HPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定杞菊地黃丸(濃縮丸)中11種成分的含量

鄧俊杰，謝浙裕*，何麗娜

(1.紹興市食品藥品檢驗(yàn)研究院，紹興 312000；2.浙江大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)部，杭州 310000)

杞菊地黃丸(濃縮丸)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為2020年版《中國(guó)藥典》一部,處方由枸杞、菊花、熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉8味中藥制成，具有滋腎養(yǎng)肝的功效。用于治療肝腎陰虧、眩暈耳鳴、羞明畏光、迎風(fēng)流淚、視物昏花[1-2]。與傳統(tǒng)劑型相比，濃縮丸具有服用量少、方便攜帶等優(yōu)點(diǎn)。中成藥的功效是多種活性成分共同作用的結(jié)果，但查閱《中國(guó)藥典》和相關(guān)文獻(xiàn)[3-7]，僅有高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定酒萸肉中莫諾苷、馬錢(qián)苷和牡丹皮中丹皮酚含量的報(bào)道，缺少其余6味中藥的質(zhì)量控制指標(biāo)，不能全面評(píng)價(jià)其整體質(zhì)量。

根據(jù)2020年版《中國(guó)藥典》和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[8-11]，枸杞的指標(biāo)成分為甜菜堿；菊花的指標(biāo)成分為綠原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸；熟地黃的指標(biāo)成分為毛蕊花糖苷；山藥的指標(biāo)成分為尿囊素；茯苓的指標(biāo)成分為茯苓酸；澤瀉的指標(biāo)成分為23-乙酰澤瀉醇B。

本實(shí)驗(yàn)使用高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行檢測(cè)，正負(fù)離子同時(shí)掃描，具有質(zhì)譜靈敏度高、準(zhǔn)確性好、選擇性強(qiáng)的特點(diǎn)，建立了同時(shí)測(cè)定杞菊地黃丸(濃縮丸)中11種有效成分的方法。既簡(jiǎn)化了甜菜堿的提取方式，又解決了多成分液相檢測(cè)時(shí)周期長(zhǎng)、雜質(zhì)干擾大的問(wèn)題，對(duì)8味中藥的各指標(biāo)成分進(jìn)行了含量測(cè)定，為杞菊地黃丸(濃縮丸)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供了依據(jù)[12-16]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 1260-6470型高效液相-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司)；XPE26百萬(wàn)分之一電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；ZM-200型超離心碾磨儀(德國(guó)Retsch公司)；FESCO17型微量離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司)；HH-4A型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司)。

1.2試藥 甜菜堿(批號(hào)110894-201604，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.2%)，綠原酸(批號(hào)110753-202018，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.1%)，木犀草苷(批號(hào)111720-201810，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.5%)，3,5-O-二咖啡?；鼘幩?批號(hào)111782-201807，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.3%)，毛蕊花糖苷(批號(hào)111530-201914，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.2%)，莫諾苷(批號(hào)111998-201703，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.4%)，馬錢(qián)苷(批號(hào)111640-201808，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%)，丹皮酚(批號(hào)110708-201908，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8%)，尿囊素(批號(hào)111501-200202，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100.0%)，23-乙酰澤瀉醇B(批號(hào)111846-201705，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；茯苓酸(批號(hào)J2140009，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100.0%,ANPEL公司)；甲醇和乙腈均為質(zhì)譜純，均購(gòu)自Merck公司；甲酸(質(zhì)譜純，CNW公司)；杞菊地黃丸(濃縮丸)(仲景宛西制藥股份有限公司，批號(hào)：200511、200416、190806、190417)。

2 方法與結(jié)果

2.1液相色譜-質(zhì)譜條件

2.1.1色譜條件 色譜柱：Agilent Porshell EC-C18(50 mm×4.6 mm，2.7 μm)柱；流動(dòng)相：乙腈-1 mL·L-1甲酸(梯度洗脫，見(jiàn)表1)，柱溫：30 ℃，流速：0.5 mL·min-1，進(jìn)樣量：2 μL。

表1 梯度洗脫方法

2.1.2質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源；干燥氣和碰撞氣：氮?dú)?質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.999%)；干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流速：6 L·min-1；掃描模式：正負(fù)離子同時(shí)掃描；毛細(xì)管電壓：4 000 V(+)，3 500 V(-)；為提高檢測(cè)靈敏度，采用分時(shí)間段的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式，電離模式、保留時(shí)間、定量離子對(duì)、碎裂電壓和碰撞能量(CE)，見(jiàn)表2。

表2 11種成分的電離模式、保留時(shí)間、定量離子對(duì)、碎裂電壓和碰撞能量

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液 稱取甜菜堿20.18 mg、綠原酸10.86 mg、木犀草苷10.98 mg、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?5.28 mg、毛蕊花糖苷15.79 mg、尿囊素10.12 mg、茯苓酸10.83 mg、23-乙酰澤瀉醇B 15.65 mg，置于同一100 mL量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇制得①號(hào)儲(chǔ)備液；分別稱取莫諾苷10.73 mg、馬錢(qián)苷20.07 mg、丹皮酚25.95 mg，置于同一25 mL量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇制得②號(hào)儲(chǔ)備液。再精密量取①、②號(hào)儲(chǔ)備液各2 mL，置于同一20 mL量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇制成混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液 取本品適量(批號(hào)200511)，研細(xì)，取2.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，超高速離心，取上清液作為供試品溶液。

2.2.3陰性供試品溶液 按照處方組成及生產(chǎn)工藝制得缺枸杞、菊花、熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓和澤瀉的陰性供試品，按照2.2.2項(xiàng)下方法制得陰性供試品溶液。

2.3方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1專屬性考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液各2 μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，記錄質(zhì)譜圖。結(jié)果供試品顯示出與對(duì)照品保留時(shí)間相同的質(zhì)譜峰，陰性供試品溶液在此保留時(shí)間無(wú)質(zhì)譜峰，其他組分對(duì)結(jié)果無(wú)干擾，表明該方法系統(tǒng)適用性良好。見(jiàn)圖1。

圖1 11種成分的提取離子流圖

2.3.2線性關(guān)系考察 精密量取2.2.1項(xiàng)下制備的①、②號(hào)對(duì)照品儲(chǔ)備液各2 mL，分別置于同一5、10、20、50、100 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇稀釋至刻度，制得系列混合對(duì)照品溶液。按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得線性回歸方程，結(jié)果11種成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈良好線性關(guān)系。見(jiàn)表3。

2.3.3定量限 精密度量取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以信噪比為10∶1對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限下限，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 11種成分的回歸方程、線性范圍、檢測(cè)限和定量限

2.3.4精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果甜菜堿、綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?、毛蕊花糖苷、莫諾苷、馬錢(qián)苷、丹皮酚、尿囊素、茯苓酸和23-乙酰澤瀉醇B峰面積的RSD值分別為0.5%、0.7%、0.4%、0.9%、1.6%、0.8%、1.2%、0.9%、1.0%、1.4%、1.7%，表明儀器精密度良好。

2.3.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取6份同一樣品粉末，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果甜菜堿、綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?、毛蕊花糖苷、莫諾苷、馬錢(qián)苷、丹皮酚、尿囊素、茯苓酸和23-乙酰澤瀉醇B峰面積的RSD值分別為0.7%、0.3%、0.5%、1.1%、1.7%、0.9%、1.9%、0.7%、1.5%、2.1%、1.3 %，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、4、8、12、24、48 h，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果甜菜堿、綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?；鼘幩帷⒚锘ㄌ擒?、莫諾苷、馬錢(qián)苷、丹皮酚、尿囊素、茯苓酸和23-乙酰澤瀉醇B峰面積的RSD值分別為0.8%、0.7%、0.6%、1.4%、1.9%、0.7%、1.5%、1.2%、1.0%、1.7%、1.5%，表明穩(wěn)定性良好。

2.3.7加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取9份同一樣品粉末(批號(hào)200511)，每份1.0 g，分別置于具塞錐形瓶中，3份為1組，分別加入相當(dāng)于1.0 g樣品中各組分含量為80%、100%、120%的對(duì)照品，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定得甜菜堿、綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?、毛蕊花糖苷、莫諾苷、馬錢(qián)苷、丹皮酚、尿囊素、茯苓酸和23-乙酰澤瀉醇B的平均回收率分別為97.66%、97.32%、97.88%、97.67%、98.35%、97.52%、98.34%、98.41%、98.03%、97.81%、98.19%，RSD值分別為0.5%、1.2%、0.8%、0.5%、0.5%、0.9%、0.3%、0.5%、0.4%、0.6%、1.0%，表明該方法準(zhǔn)確、可靠。

2.4樣品測(cè)定 精密稱定4批樣品粉末各2.0 g，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各2 μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算各成分含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果 (n=4)

3 討論

3.1檢測(cè)器的選擇 HPLC法同時(shí)檢測(cè)11種成分，存在前處理復(fù)雜、基線分離難、最大吸收波長(zhǎng)不同等問(wèn)題，而質(zhì)譜法具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、選擇性強(qiáng)、線性范圍寬的特點(diǎn)。此外，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行含量測(cè)定，同時(shí)掃描正負(fù)離子對(duì)，相較于紫外檢測(cè)器，檢驗(yàn)的時(shí)間更短，結(jié)果更準(zhǔn)確。

3.2監(jiān)測(cè)離子對(duì)的選擇 質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式以特征離子為目標(biāo)，選擇合適的母離子和子離子是檢測(cè)的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)先以全掃描模式確定母離子，再優(yōu)化碎裂能量和碰撞能量，確定信號(hào)響應(yīng)最強(qiáng)的子離子，最終為11種成分各確定1對(duì)定量離子。

3.3流動(dòng)相的選擇 分別比較了乙腈-水、乙腈-1 mL·L-1甲酸、甲醇-水、甲醇-1 mL·L-1甲酸作為流動(dòng)相的檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)乙腈和甲醇均能達(dá)到較好的分離效果，并且乙腈較甲醇具有更強(qiáng)的洗脫能力和更低的洗脫壓力。少量甲酸的加入既改善了峰形，又提高了響應(yīng)，因此，最終選用乙腈-1 mL·L-1甲酸作為流動(dòng)相。

3.4提取溶劑的選擇 由于有效成分多為酚酸和皂苷類(lèi)化合物，二者在水和甲醇中溶解度高，比較甲醇、體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇、體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇的提取效果，發(fā)現(xiàn)體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇的提取效果最好，干擾較少，最終選用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇作為提取溶劑。

3.5提取方法的選擇 比較超聲和回流2種提取方法，結(jié)果顯示，在相同提取時(shí)間下，回流提取液的含量高于超聲提取液，最終選用回流提取法。

3.6提取時(shí)間的選擇 比較回流提取30、60、90 min的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)提取60 min時(shí)，各成分含量基本一致，最終選用提取時(shí)間為60 min。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本方法具有前處理簡(jiǎn)便、分析時(shí)間短、結(jié)果準(zhǔn)確、檢測(cè)成分多等特點(diǎn)，可為杞菊地黃丸的質(zhì)量控制提供參考。