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    HBV-DNA定量檢測方法學(xué)的性能驗(yàn)證分析

    2021-11-20 06:55:02宋麗影李雨艷周婷婷路放
    關(guān)鍵詞:正確度理論值方法學(xué)

    宋麗影 李雨艷 周婷婷 路放

    (吉林金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司 吉林長春 130000)

    1 前言

    方法學(xué)性能驗(yàn)證是指為確保實(shí)驗(yàn)室開展的檢測項(xiàng)目中,所應(yīng)用的檢測系統(tǒng)的分析性能或檢測項(xiàng)目的方法學(xué)能夠滿足檢測及臨床要求,進(jìn)行的一項(xiàng)質(zhì)量保證工作,只有通過性能驗(yàn)證才能開展相關(guān)工作。HBV-DNA定量(實(shí)時熒光定量PCR方法)是分子實(shí)驗(yàn)室中最常見的一種項(xiàng)目。本文以HBV-DNA定量檢測為例,對如何進(jìn)行分子診斷定量項(xiàng)目的分析性能驗(yàn)證進(jìn)行簡要分析。

    2 材料與方法

    2.1 標(biāo)本來源

    HBV-DNA標(biāo)本(吉林金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司);正確度驗(yàn)證室間質(zhì)評樣本(國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心,吉林市臨床檢驗(yàn)中心);重復(fù)性精密度和中間精密度驗(yàn)證高低值室內(nèi)質(zhì)控品(北京康斯坦徹)。

    2.2 儀器

    實(shí)時熒光定量PCR儀(ABI7500);DP-1OOO提取儀(上海科華生物技術(shù)有限公司);5424R高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf)。

    2.3 試劑

    乙型肝炎病毒核酸測定試劑盒(磁珠/PCR-熒光探針法,國械注準(zhǔn)20193401792,試劑批號20031611,上海科華生物技術(shù)有限公司)。

    2.4 方法

    2.4.1 正確度驗(yàn)證

    使用已經(jīng)通過室間質(zhì)評的20例樣本進(jìn)行驗(yàn)證,計(jì)算出每個樣本的偏倚百分比,偏倚百分比=(測量值-理論值)/理論值×100%。留樣再測判斷標(biāo)準(zhǔn):按照項(xiàng)目穩(wěn)定性要求,選取能夠覆蓋測量區(qū)間的最長期限的5個樣本,其中至少4個樣本的測量結(jié)果偏倚<±7.5%。

    2.4.2 精密度驗(yàn)證

    (1)重復(fù)性精密度:選取高低值質(zhì)控品,在同一次實(shí)驗(yàn)中重復(fù)檢測高低值質(zhì)控品各20次,記錄結(jié)果并計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)CV(%)。以能力驗(yàn)證/室間質(zhì)評評價界限(靶值±0.4對數(shù)值)作為允許總誤差(TEa),重復(fù)性精密度<3/5TEa(TEa=0.4Lg),即為通過。

    (2)中間精密度:選取高低值質(zhì)控品,利用不同日期累計(jì)的20個測定值的數(shù)據(jù),記錄結(jié)果并計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)CV(%)。以能力驗(yàn)證/室間質(zhì)評評價界限(靶值±0.4對數(shù)值)作為允許總誤差(TEa),中間精密度<4/5TEa(TEa=0.4Lg),即為通過[1]。

    2.4.3 線性驗(yàn)證

    取臨床HBV-DNA混合血清定值為3.48E+06 IU/mL的樣本進(jìn)行驗(yàn)證,使用陰性血清10倍梯度稀釋至5、4、3、2次方。每個濃度重復(fù)檢測3次,用陰性標(biāo)本按1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000、1∶100 000系列進(jìn)行稀釋,以稀釋計(jì)算值作為理論值,對各稀釋樣品的實(shí)測值與理論值進(jìn)行回歸分析,對每個樣本進(jìn)行3次檢測,經(jīng)統(tǒng)計(jì)后擬合回歸線y=bx+a。

    2.4.4 抗干擾能力驗(yàn)證

    取2種不同濃度(E3和E5)的HBV血清樣本,將血清樣本和相應(yīng)的干擾物進(jìn)行一定比率的混合,混合后對應(yīng)濃度分別為:膽紅素18 mg/mL,甘油三酯3 g/dL,血紅蛋白2 g/dL;按照相同的比率將混合血清和相應(yīng)的干擾物空白對照(陰性血清)混合后再檢測。每個混合品重復(fù)檢測3次,計(jì)算均值(lg值)。評價標(biāo)準(zhǔn):實(shí)驗(yàn)樣本與對照樣本lg值偏倚<±7.5%。

    2.4.5 質(zhì)控

    每次實(shí)驗(yàn)時均做陰性、低值與高值室內(nèi)質(zhì)控。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時將低值與高值質(zhì)控結(jié)果進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換并錄入系統(tǒng)。當(dāng)質(zhì)控結(jié)果理想時,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)才能被采用,否則需要重新進(jìn)行檢測[2]。

    3 試驗(yàn)結(jié)果

    3.1 正確度驗(yàn)證結(jié)果

    試驗(yàn)正確度驗(yàn)證結(jié)果見表1。

    表1 HBV-DNA正確度驗(yàn)證結(jié)果

    3.2 精密度驗(yàn)證結(jié)果

    3.2.1 重復(fù)性精密度

    重復(fù)性精密度測定S低值為0.12,S高值為0.08,詳見表2。

    表2 HBV-DNA重復(fù)性精密度驗(yàn)證結(jié)果

    3.2.2 中間精密度

    中間精密度統(tǒng)計(jì)不同日期累積的S低值為0.11,詳見表3。

    表3 HBV-DNA中間性精密度驗(yàn)證結(jié)果

    3.3 線性驗(yàn)證結(jié)果

    將3.48E+06 IU/mL濃度的樣本稀釋至3.48E+02 IU/m。

    表4 HBV-DNA線性驗(yàn)證結(jié)果

    3.4 抗干擾能力驗(yàn)證結(jié)果

    本次實(shí)驗(yàn)樣本與對照樣本的lg值偏倚均符合<±7.5%的標(biāo)準(zhǔn),驗(yàn)證合格。

    表5 抗干擾能力樣本定量值

    4 討論

    熒光定量PCR是實(shí)驗(yàn)室最常用的檢測方法之一,具有高敏感性和特異性,被廣泛應(yīng)用于臨床診斷和治療,在臨床分子診斷中展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用價值,檢測人員必須充分掌握其方法性能,并采取相應(yīng)質(zhì)控措施,才能確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[3]。因此,本文通過對本實(shí)驗(yàn)室開展的HBV-DNA定量檢測方法學(xué)性能驗(yàn)證情況進(jìn)行分析,為PCR檢測項(xiàng)目的方法學(xué)驗(yàn)證提供設(shè)計(jì)方案。

    熒光定量PCR檢測HBV-DNA方法的正確度驗(yàn)證,可以采用室間質(zhì)評結(jié)果或CAP能力驗(yàn)證結(jié)果,驗(yàn)證檢測方法的準(zhǔn)確性和可比性,該方法更權(quán)威可靠,更具可比性[4]。精密度驗(yàn)證可以使用第三方質(zhì)控品或采用室內(nèi)質(zhì)控檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,由于質(zhì)控是每天隨病人標(biāo)本同時檢測,因此該方法既能夠節(jié)約成本,又能夠真實(shí)反映檢測系統(tǒng)的重復(fù)性,可以為精密度驗(yàn)證評價提供更充分依據(jù)[5]。

    表1和表3的驗(yàn)證結(jié)果顯示,偏倚百分比均<±7.5%。從線性驗(yàn)證結(jié)果來看,5個濃度的樣本均檢出,相關(guān)系數(shù)R=0.9913,與理論值呈顯著的相關(guān)性。用于線性范圍驗(yàn)證的樣本應(yīng)覆蓋整個檢測系統(tǒng)的范圍,且樣本的稀釋和檢測都可能存在誤差,所以暫定1.00E+02為檢測下限,但并沒有得到具體的檢測上限,暫定線性范圍為1.00E+02~5.00E+08 IU/ml。由于抗干擾能力也會影響檢測準(zhǔn)確性,故本文分別對黃疸、脂血、溶血樣本進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果均與試劑生產(chǎn)廠家的聲明結(jié)果一致。

    綜上所述,實(shí)驗(yàn)室在開展PCR檢測項(xiàng)目前,需對正確度、精密度、線性范圍、抗干擾能力等方法學(xué)性能進(jìn)行驗(yàn)證。本文驗(yàn)證的方法學(xué)性能指標(biāo)均能滿足預(yù)期臨床用途,表明本實(shí)驗(yàn)室能夠?yàn)榕R床工作提供有效支持。

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