金銀花及其復(fù)方制劑對鋁致阿爾茨海默癥小鼠的干預(yù)作用研究

農(nóng) 嵩，吳韋鳳，仇南霜，黃雪映，李坤波，周國荃，張樹球

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院重金屬與氟砷毒物研究實驗室,廣西 百色 533000；2. 美國密歇根州立大學(xué)毒理學(xué)教研室，密歇根州 美國；3. 廣西云球生物科技公司研發(fā)部，廣西 百色 533000)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種起病隱匿、進行性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病，病程緩慢且不可逆[1]。該病患者以智能損害為主，病理改變主要為皮質(zhì)彌漫性萎縮、溝回增寬、腦室擴大、神經(jīng)元大量減少，并可見老年斑(SP)、神經(jīng)原纖維結(jié)(NFT)等病變，與記憶、認知能力有關(guān)的膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)中膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶、乙酰膽堿、乙酰膽堿酯酶(AchE)含量顯著減少[2]。目前研究證實鋁與AD的發(fā)生密切相關(guān)，鋁作為一種蓄積性強神經(jīng)毒物，可通過多種途徑導(dǎo)致人或動物認知功能障礙，臨床中尚無有效的治療手段。中醫(yī)中藥由于不良反應(yīng)少且成本低廉在治療AD方面日益受到重視。本研究觀察了金銀花單藥及其復(fù)方制劑對鋁致AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的影響，并探討了可能干預(yù)作用機制，以期尋求一種安全有效的治療AD藥物。

1 實驗材料與方法

1.1動物 健康標準清潔級小白鼠60只，雌雄各半，鼠齡2～3個月，體重20～22 g，由廣西右江民族醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號:SCXK桂2017-0003，動物使用許可證號:SYXK桂2017-0004。

1.2主要試劑與儀器 氯化鋁(AlCl3)、D-半乳糖為國產(chǎn)分析純。AchE、總蛋白(TP)、丙二醛(MDA)、尿素氮(BUN)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所和四川省邁克科技有限責(zé)任公司。Y型迷宮刺激器、分光光度計、精密pH計、離心機、甘汞電極和氟電極均為國產(chǎn)儀器。

1.3實驗藥物 金銀花干品購自中藥店(市售),自行制備口服液:稱取中藥放鍋內(nèi),按中藥質(zhì)量∶水=1∶20加入自來水，煮沸40 min后過濾，繼續(xù)加熱濃縮1 h，冷卻，按濃縮藥液∶95%乙醇=1∶3加入95%乙醇，使沉淀過夜后過濾，棄沉淀，回收乙醇，藥液定容后裝瓶，105 ℃高壓消毒30 min，冷卻后放冰箱保存待用。復(fù)方抗癡呆口服液(商品名:植物飲液，專利號: ZL201210339742.8)由右江民族醫(yī)學(xué)院海爾福研制中心提供,由金銀花、茯苓、甘草、薏苡仁等組成。

1.4實驗方法 將小鼠分成正常組、模型組、金銀花組和復(fù)方抗癡呆組，每組15只。模型組、金銀花組和復(fù)方抗癡呆組進行染鋁造模：將5 mg/(kg·d)AlCl3和60 mg/(kg·d)D-半乳糖混合后腹腔注射，正常組按體重給予等體積蒸餾水腹腔注射，均1次/d，連續(xù)90 d。造模第71天開始，金銀花組和復(fù)方抗癡呆組分別給予金銀花原液、復(fù)方抗癡呆口服液原液各0.15 mL加蒸餾水稀釋至0.3 mL灌胃，正常組和模型組給予蒸餾水0.3 mL灌胃，均1次/d，連續(xù)20 d。

1.5觀察指標及方法

1.5.1學(xué)習(xí)記憶能力 干預(yù)結(jié)束后，參照文獻[3-5]方法，采用 Y 型迷宮刺激器檢測各組小白鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，記錄各組小白鼠達到學(xué)會標準時所需的測試次數(shù)和20次測試中的記憶錯誤次數(shù)。

1.5.2血清生化指標水平 學(xué)習(xí)記憶能力測試實驗結(jié)束后，從眼球后取全血，分離血清，測定TG、TC、BUN、ALT和TP水平。

1.5.3腦組織中AD相關(guān)指標含量 處死各組小白鼠，取部分大腦組織，用生理鹽水制成10%腦組織勻漿，3 000 r/nim離心10 min，取上清備用。按試劑盒說明書檢測腦組織中AchE活力、MDA含量，參考文獻[6]、采用分光光度計檢測超氧陰離子自由基清除率，參考文獻[7]，采用電極法測定鋁(Al3+)含量。

1.5.4腦組織病理觀察 取各組小白鼠部分大腦組織， 制備病理切片，采用蘇木素-伊紅(HE)染色后，在400倍鏡下觀察各組腦組織結(jié)構(gòu)。

2 結(jié) 果

2.1各組小白鼠存活情況 實驗結(jié)束后，正常組13只、模型組11只、金銀花組10只、復(fù)方抗癡呆組11只小白鼠存活。

2.2各組小白鼠Y型迷宮刺激學(xué)習(xí)記憶能力比較模型組小白鼠測試次數(shù)和記憶錯誤次數(shù)均明顯多于正常組(P均<0.05)；金銀花組記憶錯誤次數(shù)和復(fù)方抗癡呆組測試次數(shù)、記憶錯誤次數(shù)均明顯少于模型組(P均<0.05),且復(fù)方抗癡呆組測試次數(shù)、記憶錯誤次數(shù)均明顯少于金銀花組(P均<0.05)。見表1。

表1 正常組和阿爾茨海默病各組小白鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較次)

2.3各組小白鼠血清生化指標比較 4組間血清TG、TC、BUN、TP水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；模型組血清ALT水平明顯高于正常組(P<0.05)，復(fù)方抗癡呆組明顯低于模型組和金銀花組(P均<0.05)，金銀花組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 正常組和阿爾茨海默病各組小白鼠血清各生化指標比較

2.4各組小白鼠腦組織中AchE活力、超氧陰離子自由基清除率、Al3+和MDA含量比較 與正常組比較，模型組小白鼠腦組織中AchE活力、超氧陰離子自由基清除率均明顯降低(P均<0.05)， Al3+含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，金銀花組和復(fù)方抗癡呆組小白鼠腦組織中AchE活力、超氧陰離子自由基清除率均明顯升高(P均<0.05)，Al3+含量明顯降低(P<0.05)；復(fù)方抗癡呆組小白鼠腦組織中AchE活力明顯高于金銀花組(P<0.05)，超氧陰離子自由基清除率和Al3+含量明顯低于金銀花組(P均<0.05)。見表3。

表3 正常組和阿爾茨海默病各組小白鼠腦組織中AchE活力、超氧陰離子自由基清除率、Al3+和MDA含量比較

2.5各組小白鼠大腦皮質(zhì)病理切片HE染色情況正常組：神經(jīng)細胞、組織結(jié)構(gòu)及層次未見異常；模型組：少數(shù)神經(jīng)細胞胞體腫脹、胞質(zhì)空亮、Nissl體消失、胞核縮小偏位深染，呈急性神經(jīng)細胞潰變改變，少數(shù)神經(jīng)細胞胞核、胞體收縮，核仁不明顯，核與胞質(zhì)融合固縮，呈慢性進行性神經(jīng)細胞壞死改變；金銀花組:病變程度比模型組輕；復(fù)方抗癡呆組:病變程度比金銀花組輕。見圖1。

圖1 各組小白鼠大腦皮質(zhì)病理切片HE染色表現(xiàn)(×400)

3 討 論

鋁元素具有顯著的神經(jīng)毒性,鋁離子可以和超氧陰離子結(jié)合形成一種鋁過氧化物,能容易地穿過血腦屏障,從而大大增強了其神經(jīng)毒性[8]。D-半乳糖是機體正常營養(yǎng)成分，但其過多時在代謝過程中會產(chǎn)生O2-和H2O2，過量的活性氧或自由基可引起神經(jīng)細胞氧化應(yīng)激損傷，造成機體學(xué)習(xí)記憶能力下降，由此引起和促進AD的發(fā)生發(fā)展[9]。聯(lián)合應(yīng)用AlCl3和D-半乳糖制備AD小鼠模型已得到國內(nèi)外的廣泛認可。本實驗結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小白鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和腦組織中AchE活力、清除率明顯降低，血清ALT水平和腦組織中Al3+含量明顯升高，大腦皮質(zhì)少數(shù)神經(jīng)細胞呈急性潰變、慢性進行性壞死改變，證實AD造模成功。

金銀花復(fù)方由金銀花、茯苓、甘草、薏苡仁等中藥組成。 金銀花中含有豐富的酚型抗氧化劑綠原酸，因其含有R-OH基，能消除超氧陰離子、羥自由基等自由基活性，可以保護細胞免受氧化損傷，具有預(yù)防腫瘤和抗衰老等作用[10]。既往實驗研究證實，綠原酸可以通過抑制AchE活力，改善強氧化劑誘導(dǎo)的大鼠腦組織氧化應(yīng)激損傷[11]；還可通過提高抗氧化能力來抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡、線粒體損傷和細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)狀態(tài)[12]。金銀花中還包括有機酸類、黃酮類、環(huán)烯醚萜苷類、三萜皂苷類、揮發(fā)油類以及其他各種成分，有抗炎解熱、抗菌抗病毒、降低血糖、保肝、保護神經(jīng)、增強機體免疫功能、抗血小板聚集等作用[13]。茯苓中的茯苓酸具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降血糖、鎮(zhèn)靜催眠等作用[14]。甘草中的甘草酸可改善腦細胞能量代謝，減輕腦水腫，促進腦功能恢復(fù)，提高個體的記憶力，有助于緩解老年癡呆癥[15]。薏苡仁有健脾利濕、清熱排膿、美容養(yǎng)顏之功能，薏苡仁提取物有抗腫瘤、抗衰老的作用[16]。早期研究結(jié)果顯示，金銀花復(fù)方可顯著提高鋁中毒小鼠N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA) 受體的2型受體亞單位(NR2B) 的表達；NMDA受體與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系主要體現(xiàn)在長時程增強效應(yīng)(LTP)方面,LTP被認為是學(xué)習(xí)記憶的基礎(chǔ)，在LTP誘導(dǎo)期，NMDA受體激活后,細胞內(nèi)的Ca2+迅速升高,誘發(fā)LTP產(chǎn)生,而LTP形成后又可以促進NR2B受體的表達，進而明顯改善鋁中毒小鼠中樞神經(jīng)遞質(zhì)的功能，但其保護NR2B受體基因表達的確切調(diào)節(jié)位點不明確[17]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，金銀花復(fù)方可促進鋁的排泄和降低AchE活力，對鋁中毒所致心肌損傷有保護作用[18-21]；還可通過阻止鋁暴露大鼠海馬組織內(nèi)總超氧化物歧化酶(T-SOD)含量降低及Aβ1-42和糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)含量升高，避免tau蛋白過度磷酸化及總tau蛋白含量異常增加，起到干預(yù)鋁暴露致AD的作用[22]。

本實驗利用金銀花及其復(fù)方制劑對鋁致AD小鼠進行干預(yù)，結(jié)果復(fù)方抗癡呆組測試次數(shù)、記憶錯誤次數(shù)均明顯少于金銀花組，血清ALT水平及腦組織中超氧陰離子自由基清除率、Al3+含量明顯低于金銀花組，腦組織中AchE活力明顯高于金銀花組，大腦皮質(zhì)病變程度比金銀花組輕，這可能與復(fù)方制劑多種有效成分協(xié)同作用有關(guān)。金銀花組超氧陰離子自由基清除率更高，是金銀花單方制劑具有更好的抗氧化能力還是其他因素影響，有待進一步研究。各組血清TG、TC、BUN水平及腦組織中MDA含量比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與干預(yù)時間有關(guān)。本實驗證實了金銀花復(fù)方制劑的作用優(yōu)于單方制劑，但鋁致AD的可能分子機制和金銀花中藥制劑的干預(yù)位點仍需進行深入研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。