO101組，100和200 mg·L-1穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑組和粘菌素組顯著增加了感染后24 h肉雞空腸絨毛高度(P<0.05)，降低了隱窩深度(P<0.05)；各給藥組均顯著增加了絨毛高度與隱窩深度的比例(P<0.01)。相對(duì)于空白組，ETECO101組顯著降低了感染后第5天肉雞空腸絨毛高度(P<0.05)和絨毛高度與隱窩深度的比例(P<0.01)，顯著增加了肉雞空腸隱窩深度(P<0.05)；相對(duì)于ETECO101組，200 mg·L-1穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑組顯著增加了感染后第5天肉雞空腸絨毛高度(P<0.05)和絨毛高度與隱窩深度的比例(P<0.01)，降低了隱窩深度(P<0.05)；粘菌素組顯著增加了感染后第5天肉雞空腸絨毛高度(P<0.01)和絨毛高度與隱窩深度的比例(P<0.05)，降低了隱窩深度(P<0.05)。

表5 穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑對(duì)ETECO101感染肉雞空腸組織形態(tài)的影響(n=6)

圖8 穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑對(duì)ETECO101感染肉雞第5天空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響(100×)

3 討 論

穿心蓮內(nèi)酯是清熱解毒中藥穿心蓮的主要藥效成分，穿心蓮內(nèi)酯及其水溶性鹽“穿琥寧”、“炎琥寧”、“蓮必治”、“喜炎平”等多種制劑在醫(yī)學(xué)臨床上廣泛用于呼吸道及消化道感染及炎癥性疾病的治療[24]。獸醫(yī)上只批準(zhǔn)了穿心蓮內(nèi)酯原料藥，沒(méi)有任何批準(zhǔn)使用的制劑。本研究針對(duì)養(yǎng)雞業(yè)通常采用飲水給藥的投藥途徑，研制出適用于飲水給藥的穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑，全面考察了該制劑對(duì)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌ETECO101感染肉雞的治療效果。結(jié)果表明，穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑飲水給藥能顯著提高大腸桿菌感染肉雞的存活率，減輕感染雞只的臨床病癥及腹瀉。

生長(zhǎng)性能是衡量藥物對(duì)雞只保護(hù)效果的重要指標(biāo)。臨床上腸毒素性大腸桿菌會(huì)引起肉雞嚴(yán)重的腸道損傷和死亡，降低肉雞的體重、采食量和飼料轉(zhuǎn)化效率[25]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ETECO101感染導(dǎo)致肉雞體重和采食量下降。產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌感染肉雞后在腸道中大量增殖，釋放出毒素，致使腸黏膜脫落，屏障功能被破壞，肉雞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)化下降[26]。本試驗(yàn)證明，飲水中添加穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑，能夠有效地增加感染肉雞的采食量和體重。張霞等[27]研究表明,穿心蓮內(nèi)酯可直接破壞內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)，并抑制其所介導(dǎo)釋放的大量炎性因子的活性而起到拮抗內(nèi)毒素的作用。鄭晨等[28]研究還發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯可顯著改善內(nèi)毒素導(dǎo)致的機(jī)體發(fā)熱。而本研究前期藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯對(duì)于產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌無(wú)直接抑菌作用，其作用可能是通過(guò)抑制大腸桿菌釋放的內(nèi)毒素，從而抑制大腸桿菌在肉雞腸道中的定植，改善肉雞腹瀉。

免疫器官指數(shù)在一定程度上反映了機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱，是評(píng)價(jià)家禽免疫力的重要指標(biāo)，包括胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、法氏囊指數(shù)[29]。王俊峰等[30]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加乳酸菌制劑可以提高肉雞法氏囊指數(shù)，但是對(duì)于后期法氏囊指數(shù)無(wú)顯著改變。本研究發(fā)現(xiàn)，肉雞感染ETECO101 24 h后，法氏囊指數(shù)顯著下降，飲水中添加穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑能夠顯著增加肉雞法氏囊指數(shù)，感染后期隨著機(jī)體免疫力地增強(qiáng)，穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑對(duì)于肉雞免疫器官指數(shù)的改善效果不明顯。說(shuō)明當(dāng)病原體入侵機(jī)體后，機(jī)體的抵抗力顯著下降，而穿心蓮內(nèi)酯可以通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體，增強(qiáng)其免疫力，在一定程度上抵抗病原體的入侵。

正常情況下，機(jī)體自由基的產(chǎn)生和清除保持平衡，但在病原體入侵的情況下，體內(nèi)自由基增加，氧化能力超過(guò)抗氧化能力而發(fā)生氧化應(yīng)激，從而直接引起生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化、細(xì)胞內(nèi)蛋白及酶變性最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡或凋亡，造成組織損傷和疾病發(fā)生[31]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)物，其含量可以體現(xiàn)氧自由基的含量和脂質(zhì)過(guò)氧化程度。SOD和GSH-Px通過(guò)清除超氧陰離子(O2-)而保護(hù)細(xì)胞免受損傷，它們活性的高低間接反映機(jī)體清除自由基的能力，也就是機(jī)體抗氧化的能力[29]。何思蓉等[32]研究表明，穿心蓮內(nèi)酯能在中樞神經(jīng)和外周血管中產(chǎn)生抗氧化作用而達(dá)到對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用。其抗氧化作用主要可以歸結(jié)為抑制自由基生成，防止脂質(zhì)過(guò)氧化，從而降低自由基毒性[33]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肉雞感染產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌ETECO101后，發(fā)生氧化應(yīng)激，感染細(xì)菌后24 h肉雞血清中MDA含量上升，血清GSH-Px活力下降，200 mg·L-1穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑組顯著降低了感染細(xì)菌后24 h肉齡肉雞血清中MDA含量，升高了SOD和GSH-Px活力。肉雞感染產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌ETECO101后第5天血清中MDA含量上升，SOD活力顯著下降，200 mg·L-1穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑組可以顯著降低了肉雞血清中MDA含量，升高SOD活力。說(shuō)明穿心蓮內(nèi)酯可以通過(guò)降低血清MDA含量，升高SOD和GSH-Px活力來(lái)改善肉雞血清的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

小腸不僅是主要的消化吸收器官，而且還起到保護(hù)性屏障的作用，以防止腸腔內(nèi)抗原、微生物和毒素滲透進(jìn)入內(nèi)部環(huán)境。然而，腸病原體如腸毒素性大腸桿菌，容易在小腸中定殖并釋放出腸毒素，從而引起嚴(yán)重的腹瀉并損害腸屏障完整性[34]。小腸的黏膜結(jié)構(gòu)與功能完整性是保證機(jī)體能夠充分吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的前提。衡量腸黏膜功能的重要指標(biāo)包括絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度與隱窩深度的比值[35]。從本試驗(yàn)可以看出，當(dāng)肉雞受到產(chǎn)腸毒性大腸桿菌ETECO101刺激后，腸絨毛變短、隱窩深度加深、絨毛高度與隱窩深度的比值下降。飲水中添加穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑可以通過(guò)增加絨毛高度和降低隱窩深度，減少細(xì)菌感染對(duì)腸黏膜結(jié)構(gòu)的損傷，增加肉雞的營(yíng)養(yǎng)吸收，另外，200 mg·L-1穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑組改善腸道形態(tài)的效果優(yōu)于100 mg·L-1穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑組。

4 結(jié) 論

穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑可以減少產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌ETECO101感染肉雞導(dǎo)致的雞死亡，改善感染肉雞的生長(zhǎng)性能，降低感染肉雞血清中MDA含量和提高血清SOD和GSH-Px活力，并抑制感染導(dǎo)致的雞腸道損傷。200 mg·L-1穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑組效果優(yōu)于100 mg·L-1劑量組。