幽門螺桿菌的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)及其主要抗原表位

景榮先,劉昆梅,徐鎧琳,邢以文,薛 滿,湯 鋒,郭 樂*,張國(guó)林*

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院(蘇州市立醫(yī)院)藥學(xué)部，蘇州 215000；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750021；3.蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，蘇州 215000；4.青海大學(xué)，西寧 810001)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)是定植于胃和十二指腸的微需氧、革蘭陰性螺旋彎曲菌，是慢性胃炎、消化性胃潰瘍和胃癌的重要致病因子。國(guó)際癌癥機(jī)構(gòu)已將H.pylori定義為胃癌的Ⅰ類致癌物。在世界范圍內(nèi)，H.pylori的感染率超過50%，我國(guó)67%～80%的胃潰瘍和95%的十二指腸潰瘍是由H.pylori感染引起的[1]。臨床治療H.pylori感染性胃病主要采用多聯(lián)抗生素療法，但抗生素導(dǎo)致的H.pylori耐藥性、治療后復(fù)發(fā)感染和破壞腸道微生態(tài)平衡、藥物毒性和不良反應(yīng)等局限性使其應(yīng)用受到較大限制?；诙喾N抗原(或抗體)的組合表位同時(shí)具備了高靈敏度和高特異性的優(yōu)點(diǎn)，其在H.pylori診斷和疫苗及抗體等生物技術(shù)藥物開發(fā)方面具有廣闊的前景。

H.pylori感染的檢測(cè)可基于胃黏膜活檢組織、呼氣標(biāo)本、胃液、血清、尿液及糞便等多種標(biāo)本進(jìn)行?？焖倌蛩孛冈囼?yàn)(RUT)檢測(cè)H.pylori感染需要取胃竇和胃體等胃部組織，受試劑pH值、取材部位、組織大小、細(xì)菌量和環(huán)境溫度等因素影響較大；胃組織學(xué)檢測(cè)因不同染色方法而呈現(xiàn)的檢測(cè)結(jié)果存在較大的差異性；培養(yǎng)法檢測(cè)H.pylori感染，操作復(fù)雜、耗時(shí)，且標(biāo)本轉(zhuǎn)送培養(yǎng)需專門的轉(zhuǎn)送液并保持低溫；尿素呼氣試驗(yàn)(UBT)檢測(cè)H.pylori，準(zhǔn)確性高，易于操作，可反映全胃H.pylori感染狀況，克服因細(xì)菌呈“灶性”分布而造成的假陰性。但UBT檢測(cè)值處于臨界值附近時(shí)，結(jié)果不可靠。免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展和菌體表面關(guān)鍵抗原為免疫學(xué)檢測(cè)H.pylori感染奠定了基礎(chǔ)。

1 H.pylori的免疫學(xué)檢測(cè)

隨著單克隆抗體制備與純化工藝研究的不斷深入，基于抗原-抗體反應(yīng)的H.pylori檢測(cè)技術(shù)取得了突破性進(jìn)展。酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測(cè)定法、膠體金免疫分析法、免疫印跡法和蛋白質(zhì)芯片分析法等[2]都在分析H.pylori感染方面取得了較大的進(jìn)步。

膠體金免疫分析法是繼酶、熒光素和同位素標(biāo)記后的又一免疫標(biāo)記技術(shù)，且在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。膠體金免疫層析、免疫金滲濾法、快速免疫測(cè)試卡和金標(biāo)試紙條法是H.pylori檢測(cè)的主流方法。基于膠體金檢測(cè)技術(shù)的H.pylori抗體(或抗原)檢測(cè)也具有較高的靈敏度和特異性，適合于H.pylori感染的大規(guī)模流行病學(xué)篩查。目前已有基于膠體金技術(shù)的H.pylori診斷試劑盒產(chǎn)品獲國(guó)家藥監(jiān)局批準(zhǔn)，本課題組也在開展基于H.pylori多重關(guān)鍵抗體的檢測(cè)試劑的開發(fā)。

ELISA測(cè)定是將特定的抗原或抗體吸附于固定相表面，加入待檢測(cè)的抗體或抗原與之反應(yīng)，再加入標(biāo)記的二次抗原或抗體待測(cè)抗體或抗原反應(yīng)，最終根據(jù)顯色情況進(jìn)行分析的方法。ELISA檢測(cè)H.pylori抗體(或抗原)具有靈敏度高和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，且操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)速度快，適合于糞便、尿液、血液或唾液等樣本的分析?；贓LISA測(cè)定的H.pylori檢測(cè)適合于大規(guī)模的流行病學(xué)篩查。

免疫印跡法是將H.pylori中的蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至纖維素膜上后，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫雜交后顯色來判斷H.pylori的感染情況。免疫印跡法可用于H.pylori的檢測(cè)，且靈敏度高，特異性強(qiáng)，無創(chuàng)，但操作相對(duì)復(fù)雜，不適合大規(guī)模的流行病學(xué)篩查。

蛋白質(zhì)芯片分析法是將H.pylori抗原包被后固定于固相膜上，將待測(cè)樣本在固相膜上發(fā)生抗原抗體反應(yīng)實(shí)現(xiàn)樣本的檢測(cè)。蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)H.pylori可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，適合于流行病學(xué)檢測(cè)。目前已有包被空泡毒素相關(guān)蛋白A(VacA)、細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A(CagA)、熱休克蛋白60(Hsp60)、尿素酶(Ure)和氧不敏感的 NADPH 硝基還原酶(RdxA)等抗原的H.pylori檢測(cè)用芯片。

H.pylori特異性抗原或關(guān)鍵抗原是基于免疫反應(yīng)的H.pylori檢測(cè)的關(guān)鍵，也是H.pylori疫苗開發(fā)的基礎(chǔ)。通常情況下，理想的抗原應(yīng)具有高免疫原性、高特異性、易制備、易儲(chǔ)存、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。Ure、細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A/L(CagA/L)、VacA和中性粒細(xì)胞激活蛋白(NAP)是H.pylori致病性的關(guān)鍵表面抗原，也是目前診斷試劑和疫苗開發(fā)的基礎(chǔ)。采用原核表達(dá)制備上述抗原具有理想抗原的特點(diǎn)，適合于診斷產(chǎn)品的開發(fā)。

2 H.pylori的毒力蛋白抗原與應(yīng)用

2.1Ure Ure為含有鎳離子的金屬酶，是H.pylori中含量最高的蛋白，占菌體可溶性蛋白的5%～10%[3]。Ure的結(jié)構(gòu)亞單位有尿素酶A(UreA)和尿素酶B(UreB)，其中UreB為Ure的活性亞基，相對(duì)分子質(zhì)量較大，具有高度的序列保守性和免疫原性?；赨reB活性的RUT及UBT是臨床診斷H.pylori感染的重要手段。UreB也是開發(fā)H.pylori疫苗的最佳候選抗原。

Ure是H.pylori感染診斷的重要分子基礎(chǔ)。RUT是基于H.pylori產(chǎn)生的Ure可分解尿素產(chǎn)生NH3和CO2，而前者可使胃黏膜組織pH值升高。通過肉眼觀察pH指示劑顏色的變化可判斷是否有H.pylori感染。RUT試劑成本低、檢測(cè)速度快、靈敏度較高，但其必須依賴胃鏡檢查，屬于侵入性的檢查手段。UBT是基于同位素標(biāo)記的尿素可被H.pylori產(chǎn)生的Ure分解產(chǎn)生CO2，通過CO2中的碳同位素來判斷胃部H.pylori的感染情況。UBT的同位素標(biāo)記可采用13C或14C標(biāo)記。UBT屬于非侵入性診斷手段，但檢測(cè)過程中使用的閃爍液具有一定的輻射性，不宜對(duì)兒童或孕婦進(jìn)行檢測(cè)。

Ure是亞單位疫苗和表位疫苗重要的分子基礎(chǔ)。亞單位疫苗也稱組分疫苗，是近年來疫苗研究領(lǐng)域的重點(diǎn)，是通過提取微生物的特殊蛋白結(jié)構(gòu)，篩選出具有免疫活性的片段制成的疫苗[4]。UreB亞單位不具有Ure的全酶活性，但具有無毒性和高免疫原性，是目前研究最廣泛的H.pylori疫苗抗原[5]。UreB基因在不同菌株之間具有高度的序列保守性，呈現(xiàn)出較高的免疫原性的穩(wěn)定性。雖然從H.pylori菌體中直接分離到的UreB數(shù)量較少，但通過基因重組與原核表達(dá)制備UreB技術(shù)的成熟為特異性UreB疫苗設(shè)計(jì)和開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。表位疫苗是利用基因工程的手段，通過人工合成或體外表達(dá)病原體表位，并將其作為疫苗使用。UreB蛋白是由569個(gè)氨基酸構(gòu)成的大分子，將整個(gè)蛋白作為疫苗抗原存在成分復(fù)雜、特異性低和免疫應(yīng)答弱的局限性，而探索UreB蛋白中激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答的免疫保護(hù)性優(yōu)勢(shì)抗原表位作為抗原具有較高的價(jià)值。目前UreB蛋白的B細(xì)胞表位已經(jīng)得到了深入的研究。在分析UreB亞單位免疫小鼠的模型時(shí)發(fā)現(xiàn)有2個(gè)確定的UreB表位具有保護(hù)性：UreB373-385和UreB317-329，且佐劑和疫苗接種途徑會(huì)影響T細(xì)胞對(duì)抗原表位的反應(yīng)[6]。將霍亂毒素B亞單位(CTB)、H.pylori尿素酶Ⅰ亞單位(UreI20-29，UreI98-107)和H.pyloriUreB亞單位的4個(gè)抗原片段(UreB12-23，UreB229-251，UreB327-400和UreB515-561)連接起來，構(gòu)建的多表位疫苗CTB-UreI-UreB(BIB)免疫BALB/c小鼠后發(fā)現(xiàn)小鼠對(duì)H.pylori攻擊有顯著的抵抗作用，而單獨(dú)用佐劑重組霍亂毒素B亞單位(rCTB)或PBS免疫小鼠均未發(fā)現(xiàn)保護(hù)作用，提示BIB多表位疫苗是有潛力的候選疫苗[7]。用重組Hp尿素酶B亞單位(rUreB)接種BALB/c小鼠可產(chǎn)生顯著的抗原特異性Th1和Th17免疫應(yīng)答，在免疫小鼠中發(fā)現(xiàn)了UreB317-329和UreB409-421 2個(gè)新的Th表位，二者可被大量CD4+T細(xì)胞識(shí)別，且可通過誘導(dǎo)Th1淋巴細(xì)胞介導(dǎo)對(duì)H.pylori的保護(hù)作用[8]。包含Ure基因的H.pylori多價(jià)表位疫苗CWAE具有科學(xué)合理的抗原結(jié)構(gòu)，具有激發(fā)BALB/c小鼠產(chǎn)生H.pylori特異性抗體體液免疫和淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用[9]。同時(shí)，口服H.pylori多價(jià)表位疫苗CTB-Hap A-UreA-UreB-CagA (CTB-HUUC)后，BABL/c小鼠體內(nèi)Ure試驗(yàn)陽(yáng)性率明顯降低，對(duì)H.pylori感染的預(yù)防效果明顯[10]，且口服CTB-HUUC多價(jià)表位疫苗也能有效治療H.pylori對(duì)BABL/c小鼠的感染。但應(yīng)當(dāng)指出的是，不同途徑、不同劑量的UreB抗原對(duì)高效價(jià)H.pyloriUreB亞單位重組蛋白免疫血清的產(chǎn)量和活性有重要影響[11]。

2.2細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白 CagA/L是由CagA致病島基因編碼的親水性外膜蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為120～140 kDa，具有強(qiáng)免疫原性。CagA蛋白羧基端具有5個(gè)重復(fù)氨基酸基序(EPIYA基序)，且基于EPIYA基序，H.pylori可分為東亞型和西方型。CagA通過依賴或不依賴?yán)野彼崃姿峄{(diào)控細(xì)胞增殖和分化，并能夠引起胃上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化而誘發(fā)癌變。CagA蛋白依據(jù)蛋白大小可分為A、B、C和D型，其一方面可刺激產(chǎn)生生長(zhǎng)因子誘發(fā)癌變，另一方面也可誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑P21活性。CagA蛋白也是H.pylori引起炎癥反應(yīng)的效應(yīng)分子，CagA陽(yáng)性(CagA+)H.pylori誘發(fā)胃癌風(fēng)險(xiǎn)是CagA陰性(CagA-)H.pylori的7.4倍。

CagA與H.pylori感染密切相關(guān)，是H.pylori感染診斷的重要標(biāo)志物，且CagA+H.pylori感染是結(jié)直腸腺瘤的危險(xiǎn)因素。H.pylori感染是結(jié)直腸腺瘤的重要致病因子，CagA+H.pylori感染可能通過促進(jìn)患者血清炎癥因子及胃泌素水平參與慢性胃炎患者胃黏膜一系列病理改變的發(fā)生和進(jìn)展過程[12]，且CagA+H.pylori感染可通過促進(jìn)患者血清炎癥因子及胃泌素刺激結(jié)直腸腺瘤細(xì)胞的異常增殖、分化，進(jìn)而引起結(jié)直腸腺瘤[13]。UBT聯(lián)合CagA、VacA、UreA和UreB等抗體分型有助于診斷H.pylori感染[14]。運(yùn)用蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)H.pylori抗體、CagA、VacA和Ure的分型有助于臨床H.pylori感染的明確診斷和H.pylori的根除率[15]。同時(shí)，H.pylori的感染與患者的CagA基因表達(dá)呈顯著相關(guān)性，且CagA聯(lián)合VacA可提高H.pylori感染診斷的靈敏度與準(zhǔn)確性[16-17]。

CagA蛋白是H.pylori感染的生物標(biāo)志物，具有較好的免疫原性，是開發(fā)H.pylori預(yù)防性疫苗和治療性疫苗的良好抗原[18]。用3種重組H.pylori抗原VacA、CagA和NAP組成的疫苗免疫原性強(qiáng)，進(jìn)行肌肉免疫后可預(yù)防H.pylori感染，健康成人耐受性好[19]。治療性疫苗接種是控制H.pylori感染的理想選擇。以不同方式表達(dá)H.pyloriCagA、VacA和UreB融合蛋白的減毒沙門氏菌載體疫苗對(duì)H.pylori感染的治療效果與融合蛋白的排列有關(guān)，且有望成為抗H.pylori的候選疫苗[20]。慢性感染H.pylori病原體會(huì)導(dǎo)致胃炎和胃潰瘍，并使攜帶者更容易患胃癌[21]，而H.pylori特異性疫苗接種是一種有廣泛前途的胃癌預(yù)防策略。CagA+H.pylori感染可引起小鼠CD4+T細(xì)胞反應(yīng)，而黏膜或腸外接種重組CagA可顯著增強(qiáng)CD4+T細(xì)胞反應(yīng)。將CagA特異性T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移到T細(xì)胞缺陷、H.pylori感染的受體中，足以誘導(dǎo)癌前免疫病理學(xué)的全面發(fā)生。用霍亂毒素佐劑的CagA+全細(xì)胞超聲疫苗免疫小鼠，可使其對(duì)H.pylori相關(guān)胃癌前體病變敏感[22]。

細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白L(CagL)為H.pyloriⅣ型分泌系統(tǒng)(TFSS)菌毛結(jié)構(gòu)表面蛋白，屬于H.pylori的伴侶蛋白，發(fā)揮連接TFSS與靶細(xì)胞的特異性黏附作用。H.pyloriCagL氨基酸多態(tài)性與消化性潰瘍及胃癌的發(fā)生有關(guān)，D58位點(diǎn)GG、AG基因型與E59位點(diǎn)AA、AG基因型可增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[23]。H.pylori重組抗原表位肽C-CagA/L能特異性識(shí)別CagA和CagL，具有預(yù)防H.pylori感染的免疫潛力[24]。基于CagL雙抗體夾心ELISA抗原檢測(cè)方法基本滿足敏感性高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，建立的試劑盒批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)性均較好，批內(nèi)變異系數(shù)在1.65%～10.5%之間，批間變異系數(shù)在1.3%～9.35%之間[25]。

2.3VacA VacA為相對(duì)分子質(zhì)量為88 kDa的蛋白，幾乎存在于所有的H.pylori菌株中。VacA具有多種生物學(xué)活性，可誘導(dǎo)細(xì)胞空泡樣變性和致細(xì)胞凋亡，也可通過多種信號(hào)通路發(fā)揮細(xì)胞毒作用，損傷機(jī)體。胃潰瘍、萎縮性胃炎的VacA基因表達(dá)率明顯高于淺表性胃炎，VacA相對(duì)表達(dá)量可作為淺表性胃炎、萎縮性胃炎的指標(biāo)[26]，且H.pylori毒力基因CagA、VacA和IceA與胃十二指腸疾病的發(fā)生及惡化密切相關(guān)[27]。H.pylori空泡毒素VacA可促進(jìn)胃上皮細(xì)胞NLRP3炎性小體激活[28]，且VacA基因可能與H.pylori對(duì)克拉霉素產(chǎn)生耐藥性相關(guān)[29]?？诜筕acA-免疫球蛋白Y(IgY)對(duì)H.pylori定植有保護(hù)作用，并能誘導(dǎo)胃組織發(fā)生組織學(xué)改變，且VacA-IgY有望成為治療H.pylori感染的新藥候選藥物[30]。

VacA是H.pylori關(guān)鍵抗原之一，是判定H.pylori感染和開發(fā)H.pylori疫苗的關(guān)鍵蛋白。H.pylori重組空泡細(xì)胞毒素(rVacA)保留天然構(gòu)象表位，可作為抗H.pylori治療的疫苗抗原：具有構(gòu)象表位的rVacA抗原具有潛在的疫苗成分，可用于血清學(xué)和組織病理學(xué)分析[31]?？张菪约?xì)胞毒素A作為H.pylori分泌的主要毒素之一，能誘導(dǎo)胃細(xì)胞胞漿內(nèi)形成“空泡”樣的膜小泡。VacA具有破壞線粒體功能、刺激細(xì)胞凋亡、阻斷T細(xì)胞增殖、促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖等作用，是一種很有前途的疫苗靶點(diǎn)，且已被評(píng)估為疫苗抗原[32]。在利用釀酒酵母表面展示技術(shù)篩選H.pylori候選疫苗時(shí)證實(shí)VacA抗原蛋白可成功在S.cerevisiaeEBY100表面展示，小鼠經(jīng)口服免疫S.cerevisiaeEBY100/p YD1-VacA后可誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的VacA特異性抗體，提示VacA可作為H.pylori疫苗開發(fā)的潛在抗原[33]。VacA毒素在臨床表現(xiàn)上具有很高的效價(jià)，有助于H.pylori的持續(xù)和定植，因此被認(rèn)為是生產(chǎn)疫苗和單克隆抗體(mAb)的關(guān)鍵成分之一[34]。

治療性疫苗接種是控制H.pylori感染的理想選擇，而VacA是開發(fā)口服疫苗的關(guān)鍵蛋白之一。表達(dá)融合蛋白CVU(CagA、VacA和UreB融合蛋白)的減毒沙門氏菌口服治療性免疫可顯著降低H.pylori在胃中的定植；融合蛋白的保護(hù)作用與特異性CD4+T細(xì)胞Th1型反應(yīng)、血清免疫球蛋白G(IgG)和黏膜分泌型免疫球蛋白A(SIgA)抗體反應(yīng)有關(guān)，表明表達(dá)融合蛋白CVU的減毒沙門氏菌載體疫苗優(yōu)于其他疫苗，有望成為抗H.pylori的候選疫苗[20]。

2.4NAP NAP位于H.pylori體內(nèi)，是鐵蛋白的一種，能激活中性粒細(xì)胞釋放活性氧簇。有證據(jù)顯示過氧化狀態(tài)與胃癌的發(fā)生過程密切相關(guān)[35]。NAP蛋白是H.pylori的重要毒力因子，與H.pylori的高致病性密切相關(guān)，NAP蛋白可通過自溶釋放引起中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞向胃黏膜浸潤(rùn)，導(dǎo)致胃黏膜驗(yàn)證損傷，也可通過誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞釋放還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶等導(dǎo)致大量活性氧中間產(chǎn)物的釋放，并攻擊宿主細(xì)胞DNA分子誘導(dǎo)突變。

NAP具有很強(qiáng)的免疫原性，可用于H.pylori疫苗的開發(fā)。NAP在H.pylori疫苗開發(fā)方面有巨大的潛力，載體介導(dǎo)的H.pyloriNAP是疫苗研制的重要候選分子[36]。具有穩(wěn)定基因型和表型的鼠傷寒沙門菌是重組多價(jià)疫苗的表達(dá)載體，如伴芳香族氨基酸基因缺失的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株以及伴腺苷酸環(huán)化酶、腺苷酸環(huán)化酶(cAMP)受體蛋白和天冬氨酸β半醛脫氫酶基因缺失營(yíng)養(yǎng)缺陷突變株等。在分析表達(dá)H.pyloriNAP的減毒沙門疫苗菌對(duì)人類H.pylori感染的小鼠模型的免疫保護(hù)作用時(shí)證實(shí)重組疫苗菌對(duì)H.pylori感染小鼠具有一定免疫預(yù)防作用，可作為多組分重組減毒沙門疫苗菌的侯選菌株之一[37]。除沙門菌外，乳酸菌也是表達(dá)中性粒細(xì)胞激活蛋白A(NapA)疫苗的潛在載體。表達(dá)H.pyloriNapA的重組乳酸乳球菌菌株為研究NapA作為疫苗抗原和免疫調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，擴(kuò)增的NapA基因構(gòu)建的重組乳酸乳球菌經(jīng)乳鏈菌肽(nisin)誘導(dǎo)可表達(dá)相對(duì)分子質(zhì)量為19 kD的重組蛋白，該重組蛋白可被小鼠抗H.pylori血清識(shí)別，具有口服疫苗和黏膜免疫調(diào)節(jié)的應(yīng)用潛力[38]。表達(dá)NAP蛋白的乳酸菌免疫小鼠后，能夠刺激小鼠產(chǎn)生特異的IgG和免疫球蛋白A(IgA)，提示乳酸菌可作為抗原遞送載體，且為基于NAP蛋白的H.pylori口服疫苗的開發(fā)奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[39]。表面表達(dá)H.pyloriNAP蛋白的重組枯草芽孢桿菌具有較強(qiáng)的免疫性，免疫小鼠15 d后NAP特異性IgG升高即達(dá)高峰[40]。表位疫苗是治療性H.pylori感染的有效疫苗。含有H.pylori各種抗原的多價(jià)亞單位疫苗優(yōu)于單價(jià)亞單位疫苗。然而，多價(jià)表位疫苗在治療性H.pylori疫苗中是否優(yōu)于單價(jià)表位疫苗尚存在爭(zhēng)議。研究顯示，H.pyloriUre、NAP、熱休克蛋白60(HSP60)和H.pylori黏附素a(HpaA)的多價(jià)表位疫苗能誘導(dǎo)抗H.pyloriUre特異性抗體，提示基于多價(jià)表位的H.pylori抗原表位和B細(xì)胞表位的多價(jià)表位疫苗可能是一種有前途的抗H.pylori感染的候選疫苗[41]。利用H.pyloriNAP的佐劑活性，可有效誘導(dǎo)T細(xì)胞的活化和增殖，提高樹突狀細(xì)胞疫苗的免疫效果[42]。

3 小結(jié)

H.pylori是危害人類健康的常見病原體。對(duì)感染H.pylori的診斷是治療和判斷預(yù)后的前提。近年來，ELISA測(cè)定法、膠體金免疫分析法、免疫印跡法和蛋白質(zhì)芯片分析法等都在H.pylori感染分析方面取得了較大的進(jìn)步。H.pylori特異性抗原或關(guān)鍵抗原是免疫反應(yīng)檢測(cè)H.pylori的關(guān)鍵，也是開發(fā)H.pylori疫苗的基礎(chǔ)。Ure、CagA/L、VacA、NAP等是H.pylori致病性的關(guān)鍵表面抗原，具有高免疫原性、高特異性、易制備、易儲(chǔ)存和穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，是目前H.pylori診斷試劑和疫苗開發(fā)的基礎(chǔ)。同時(shí)檢測(cè)H.pylori的多種抗原/抗體可明顯提高檢測(cè)的靈敏度，而針對(duì)性分析抗原/抗體關(guān)鍵表位可以提高檢測(cè)的特異性。構(gòu)建多重抗原(或抗體)表位的表達(dá)載體是實(shí)現(xiàn)這一目的的有效途徑。本課題組通過設(shè)計(jì)多重抗原/抗體表位的表達(dá)載體開展了基于膠體金免疫技術(shù)的H.pylori診斷試劑盒開發(fā)研究，取得了較好的結(jié)果。應(yīng)當(dāng)指出的是，采用原核表達(dá)多重抗原/抗體蛋白的合成速率、蛋白的折疊率、肽鏈聚集的速率是影響診斷試劑和生物技術(shù)藥物開發(fā)的關(guān)鍵因素，尤其是可溶性蛋白的折疊結(jié)構(gòu)和免疫原性。