二氧化硅納米顆粒表面原位還原銀納米簇電化學發(fā)光傳感界面的構建與分子識別

王博東，潘美辰，卓 穎

（發(fā)光分析與分子傳感教育部重點實驗室(西南大學),西南大學化學化工學院,重慶400715）

電化學發(fā)光（Electrochemiluminescence，ECL）是電化學反應引發(fā)的化學發(fā)光現(xiàn)象［1］.ECL技術無需外部光源，避免了散射光引起背景信號的干擾，提高了分析的靈敏度.其次，通過調(diào)控電壓或電流的大小可以實現(xiàn)對反應進程的精確控制，使ECL展現(xiàn)出良好的可控性及重現(xiàn)性.此外，經(jīng)歷多個循環(huán)周期后，ECL發(fā)光信號仍能保持穩(wěn)定，保證了分析方法的準確度.將ECL技術與生物傳感技術相結合的ECL生物傳感器具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、線性范圍寬和背景信號低等優(yōu)點［2］，為環(huán)境、臨床及食品等領域提供了快速、高效的檢測手段.

L-半胱氨酸（L-Cystein，L-Cys）是人體內(nèi)唯一的還原型氨基酸，在生化過程中能夠阻止活性氧對重要細胞成分破壞從而使生命體內(nèi)氧化還原過程處于平衡態(tài)［3］.人體內(nèi)L-Cys含量過高會引起神經(jīng)中毒、癌癥等疾病，然而，含量過低與腦損傷、頭發(fā)脫色、虛弱無力等不良癥狀的發(fā)生有緊密聯(lián)系［4］，及時、準確地監(jiān)測人體細胞中L-Cys的含量對預防及治療上述疾病有重要意義.

隨著納米科技的不斷進步，發(fā)展新型、高效、簡便易得的電化學納米發(fā)光體是ECL研究領域的重要方向.銀納米簇（Silver nanoclusters，Ag NCs）是由幾到幾十個貴金屬原子堆積而成，化學性質(zhì)較活潑，容易氧化而發(fā)生聚集，導致其光穩(wěn)定性較差［5］.將Ag NCs與石墨烯（GR）［6］、二氧化鈦（TiO2）［7］及二氧化硅（SiO2）［8］等納米材料復合，可為優(yōu)化其光學性能提供一種思路.二氧化硅納米顆粒（SiO2NPs）具有均一的尺寸、較大的比表面積，且化學穩(wěn)定性高，是負載小尺寸納米材料的優(yōu)良基質(zhì)［9］.Le Guevel等［10］通過在金納米簇（Au NCs）表面包覆具有保護作用的二氧化硅，有效提高了Au NCs的光穩(wěn)定性及化學穩(wěn)定性，但受表面硅層的影響，其發(fā)光強度有所下降，不利于痕量分析.本文借助原位化學還原的方式以牛血清蛋白（BSA）同時作為模板和還原劑使得Ag NCs穩(wěn)定負載于SiO2NPs表面.一方面，空間限域的Ag NCs難于發(fā)生團聚，顯著增強其光學穩(wěn)定性.同時，Ag NCs處于SiO2NPs表面，SiO2NPs對ECL電子轉(zhuǎn)移過程并無阻礙，ECL強度得到顯著提高.因此，Ag NCs-SiO2NPs復合納米材料在共反應試劑過硫酸根溶液中產(chǎn)生顯著增強且穩(wěn)定的陰極ECL信號.當溶液中含有L-Cys時，L-Cys的巰基與Ag NCs發(fā)生共價結合［11］，ECL信號發(fā)生猝滅.基于上述原理，構建了“開-關”型ECL生物傳感器用于L-Cys的定量檢測，為分子識別提供了新方法.

1 實驗部分

1.1 試 劑

過硫酸鉀（K2S2O8）、牛血清蛋白（BSA，純度96%~99%）、正硅酸乙酯（TEOS）、氨水（NH3·H2O，質(zhì)量分數(shù)25%~28%）、乙醇（C2H5OH）和殼聚糖（CS）均為分析純，購自美國Sigma公司；L-半胱氨酸（L-Cys）和尿素（Urea）均為分析純，購自上海Aladdin公司；氫氧化鈉（NaOH）和葡萄糖（Glucose）均為分析純，購自成都科隆化學試劑有限公司.實驗用水均為二次去離子水.

1.2 生物傳感器的制備

1.2.1 Ag NCs-SiO2NPs納米復合材料的制備 首先，通過St?ber方法［12］合成SiO2NPs.在磁力攪拌下向20 mL無水乙醇中緩慢滴加3 mL NH3·H2O.1 min后，快速向其中加入600μL TEOS.在25℃下磁力攪拌12 h后，離心并用去離子水和無水乙醇洗滌3次.在37℃烘箱中干燥12 h，備用.

1.2.2 Ag NCs-SiO2NPs的制備 取24.0 mg SiO2NPs分散于2 mL去離子水中并超聲混合均勻.在磁力攪拌下，加入1 mL 3%BSA溶液（pH=7.4），反應5 min后，離心并用去離子水洗滌3次.然后將上述產(chǎn)物分散于2 mL去離子水中，并向其中加入1 mL 10 mmol/L AgNO3溶液，磁力攪拌2 min后，加入0.2 mL 1 mol/L NaOH溶液，溶液由乳白色變?yōu)樽攸S色.在37℃下攪拌12 h后，離心去除上層清液，用去離子水洗沉淀3次.最后超聲分散于2 mL去離子水中，在4℃冰箱保存，備用.制備過程見Scheme 1.

Scheme 1 Preparation process of Ag NCs?SiO2 NPs

1.2.3 修飾電極的制備 用α-氧化鋁粉末對玻碳電極（GCE，φ=4 mm）進行打磨拋光，并用無水乙醇和去離子水分別進行3次超聲清洗.用移液槍吸取5μL 1%CS滴涂于GCE表面，于37℃下晾干備用.取5μL超聲后分散均勻的Ag NCs-SiO2NPs滴加至上述修飾了CS的GCE表面，于37℃下晾干成膜.

1.3 表征與檢測方法

實驗所用三電極體系由工作電極玻碳電極、參比電極Ag/AgCl（飽和KCl溶液）電極以及輔助電極鉑絲電極共同組成.CHI660C型電化學工作站（上海辰華儀器公司）用于ECL檢測.MPI-A型毛細管電泳電化學發(fā)光檢測儀（西安瑞邁分析儀器有限公司）用于循環(huán)伏安（CV）檢測.S4800掃描電子顯微鏡（SEM）和JEM 1200EX投射電子顯微鏡（TEM，日本日立公司）用于觀測材料的形貌和結構.采用UV-2450型紫外Vertex電化學工作站（荷蘭Ivium公司）、Kymera 193i型光譜儀與牛頓EMCCD光譜檢測器（英國Andor Co.公司）自主搭建的ECL光譜系統(tǒng)表征材料的ECL光學特性.FL-5700型熒光分光光度計（日本日立公司）用于表征材料的熒光特性.UV-3600型紫外-可見分光光度計（UV-Vis-NIR，日本日立公司）用于表征材料的紫外-可見吸收特性.

2 結果與討論

2.1 Ag NCs-SiO2 NPs的形貌表征

采用SEM對所制備的SiO2NPs的表面形貌進行表征.如圖1（A）所示，所制SiO2NPs為球形，粒徑均一，直徑大約為180 nm.通過TEM對所合成的Ag NCs-SiO2NPs的表面形貌及結構進行分析，發(fā)現(xiàn)SiO2NPs的邊緣形成大量顆粒［圖1（B）］.同時，通過高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）表征該材料，顯示出分辨良好的晶格條紋［圖1（C）］，0.15 nm的晶間距離對應于面心立方（fcc）銀的（220）面［13］，推測Ag NCs已成功制備.為了進一步表征該復合材料的元素組成，通過掃描透射電子顯微鏡-高角環(huán)形暗場（STEM-HAADF）和掃描透射電子顯微鏡-能量色散X射線（STEM-EDX）觀察Ag與Si兩種元素在該復合材料中的組成及分布情況［圖1（D）］，明顯可見Ag元素存在于SiO2NPs的邊緣.綜上，可以證明SiO2NPs表面已原位生成了Ag NCs.

Fig.1 SEM images of SiO2 NPs(A),magnified TEM images of Ag NCs?SiO2 NPs(B),HRTEM image of Ag NCs?SiO2 NPs(C),STEM?HAADF image of SiO2 NPs?Ag NCs and STEM?EDX element mappings(inset)of Ag and Si,respectively(D)

2.2 Ag NCs-SiO2 NPs的光學性質(zhì)

為了研究所制備Ag NCs-SiO2NPs的光學性質(zhì)，測試了其紫外-可見（UV-Vis）吸收光譜、熒光（FL）光譜及ECL光譜.首先，為了探究Ag NCs-SiO2NPs逐步合成的過程，采用UV-Vis吸收光譜儀對BSA，SiO2NPs及Ag NCs-SiO2NPs進行分析.由圖2（A）可見，SiO2NPs的UV-Vis光譜中沒有明顯的特征吸收峰［圖2（A）譜線a］，BSA的特征吸收峰出現(xiàn)在278 nm［圖2（A）譜線b］.值得注意的是，Ag NCs-SiO2NPs的特征吸收峰位于266 nm左右［圖2（A）譜線c］，推測該吸收峰來源于BSA的芳香族殘基及二硫鍵［14］，12 nm藍移可能源于Ag NCs的量子尺寸效應［15］.根據(jù)文獻［16］報道，銀納米顆粒（Ag NPs）的表面等離子體共振（SPR）峰處于400 nm附近，Ag NCs-SiO2NPs的UV-Vis光譜并未顯示該峰，這可能是由于SiO2NPs表面負載的Ag NCs尺寸較小.

2.3 Ag NCs-SiO2 NPs/S2O的ECL機理

2.4 實驗條件的優(yōu)化

探究了合成條件中AgNO3溶液濃度對體系ECL信號的影響.由圖4（A）可見，當AgNO3濃度低于5 mmol/L時，ECL信號隨AgNO3濃度的增加而升高.可以推測，隨著溶液中AgNO3含量的增加，SiO2NPs表面原位生成的Ag NCs逐漸增多，引起ECL信號升高.當AgNO3濃度達到5 mmol/L時，所檢測的ECL信號達到13600 a.u.，達到最高值.隨著AgNO3濃度繼續(xù)增加，ECL信號開始呈現(xiàn)下降的趨勢.這主要由于AgNO3濃度過大使得生成的Ag NCs尺寸增大，導致ECL信號降低.因此，5 mmol/L即為合成Ag NCs-SiO2NPs所用AgNO3的最佳濃度.

在其余實驗條件不變的情況下，研究了掃描速率對上述傳感器的影響［圖4（B）］.當掃描速率為0.3 V/s時，ECL信號達到相對較高的值，且穩(wěn)定性較高.故選擇0.3 V/s作為分析檢測的最佳掃描速率.

Fig.4 Effects of AgNO3 solution concentration(A)and scan rate(B)on ECL signal

Fig.5 ECL signals of the biosensor with different concentrations of L?Cys in 10 mmol/L S2Osolution(pH=7.4)(A),calibration plot for L?Cys detection(B),the stability of the biosensor(C)and the selectivity of the biosensor(D)

2.5 傳感器的檢測性能

為了測試上述傳感器的定量檢測范圍，將其置于含有不同濃度L-Cys的10 mmol/L S2O溶液中測試ECL響應.如圖5（A）所示，當L-Cys濃度在50 nmol/L~50μmol/L范圍內(nèi)，ECL信號隨著L-Cys濃度的增加而降低.ECL信號的變化值（ΔI為ECL信號與空白信號的差值）與L-Cys濃度的對數(shù)值呈線性關系，其線性回歸方程為ΔI=5140.3+2679.3lgcL-Cys，R2=0.9969［圖5（B）］.根據(jù)3σ規(guī)則［19］，計算出其最低檢測限（LOD）為13.7 nmol/L.

為了研究所構建生物傳感器的穩(wěn)定性，將其置于10 mmol/L S2O82?溶液中，連續(xù)電位掃描8次并記錄其ECL信號［圖5（C）］.所收集的ECL信號相對標準偏差（RSD）為2.3%，表明該傳感器具有良好的穩(wěn)定性.

生物傳感器選擇性是評估其實際應用價值的重要指標之一，為了探究所制備傳感器的選擇性，有必要選擇不同的干擾物進行對比.分別測試了含有500μmol/L尿素（Urea）、葡萄糖（Glucose）、抗壞血酸（AA）的溶液及空白溶液［圖5（D）］.與空白溶液對比，向體系中加入濃度為50μmol/LL-Cys后，由于L-Cys與Ag NCs-SiO2NPs的結合破壞了Ag NCs的表面結構，使得所檢測的ECL明顯信號下降.而將上述干擾物質(zhì)以高于L-Cys濃度的10倍加入時，干擾物質(zhì)對檢測的ECL信號幾乎沒有影響，說明該傳感器對L-Cys具有良好的選擇性.

最后，將該ECL測試方法與其它檢測L-Cys的方法進行比較.由表1［4，20~25］可見，本文所構建的傳感器具有較寬的線性范圍和較低的檢測限（LOD），說明其適用于L-Cys的高靈敏檢測.

Table 1 Comparison of different methods for the detection of L-Cys

3 結 論

采用原位化學還原法制備了Ag NCs-SiO2NPs復合納米材料作為新型電化學發(fā)光體，在溶液中發(fā)射穩(wěn)定的陰極ECL信號.SiO2NPs具有大的比表面積和高的化學穩(wěn)定性，為原位生成Ag NCs提供了合適固載基質(zhì)使其光穩(wěn)定性得以提高.基于L-Cys對ECL信號的猝滅作用，構建“開-關”型ECL生物傳感器用于L-Cys的高靈敏檢測.結果表明，該生物傳感器檢測L-Cys的濃度線性范圍為50 nmol/L~50 μmol/L，具有較低的檢測限，能夠特異性識別L-Cys.本文所研究的傳感器具有高的靈敏度和好的重現(xiàn)性，組裝過程簡單，有望在生物分析方面得到應用.