基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析七味都?xì)馔柚委熉宰枞苑渭膊〉淖饔脵C(jī)制

張海東，曲妮妮

(1． 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110032；2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種以咳嗽、咳痰、喘息、胸悶、氣短為主要臨床表現(xiàn)的，以持續(xù)性氣流受限為主要特征的慢性疾病。隨著人口老齡化的逐漸加劇，COPD的發(fā)病率及病死率也在逐年增高，并且COPD的并發(fā)癥較多，如呼吸衰竭、肺源性心臟病、自發(fā)性氣胸、胃食管反流、骨質(zhì)疏松、抑郁癥、焦慮癥等，該病病程長(zhǎng)、花費(fèi)大，對(duì)生活質(zhì)量有較大的影響。西醫(yī)治療COPD主要以抗感染、抗炎、解痙平喘、化痰、擴(kuò)張支氣管等手段為主，其中激素治療效果顯著，但不可避免地帶來(lái)一系列不良反應(yīng)，且會(huì)影響體內(nèi)的多巴胺及5-羥色胺含量，影響人體情緒，誘發(fā)抑郁、焦慮等，且長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用激素會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、胃應(yīng)激性潰瘍等疾病。 近些年很多研究表明，中西醫(yī)結(jié)合治療COPD可減少西藥帶來(lái)的不良反應(yīng)，并協(xié)同增強(qiáng)其藥物作用[1-2]。七味都?xì)馔铻榍宕t(yī)家張溫所著《張氏醫(yī)通》中所記載的經(jīng)典方劑，其中僅熟地黃、山萸肉、山藥、澤瀉、牡丹皮、茯苓、五味子7味中藥，為補(bǔ)腎斂肺、治療肺腎氣虛證的經(jīng)典方劑，此方為千古名方“六味地黃丸”加一味收斂之藥——五味子組成，臨床常用于喘病肺腎氣虛證的治療，療效顯著。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析七味都?xì)馔柚委烠OPD的作用機(jī)制及通路，旨在為中醫(yī)藥治療該病的研究提供進(jìn)一步參考。

1 資料與方法

1.1七味都?xì)馔栌行С煞趾Y選 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)七味都?xì)馔柚懈魑吨兴庍M(jìn)行有效成分檢索，并根據(jù)口服藥物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為篩選條件進(jìn)行篩選，最后得到各藥物有效成分。

1.2七味都?xì)馔璋悬c(diǎn)預(yù)測(cè)篩選及復(fù)方活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 對(duì)篩選得到的有效活性成分，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中的化合物關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)(Related Targets)，通過(guò)Activeperl 5.28.1軟件運(yùn)行g(shù)etTargrts.pl腳本將7味中藥的活性成分進(jìn)行逐一配對(duì)潛在靶點(diǎn)(Targets Name)。運(yùn)用addSymbol.pl腳本通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)處理，得到標(biāo)準(zhǔn)名稱(Targets Symbol)，經(jīng)過(guò)以上數(shù)據(jù)庫(kù)得到的靶點(diǎn)即為中藥中活性成分相關(guān)靶點(diǎn)。最后，利用Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)COPD相關(guān)靶點(diǎn)篩選，得到疾病相關(guān)靶點(diǎn)。運(yùn)用R 3.6.3軟件將藥物活性成分相關(guān)靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)取交集，重合的靶點(diǎn)即為七味都?xì)馔杌钚猿煞肿饔糜诩膊〉南嚓P(guān)靶點(diǎn)，得到藥物-疾病的重合靶點(diǎn)，并制作韋恩圖。根據(jù)各成分性質(zhì)的不同予以標(biāo)記，運(yùn)用Cytoscape軟件進(jìn)行中藥-化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及進(jìn)行可視化分析。

1.3蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析 利用String在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)的蛋白間相互作用(protein protein interaction,PPI)進(jìn)行分析，將靶點(diǎn)信息導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，物種選擇人類(Homo sapiens)，將蛋白互作綜合得分>0.4作為篩選條件從而得到靶點(diǎn)的PPI信息，最后將得到的PPI信息導(dǎo)入Cytoscape軟件，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4靶點(diǎn)基因本體論(gene ontology,GO)和KEGG通路富集分析 運(yùn)用R語(yǔ)言，利用bioconductor數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)得到的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，保留P≤0.05的結(jié)果，得到GO及KEGG信號(hào)通路柱狀圖、氣泡圖，并獲取靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)一步說(shuō)明靶點(diǎn)和信號(hào)通路在七味都?xì)馔柚委烠OPD的作用。

1.5靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運(yùn)用Cytoscape軟件，將靶點(diǎn)信息及KEGG富集所得到的的通路信息導(dǎo)入，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，得到靶點(diǎn)與信號(hào)通路之間的網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié) 果

2.1方劑的中藥成分篩選 篩選最后得到81個(gè)有效成分，其中熟地2個(gè)，五味子8個(gè)，山藥16個(gè)，茯苓15個(gè)，丹皮11個(gè)，澤瀉10個(gè)，山萸肉20個(gè)。

2.2疾病相關(guān)的中藥活性成分靶點(diǎn)篩選 得到中藥中活性成分相關(guān)靶點(diǎn)共287個(gè)，排除重復(fù)之后共得到相關(guān)靶點(diǎn)102個(gè)。利用Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)COPD相關(guān)靶點(diǎn)篩選，得到疾病相關(guān)靶點(diǎn)5 971個(gè)。運(yùn)用R語(yǔ)言得到藥物與疾病的靶點(diǎn)交集共89個(gè)，見(jiàn)表1；繪制韋恩圖，見(jiàn)圖1。

圖1 七味都?xì)馔枧c慢性阻塞性肺疾病重合的靶點(diǎn)韋恩圖

表1 七味都?xì)馔枧c慢性阻塞性肺疾病交集靶點(diǎn)

2.3中藥-化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)組成復(fù)方的中藥、化合物、核心靶點(diǎn)以及疾病信息，運(yùn)用Cytoscape軟件構(gòu)建七味都?xì)馔璧摹爸兴?化合物-靶點(diǎn)-疾病”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖(圖2)。圖中正六邊形代表七味都?xì)馔璺街械?味中藥，淺藍(lán)色代表七味都?xì)馔柚委烠OPD的化合物，淺綠色代表七味都?xì)馔柚委烠OPD的核心靶點(diǎn)，深綠色代表COPD。圖中包含175個(gè)節(jié)點(diǎn)，449條邊，通過(guò)對(duì)網(wǎng)絡(luò)分析得知，按照degree度值排序，其中排在第一位的化合物為槲皮素(quercetin)，其次依次是豆甾醇(Stigmasterol)、山柰酚(kaempferol)、β-谷固醇(beta-sitosterol)、谷甾醇(sitosterol)、四氫鴨腳木堿(Tetrahydroalstonine)、海風(fēng)藤酮(Kadsurenone)、薯蕷皂苷配基(diosgenin)、常春藤皂苷元(hederagenin)。前十位基因依次是NCOA2、PGR、NR3C2、PTGS1、CHRM1、GABRA1、CHRM3、CHRM2、AR、PRSS1。并且各個(gè)靶點(diǎn)連接多種不同的化合物，說(shuō)明七味都?xì)馔柚械幕衔锸峭ㄟ^(guò)這些靶點(diǎn)來(lái)調(diào)控疾病的，可以得出中藥復(fù)方通過(guò)多靶點(diǎn)-多化合物共同調(diào)控整個(gè)疾病的治療過(guò)程。

圖2 七味都?xì)馔璧闹兴?化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.4PPI構(gòu)建 運(yùn)用String數(shù)據(jù)庫(kù)，將藥物與疾病相同基因?qū)?，生物篩選條件選擇人類(Homo sapiens)，經(jīng)過(guò)設(shè)置，隱藏游離的點(diǎn)位，剩余87個(gè)蛋白，其蛋白互作關(guān)系如圖3。再運(yùn)用Cytoscape軟件對(duì)圖3進(jìn)行處理，將蛋白根據(jù)degree值大小進(jìn)行處理，degree值越大，其圖形越大顏色也就越深，這樣能更明顯地看出各蛋白之間的互作關(guān)系，如圖4。最后，運(yùn)用R語(yǔ)言對(duì)各蛋白進(jìn)行排序，取前20位，如圖5。與各項(xiàng)密切相關(guān)的是IL6，有54個(gè)互作關(guān)系，其次依

圖3 七味都?xì)馔枧c慢性阻塞性肺疾病蛋白互作網(wǎng)絡(luò)1

圖4 七味都?xì)馔枧c慢性阻塞性肺疾病核心網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建2

圖5 七味都?xì)馔枧c慢性阻塞性肺疾病核心網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)3

次為CASP3、VEGFA、MAPK8、EGFR、MYC、ESR1、CCND1、FOS、AR、ERBB2、MTOR、PPARG、RELA、PGR、NOS3、HIF1A、NR3C1、CAV1、AHR。

2.5GO富集及KEGG通路分析

2.5.1GO富集分析 共得到112個(gè)生物過(guò)程，按生物過(guò)程中包含基因數(shù)及padjust值為標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)R語(yǔ)言以篩選取前20位制作點(diǎn)狀圖(見(jiàn)圖6)，其分為生物過(guò)程(BP)、細(xì)胞組成(CC)、分子功能(MF)3個(gè)方面，分別是DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性(DNA-binding transcription activator activity, RNA polymerase Ⅱ-specific)；泛素樣蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin-like protein ligase binding)；泛素蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin protein ligase binding)；RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(RNA polymerase Ⅱ transcription factor binding)；核受體活性(nuclear receptor activity)；轉(zhuǎn)錄因子活性，直接的配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA結(jié)合(transcription factor activity, direct ligand regulated sequence-specific DNA binding)；類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)；類固醇結(jié)合(steroid binding)；核激素受體結(jié)合(nuclear hormone receptor binding)；氧化還原酶活性，作用于成對(duì)的供體上，并結(jié)合或還原分子氧(oxidoreductase activity, acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen)；G蛋白耦聯(lián)的胺受體活性(G protein-coupled amine receptor activity)；激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(activating transcription factor binding)；激素結(jié)合(hormone binding)；神經(jīng)遞質(zhì)受體活性(neurotransmitter receptor activity)；乙酰膽堿受體活性(acetylcholine receptor activity)；G蛋白耦聯(lián)的血清素受體活性(G protein-coupled serotonin receptor activity)；血清素受體活性(serotonin receptor activity)；谷胱甘肽結(jié)合(glutathione binding)；寡肽結(jié)合(oligopeptide binding)；氧化還原酶活性，以NAD(P)H，血紅素蛋白為受體起作用(oxidoreductase activity, acting on NAD(P)H, heme protein as acceptor)。

圖6 七味都?xì)馔柚兄委熉宰枞苑渭膊〉陌悬c(diǎn)GO富集點(diǎn)狀圖

2.5.2KEGG通路分析 共得到122個(gè)富集信息，包含疾病、炎癥信號(hào)通路、病毒感染通路、免疫信號(hào)通路、代謝過(guò)程等，以P<0.05，count值為標(biāo)準(zhǔn)，取前20位，制作柱狀圖見(jiàn)圖7。具體過(guò)程包括：PI3K-Akt 信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)；卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)；人巨細(xì)胞病毒感染(Human cytomegalovirus infection)；流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)；乙型肝炎(Hepatitis B)；癌癥相關(guān)蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)；前列腺癌(Prostate cancer)；肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma)；細(xì)胞凋亡(Apoptosis)；乳腺癌(Breast cancer)；大腸癌(Colorectal cancer)；糖尿病并發(fā)癥相關(guān)的AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)；TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)；甲狀腺激素信號(hào)通路(Thyroid hormone signaling pathway)；胰腺癌(Pancreatic cancer)；內(nèi)分泌抵抗(Endocrine resistance)；HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)；鉑耐藥(Platinum drug resistance)；EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)；膀胱癌(Bladder cancer)；本研究共得出信號(hào)通路39條，除此之外，還有IL-17 signaling pathway；C-type lectin receptor signaling pathway；T cell receptor signaling pathway；MAPK signaling pathway等比較重要的信號(hào)通路。

圖7 七味都?xì)馔柚兄委熉宰枞苑渭膊〉陌悬c(diǎn)KEGG 柱狀圖

2.5.3靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖 將靶點(diǎn)信息及39條通路信息導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖繪制，藍(lán)色正六邊形為信號(hào)通路，黃色圓形為靶點(diǎn)信息，以degree值為標(biāo)準(zhǔn)，值越大說(shuō)明兩者關(guān)系越緊密，圖形形狀越大。見(jiàn)圖8。其核心靶點(diǎn)為RAF1、RELA、MAPK8、IKBKB、PRKCA、NFKBIA、GSK3B、EGFR、CCND1、FOS、BCL2、IL-6等。

圖8 七味都?xì)馔柚兄委熉宰枞苑渭膊〉陌悬c(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

七味都?xì)馔柚械挠行С煞忠詃egree度值排序，從高到低依次為：槲皮素(quercetin)、豆甾醇(Stigmasterol)、山柰酚(kaempferol)、β-谷固醇(beta-sitosterol)、谷甾醇(sitosterol)、四氫鴨腳木堿(Tetrahydroalstonine)、海風(fēng)藤酮(Kadsurenone)、薯蕷皂苷配基(diosgenin)、常春藤皂苷元(hederagenin)。槲皮素是廣泛存在于自然界的黃酮類化合物，目前被證實(shí)其具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤、抗氧化及清除自由基等作用[3]。有研究表明，槲皮素可通過(guò)降低IL-6水平，降低小氣道及肺組織結(jié)構(gòu)被破壞從而導(dǎo)致肺功能下降的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，其還可以改善胰島素抵抗，降低體內(nèi)三酰甘油及TNF-α、IL-8等炎癥因子的水平，從而降糖、降脂、降低炎癥因子分泌水平[4]。山柰酚與槲皮素同屬自然界的黃酮類化合物，其作用與槲皮素較為相似，可顯著降低肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞的數(shù)量[5]，且會(huì)顯著改善肺泡充血及肺組織白細(xì)胞浸潤(rùn)等急性肺損傷的病理特征[6]。豆甾醇、谷甾醇、β-谷固醇均歸屬于類固醇范疇，這類化合物不僅可以調(diào)節(jié)膽固醇含量，并且具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[7]，還可以降低TNF-α和pNF-κB表達(dá)，從而抑制肺纖維化的發(fā)生[8]。

從PPI網(wǎng)絡(luò)中可以得出，IL-6在其網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用，其次是CASP3、VEGFA、MAPK8、EGFR、MYC。IL-6是一種炎癥因子指標(biāo)，IL-6可通過(guò)影響氣道重塑功能，從而加重COPD的病情；且IL-6是COPD急性加重的重要危險(xiǎn)因素，COPD穩(wěn)定期患者IL-6水平升高會(huì)增加急性發(fā)作的風(fēng)險(xiǎn)[9]。劉溫娟等[10]研究證實(shí)IL-6在COPD全身炎癥反應(yīng)中起到了介導(dǎo)的作用，并且其在COPD合并肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到了重要作用。CASP3是檢測(cè)細(xì)胞凋亡的一項(xiàng)指標(biāo)，其水平可評(píng)價(jià)藥物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)是一種影響血管重塑及增長(zhǎng)的因子，VEGFA在COPD急性加重期可見(jiàn)明顯升高，可被視為急性發(fā)作期的血清標(biāo)志物之一[11]。VEGFA主要通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，并增加微血管通透性，從而誘導(dǎo)血管生長(zhǎng)[12]。絲裂原活化蛋白激酶8(MAKP8)可調(diào)控細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)、增殖各個(gè)階段，并對(duì)免疫功能進(jìn)行調(diào)控。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)在細(xì)胞生理活動(dòng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，EGFR與氣道黏液高分泌相關(guān)，抑制EGFR的表達(dá)可降低COPD的氣道黏液高分泌[13]。Myc是一種原癌基因，其參與了成纖維細(xì)胞的分化增殖，并導(dǎo)致瘢痕的增生，從而影響氣道重塑[14-15]。

根據(jù)GO富集分析結(jié)果得知，七味都?xì)馔柚饕ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑，核受體、轉(zhuǎn)錄因子、類固醇激素受體等活性及連接泛素樣蛋白連接酶、泛素蛋白連接酶、RNA聚合酶Ⅱ、核激素受體等受體表達(dá)而恢復(fù)呼吸系統(tǒng)的生理活動(dòng)。

通過(guò)KEGG通路分析結(jié)果可以看出，七味都?xì)馔柚委烠OPD主要是通過(guò)PI3K-Akt信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、TNF信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、相關(guān)病毒感染、相關(guān)疾病等生理過(guò)程來(lái)發(fā)揮治療作用的。以PI3K-Akt信號(hào)通路為例，該通路可在氣道慢性炎癥中通過(guò)對(duì)炎癥介質(zhì)釋放、炎癥細(xì)胞的活化及氣道重塑等功能的調(diào)控，從而發(fā)揮重要的作用[16-17]。COPD的炎癥反應(yīng)過(guò)程中，PI3K參與了其炎癥細(xì)胞的活化與聚集，而過(guò)量的炎癥細(xì)胞導(dǎo)致氣道收縮及重塑，并通過(guò)產(chǎn)生的多種蛋白酶對(duì)肺實(shí)質(zhì)產(chǎn)生損害，導(dǎo)致肺水腫的發(fā)生[18]。一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究表明，抗氧化物質(zhì)可以通過(guò)抑制PI3K-Akt通路及其相應(yīng)的節(jié)點(diǎn)物質(zhì)，從而抑制氣道炎癥的發(fā)生[19]。COPD患者應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療時(shí)效果時(shí)常不理想，遠(yuǎn)不如哮喘及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等療效明顯，故存在一定的糖皮質(zhì)激素抵抗存在，而糖皮質(zhì)激素抵抗與HDAC2活性減弱有關(guān)，而HDAC2活性減弱又一定程度上受到PI3K-Akt信號(hào)上調(diào)的影響[20-22]。故目前PI3K抑制劑藥物研究已成為熱點(diǎn)，可通過(guò)抑制PI3K-Akt通路從而減輕氣道炎癥程度及糖皮質(zhì)激素抵抗水平，這也成為中藥復(fù)方治療COPD的靶向研究的一條重要路徑。

從靶點(diǎn)與信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖中得知，RAF1、RELA、MAPK8、IKBKB、PRKCA、NFKBIA、GSK3B、EGFR、CCND1、FOS、BCL2、IL6等作為七味都?xì)馔柚委烠OPD的核心靶點(diǎn)，在相應(yīng)的信號(hào)通路上發(fā)揮著重要的作用。RAF1、RELA、IKBKB、GSK3B、EGFR、CCND1均位于PI3K-Akt 信號(hào)通路(hsa04151)上發(fā)揮作用。

綜上所述，七味都?xì)馔枳鳛橹委煷》文I氣虛證的經(jīng)典方劑，臨床上用于治療COPD效果顯著，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法并檢索復(fù)方與疾病的相關(guān)靶點(diǎn)，得出共有靶點(diǎn)89個(gè)，再通過(guò)中藥-化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、PPI蛋白互作、GO富集及KEGG通路分析可以預(yù)測(cè)出：七味都?xì)馔柰ㄟ^(guò)其中的有效活性成分槲皮素、豆甾醇、山柰酚、β-谷固醇、谷甾醇等，并通過(guò)RAF1、RELA、MAPK8、IKBKB、PRKCA、IL6等靶點(diǎn)，調(diào)控PI3K-Akt、TNF等相關(guān)信號(hào)通路及細(xì)胞凋亡等生理過(guò)程，從而減輕氣道炎癥、調(diào)節(jié)免疫功能、降低對(duì)肺實(shí)質(zhì)的損害，來(lái)達(dá)到治療COPD的目的。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。