鄧俊杰,謝浙裕*,何麗娜
(1.紹興市食品藥品檢驗(yàn)研究院,紹興 312000;2.浙江大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)部,杭州 310000)
杞菊地黃丸(濃縮丸)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為2020年版《中國(guó)藥典》一部,處方由枸杞、菊花、熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉8味中藥制成,具有滋腎養(yǎng)肝的功效。用于治療肝腎陰虧、眩暈耳鳴、羞明畏光、迎風(fēng)流淚、視物昏花[1-2]。與傳統(tǒng)劑型相比,濃縮丸具有服用量少、方便攜帶等優(yōu)點(diǎn)。中成藥的功效是多種活性成分共同作用的結(jié)果,但查閱《中國(guó)藥典》和相關(guān)文獻(xiàn)[3-7],僅有高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定酒萸肉中莫諾苷、馬錢(qián)苷和牡丹皮中丹皮酚含量的報(bào)道,缺少其余6味中藥的質(zhì)量控制指標(biāo),不能全面評(píng)價(jià)其整體質(zhì)量。
根據(jù)2020年版《中國(guó)藥典》和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[8-11],枸杞的指標(biāo)成分為甜菜堿;菊花的指標(biāo)成分為綠原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸;熟地黃的指標(biāo)成分為毛蕊花糖苷;山藥的指標(biāo)成分為尿囊素;茯苓的指標(biāo)成分為茯苓酸;澤瀉的指標(biāo)成分為23-乙酰澤瀉醇B。
本實(shí)驗(yàn)使用高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法,以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行檢測(cè),正負(fù)離子同時(shí)掃描,具有質(zhì)譜靈敏度高、準(zhǔn)確性好、選擇性強(qiáng)的特點(diǎn),建立了同時(shí)測(cè)定杞菊地黃丸(濃縮丸)中11種有效成分的方法。既簡(jiǎn)化了甜菜堿的提取方式,又解決了多成分液相檢測(cè)時(shí)周期長(zhǎng)、雜質(zhì)干擾大的問(wèn)題,對(duì)8味中藥的各指標(biāo)成分進(jìn)行了含量測(cè)定,為杞菊地黃丸(濃縮丸)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供了依據(jù)[12-16]。
1.1儀器 1260-6470型高效液相-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司);XPE26百萬(wàn)分之一電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司);ZM-200型超離心碾磨儀(德國(guó)Retsch公司);FESCO17型微量離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司);HH-4A型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司)。
1.2試藥 甜菜堿(批號(hào)110894-201604,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.2%),綠原酸(批號(hào)110753-202018,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.1%),木犀草苷(批號(hào)111720-201810,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.5%),3,5-O-二咖啡?;鼘幩?批號(hào)111782-201807,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.3%),毛蕊花糖苷(批號(hào)111530-201914,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.2%),莫諾苷(批號(hào)111998-201703,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.4%),馬錢(qián)苷(批號(hào)111640-201808,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%),丹皮酚(批號(hào)110708-201908,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8%),尿囊素(批號(hào)111501-200202,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100.0%),23-乙酰澤瀉醇B(批號(hào)111846-201705,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%),均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;茯苓酸(批號(hào)J2140009,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100.0%,ANPEL公司);甲醇和乙腈均為質(zhì)譜純,均購(gòu)自Merck公司;甲酸(質(zhì)譜純,CNW公司);杞菊地黃丸(濃縮丸)(仲景宛西制藥股份有限公司,批號(hào):200511、200416、190806、190417)。
2.1液相色譜-質(zhì)譜條件
2.1.1色譜條件 色譜柱:Agilent Porshell EC-C18(50 mm×4.6 mm,2.7 μm)柱;流動(dòng)相:乙腈-1 mL·L-1甲酸(梯度洗脫,見(jiàn)表1),柱溫:30 ℃,流速:0.5 mL·min-1,進(jìn)樣量:2 μL。
表1 梯度洗脫方法
2.1.2質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧離子源;干燥氣和碰撞氣:氮?dú)?質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.999%);干燥氣溫度:300 ℃;干燥氣流速:6 L·min-1;掃描模式:正負(fù)離子同時(shí)掃描;毛細(xì)管電壓:4 000 V(+),3 500 V(-);為提高檢測(cè)靈敏度,采用分時(shí)間段的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式,電離模式、保留時(shí)間、定量離子對(duì)、碎裂電壓和碰撞能量(CE),見(jiàn)表2。
表2 11種成分的電離模式、保留時(shí)間、定量離子對(duì)、碎裂電壓和碰撞能量
2.2溶液的制備
2.2.1對(duì)照品溶液 稱取甜菜堿20.18 mg、綠原酸10.86 mg、木犀草苷10.98 mg、3,5-O-二咖啡?;鼘幩?5.28 mg、毛蕊花糖苷15.79 mg、尿囊素10.12 mg、茯苓酸10.83 mg、23-乙酰澤瀉醇B 15.65 mg,置于同一100 mL量瓶中,加入體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇制得①號(hào)儲(chǔ)備液;分別稱取莫諾苷10.73 mg、馬錢(qián)苷20.07 mg、丹皮酚25.95 mg,置于同一25 mL量瓶中,加入體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇制得②號(hào)儲(chǔ)備液。再精密量取①、②號(hào)儲(chǔ)備液各2 mL,置于同一20 mL量瓶中,加入體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇制成混合對(duì)照品溶液。
2.2.2供試品溶液 取本品適量(批號(hào)200511),研細(xì),取2.0 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇50 mL,密塞,稱定質(zhì)量,加熱回流1 h,取出,放冷,再稱定質(zhì)量,用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,超高速離心,取上清液作為供試品溶液。
2.2.3陰性供試品溶液 按照處方組成及生產(chǎn)工藝制得缺枸杞、菊花、熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓和澤瀉的陰性供試品,按照2.2.2項(xiàng)下方法制得陰性供試品溶液。
2.3方法學(xué)驗(yàn)證
2.3.1專屬性考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液各2 μL,按照2.1項(xiàng)下色譜條件檢測(cè),記錄質(zhì)譜圖。結(jié)果供試品顯示出與對(duì)照品保留時(shí)間相同的質(zhì)譜峰,陰性供試品溶液在此保留時(shí)間無(wú)質(zhì)譜峰,其他組分對(duì)結(jié)果無(wú)干擾,表明該方法系統(tǒng)適用性良好。見(jiàn)圖1。
圖1 11種成分的提取離子流圖
2.3.2線性關(guān)系考察 精密量取2.2.1項(xiàng)下制備的①、②號(hào)對(duì)照品儲(chǔ)備液各2 mL,分別置于同一5、10、20、50、100 mL量瓶中,加體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇稀釋至刻度,制得系列混合對(duì)照品溶液。按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),峰面積為縱坐標(biāo)(y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算得線性回歸方程,結(jié)果11種成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈良好線性關(guān)系。見(jiàn)表3。
2.3.3定量限 精密度量取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液,逐級(jí)稀釋,按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,以信噪比為10∶1對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限下限,結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 11種成分的回歸方程、線性范圍、檢測(cè)限和定量限
2.3.4精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,結(jié)果甜菜堿、綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?;鼘幩?、毛蕊花糖苷、莫諾苷、馬錢(qián)苷、丹皮酚、尿囊素、茯苓酸和23-乙酰澤瀉醇B峰面積的RSD值分別為0.5%、0.7%、0.4%、0.9%、1.6%、0.8%、1.2%、0.9%、1.0%、1.4%、1.7%,表明儀器精密度良好。
2.3.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取6份同一樣品粉末,按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,結(jié)果甜菜堿、綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?;鼘幩?、毛蕊花糖苷、莫諾苷、馬錢(qián)苷、丹皮酚、尿囊素、茯苓酸和23-乙酰澤瀉醇B峰面積的RSD值分別為0.7%、0.3%、0.5%、1.1%、1.7%、0.9%、1.9%、0.7%、1.5%、2.1%、1.3 %,表明該方法重復(fù)性良好。
2.3.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液,分別在0、4、8、12、24、48 h,按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,結(jié)果甜菜堿、綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?;鼘幩帷⒚锘ㄌ擒?、莫諾苷、馬錢(qián)苷、丹皮酚、尿囊素、茯苓酸和23-乙酰澤瀉醇B峰面積的RSD值分別為0.8%、0.7%、0.6%、1.4%、1.9%、0.7%、1.5%、1.2%、1.0%、1.7%、1.5%,表明穩(wěn)定性良好。
2.3.7加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取9份同一樣品粉末(批號(hào)200511),每份1.0 g,分別置于具塞錐形瓶中,3份為1組,分別加入相當(dāng)于1.0 g樣品中各組分含量為80%、100%、120%的對(duì)照品,按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定得甜菜堿、綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?;鼘幩?、毛蕊花糖苷、莫諾苷、馬錢(qián)苷、丹皮酚、尿囊素、茯苓酸和23-乙酰澤瀉醇B的平均回收率分別為97.66%、97.32%、97.88%、97.67%、98.35%、97.52%、98.34%、98.41%、98.03%、97.81%、98.19%,RSD值分別為0.5%、1.2%、0.8%、0.5%、0.5%、0.9%、0.3%、0.5%、0.4%、0.6%、1.0%,表明該方法準(zhǔn)確、可靠。
2.4樣品測(cè)定 精密稱定4批樣品粉末各2.0 g,按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,精密吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各2 μL,按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,計(jì)算各成分含量,結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果 (n=4)
3.1檢測(cè)器的選擇 HPLC法同時(shí)檢測(cè)11種成分,存在前處理復(fù)雜、基線分離難、最大吸收波長(zhǎng)不同等問(wèn)題,而質(zhì)譜法具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、選擇性強(qiáng)、線性范圍寬的特點(diǎn)。此外,以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行含量測(cè)定,同時(shí)掃描正負(fù)離子對(duì),相較于紫外檢測(cè)器,檢驗(yàn)的時(shí)間更短,結(jié)果更準(zhǔn)確。
3.2監(jiān)測(cè)離子對(duì)的選擇 質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式以特征離子為目標(biāo),選擇合適的母離子和子離子是檢測(cè)的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)先以全掃描模式確定母離子,再優(yōu)化碎裂能量和碰撞能量,確定信號(hào)響應(yīng)最強(qiáng)的子離子,最終為11種成分各確定1對(duì)定量離子。
3.3流動(dòng)相的選擇 分別比較了乙腈-水、乙腈-1 mL·L-1甲酸、甲醇-水、甲醇-1 mL·L-1甲酸作為流動(dòng)相的檢測(cè)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)乙腈和甲醇均能達(dá)到較好的分離效果,并且乙腈較甲醇具有更強(qiáng)的洗脫能力和更低的洗脫壓力。少量甲酸的加入既改善了峰形,又提高了響應(yīng),因此,最終選用乙腈-1 mL·L-1甲酸作為流動(dòng)相。
3.4提取溶劑的選擇 由于有效成分多為酚酸和皂苷類(lèi)化合物,二者在水和甲醇中溶解度高,比較甲醇、體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇、體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇的提取效果,發(fā)現(xiàn)體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇的提取效果最好,干擾較少,最終選用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇作為提取溶劑。
3.5提取方法的選擇 比較超聲和回流2種提取方法,結(jié)果顯示,在相同提取時(shí)間下,回流提取液的含量高于超聲提取液,最終選用回流提取法。
3.6提取時(shí)間的選擇 比較回流提取30、60、90 min的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)提取60 min時(shí),各成分含量基本一致,最終選用提取時(shí)間為60 min。
根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本方法具有前處理簡(jiǎn)便、分析時(shí)間短、結(jié)果準(zhǔn)確、檢測(cè)成分多等特點(diǎn),可為杞菊地黃丸的質(zhì)量控制提供參考。