水溶性香豆素?zé)晒獾孜锏闹苽浼霸谝旱螖?shù)字式檢測(cè)中的應(yīng)用

匡小軍，伊京偉，方曉霞，賴東梅，徐 宏

（1.上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院,Med-X研究院,2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院,中國(guó)福利會(huì)國(guó)際和平婦幼保健院,上海200030）

隨著人們對(duì)生命科學(xué)研究的日益深入，生物標(biāo)志物的檢測(cè)受到了越來(lái)越多的重視.由于受分析靈敏度的限制，目前傳統(tǒng)的檢測(cè)方法僅能檢測(cè)到十分之一的人類已知蛋白［1］，致使大量與疾病相關(guān)的低豐度生物標(biāo)志物無(wú)法得到臨床應(yīng)用，因此開(kāi)發(fā)高靈敏的檢測(cè)方法至關(guān)重要.相較而言，液滴數(shù)字式檢測(cè)方法（如數(shù)字式酶聯(lián)免疫檢測(cè)，ddELISA）的檢測(cè)靈敏度極高、隔離分區(qū)不受限，是較有可能應(yīng)用于臨床的低豐度生物標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)［2，3］.該技術(shù)采用結(jié)合有特異抗體的磁性微球捕獲待測(cè)蛋白，通過(guò)稀釋樣本，使待測(cè)蛋白數(shù)量小于磁性微球數(shù)量.根據(jù)泊松分布，每個(gè)磁性微球表面至多捕獲一個(gè)待測(cè)蛋白，并形成單磁球-單靶標(biāo)蛋白的復(fù)合物；將形成的磁球-蛋白復(fù)合物或空白磁球逐一分隔到液滴分區(qū)微反應(yīng)器中，此時(shí)每個(gè)分區(qū)根據(jù)內(nèi)含物不同，分為僅有一個(gè)微球-待測(cè)蛋白復(fù)合物的“陽(yáng)性”分區(qū)、僅有一個(gè)微球（不含待測(cè)蛋白）的“陰性”分區(qū)和僅有酶反應(yīng)底物溶液的“背景”分區(qū)［4］.通過(guò)結(jié)合在待測(cè)蛋白上的酶催化分區(qū)中的底物分子產(chǎn)生熒光信號(hào)，使“陽(yáng)性”分區(qū)的信號(hào)強(qiáng)度區(qū)別于“陰性”分區(qū)，進(jìn)而統(tǒng)計(jì)“陽(yáng)性”分區(qū)和“陰性”分區(qū)的數(shù)量，結(jié)合泊松分布計(jì)算即可得到微球捕獲的待測(cè)蛋白的絕對(duì)數(shù)目，從而實(shí)現(xiàn)待測(cè)蛋白的數(shù)字式定量檢測(cè).與傳統(tǒng)的ELISA法和其它常用常見(jiàn)的檢測(cè)方法［5，6］相比，此方法的靈敏度提高了上千倍，可檢測(cè)低至amol/L水平的待測(cè)物［4］，在生物檢測(cè)中具有廣泛的應(yīng)用前景.

ddELISA需要通過(guò)酶催化底物分子來(lái)使含有目標(biāo)蛋白的陽(yáng)性分區(qū)熒光信號(hào)區(qū)別于無(wú)目標(biāo)蛋白的陰性分區(qū)，但大部分常用的熒光底物分子，如常見(jiàn)的熒光素、試鹵靈和香豆素等［7，8］的水溶性較差，而ddELISA檢測(cè)中各個(gè)水相分區(qū)均需要通過(guò)油相進(jìn)行分隔，酶催化后的熒光分子易從水相的液滴滲透擴(kuò)散至進(jìn)入周圍的油相，進(jìn)而擴(kuò)散到鄰近的液滴分區(qū)中，致使陽(yáng)性液滴的熒光信號(hào)擴(kuò)散到陰性液滴，陰性和陽(yáng)性信號(hào)無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分而嚴(yán)重干擾檢測(cè)結(jié)果［8~10］.目前最常見(jiàn)的底物分子為4-甲基傘形酮磷酸酯（4-MUP），因其催化產(chǎn)物4-甲基傘形酮（4-MU）具有出色的熒光性能而廣泛應(yīng)用于ddELISA中，然而目前研究表明其存在熒光分子擴(kuò)散的局限，導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)間窗口短、檢測(cè)線性范圍小，限制了其在基于液滴的酶促檢測(cè)體系中的應(yīng)用［8，11，12］.

目前降低熒光泄露的方法主要有微加工陣列物理隔離液滴，或加入BSA和糖等抑制擴(kuò)散的分子，以及對(duì)底物分子進(jìn)行改性等方法.微陣列方法設(shè)計(jì)液滴儲(chǔ)液腔以隔離單個(gè)液滴，減少了陽(yáng)性液滴與陰性液滴間的串?dāng)_，但這種方法加工過(guò)程繁瑣，且在固定的芯片面積下隔離液滴數(shù)量有限，不利于大規(guī)模應(yīng)用［11］.加入BSA和糖［13，14］等雖然也可以降低擴(kuò)散，但由于反應(yīng)體系的改變，可能會(huì)影響反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和分區(qū)的穩(wěn)定性，且不能完全杜絕擴(kuò)散的影響.對(duì)底物改性、增加熒光產(chǎn)物的水溶性是簡(jiǎn)單易行、可大規(guī)模應(yīng)用的方法［9，13］.研究表明，熒光分子的擴(kuò)散速率除了與液滴間的熒光分子濃度梯度有關(guān)外，還與熒光分子辛醇-水分配系數(shù)（Partition coefficient，lgD）相關(guān)，在相同的液滴體系下，lgD越小說(shuō)明熒光分子的水溶性越高，擴(kuò)散速率越?。?］.因此，可以根據(jù)染料分子的辛醇-水分配系數(shù)預(yù)測(cè)其在液滴中的擴(kuò)散.如在香豆素的環(huán)上修飾親水性分子以降低其辛醇-水分配系數(shù).Woronoff等［9］將磺酸基團(tuán)和羧酸基團(tuán)修飾在香豆素環(huán)上，得到的香豆素類熒光分子的lgD均較低，在液滴中可以穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)天；而未經(jīng)修飾的香豆素在2.1 s時(shí)即擴(kuò)散了50%.Najah等［15］同樣將磺酸基團(tuán)引入香豆素環(huán)中，發(fā)現(xiàn)底物可以在液滴內(nèi)孵育長(zhǎng)達(dá)24 h而不影響檢測(cè).但是上述工作合成香豆素的方法均采用磺酸等親水性較強(qiáng)的基團(tuán)，需要多步反應(yīng)，過(guò)程較為復(fù)雜，不易于推廣.因此，基于已有的香豆素衍生物制備新的具有抑制擴(kuò)散能力的香豆素底物，可以簡(jiǎn)化合成路徑，方法更易推廣，具有良好的應(yīng)用前景.

本文通過(guò)模擬計(jì)算發(fā)現(xiàn)，將4-甲基傘形酮（4-MU）的4位甲基改成乙酸甲酯基團(tuán)（7-羥基香豆素-4-乙酸甲酯，C-2）后，無(wú)需再改為羧酸等親水性更強(qiáng)的基團(tuán)即可實(shí)現(xiàn)降低擴(kuò)散的效果，其熒光特性也未改變.在液滴中的擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)也證實(shí)C-2具有優(yōu)良的抑制擴(kuò)散的特性，可以穩(wěn)定地存放1 d以上而不影響對(duì)應(yīng)陰、陽(yáng)液滴的判讀；而4-MU在液滴中，5 min即發(fā)生明顯擴(kuò)散.以C-2為催化產(chǎn)物制備的堿性磷酸酶底物7-二羥基磷酸酯香豆素-4-乙酸甲酯（C-4）具有與以4-MU為催化產(chǎn)物的堿性磷酸酶底物4-MUP相似的酶催化性能.對(duì)本課題組前期構(gòu)建的球刷酶［11］的數(shù)字檢測(cè)也證明了C-4底物比4-MUP底物具有較好的抑制擴(kuò)散性能和更優(yōu)的檢測(cè)性能.Scheme 1給出球刷酶數(shù)字式檢測(cè)示意圖.

Scheme 1 Schematic of droplet based digital detection

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

7-羥基香豆素-4-乙酸（純度97%）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；O，O-二甲基磷酰氯（純度96%）、四甲基碘硅烷（TMSI，純度99.9%）、4-甲基傘形酮（4-MU，純度98%）、4-甲基傘形酮磷酸酯（4-MUP，純度98%）、堿性磷酸酶（AKP，來(lái)源于牛腸粘膜，BioUltra）和1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC，BioUltra）購(gòu)自德國(guó)Sigma-Aldrich公司；其余合成C-4所用試劑均為分析純，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，未經(jīng)任何后處理；三（羧甲基）氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液（Tris-HCl，100 mmol/L，pH=9.0，1 mmol/L MgCl2），2-（N-嗎啡啉）乙磺酸緩沖溶液［MEST，10 mmol/L，pH=5.0，含0.05%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）Tween-20］，磷酸鹽緩沖溶液［PBST，10 mmol/L，pH=7.4，含0.05%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）Tween-20］.

Dx-Drp8M型液滴生成儀，中國(guó)卡尤迪公司；IX83 Olympus型熒光顯微鏡，日本奧林巴斯公司；Photometrics Prime BSI型CCD相機(jī)，美國(guó)Photometrics公司；SpectraMax i3x型酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；AvanceⅢ600 MHz型核磁共振波譜儀（1H NMR，13C NMR），瑞士Bruker公司；Q-TOF Premier型高分辨質(zhì)譜儀（HRMS），美國(guó)Waters公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 堿性磷酸酶底物7-二羥基磷酸酯香豆素-4-乙酸甲酯（C-4）的合成 堿性磷酸酶底物C-4的合成步驟見(jiàn)Scheme 2.

Scheme 2 Syntheses of alkaline phosphatase substrate 7?(dihydroxyphosphoryloxyl)coumarin?4?acetic acid methyl ester(C?4)

參照文獻(xiàn)［16］方法合成化合物C-2上的酯基.1H NMR（600 MHz，DMSO，25℃），δ：10.60（s，1H），7.52（d，J=8.7 Hz，1H），6.80（dd，J=8.7，2.3 Hz，1H），6.73（d，J=2.3 Hz，1H），6.24（s，1H），3.95（s，2H），3.65（s，3H），與文獻(xiàn)［16］報(bào)道相符.

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將50 mg（0.214 mmol）化合物C-2溶解于10 mL干燥的二氯甲烷中，加入295.8 mg（2.14 mmol）碳酸鉀，在冰浴下攪拌均勻；逐滴加入0.046 mL（0.428 mmol）O，O?二甲基磷酰氯，室溫下反應(yīng)過(guò)夜.反應(yīng)結(jié)束后過(guò)濾，用蒸餾水洗滌濾液，收集有機(jī)相，有機(jī)相經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑后得到粗產(chǎn)物，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析分離純化［洗脫劑：V（二氯甲烷）∶V（乙酸乙酯）=10∶1］得到產(chǎn)物C-3，產(chǎn)率為58%.1H NMR（600 MHz，CDCl3，25℃），δ：7.59（d，J=8.9 Hz，1H），7.26~7.19（m，2H），6.38（s，1H），3.94（s，3H），3.91（s，3H），3.78（s，2H），3.77（s，3H）；13C NMR（125 MHz，CDCl3），δ：168.88，159.91，154.69，153.24，147.32，125.91，116.62，116.39，116.20，108.85，55.25，55.19，52.82，38.00；HR-MS（ESI-QTOF），（M+H）+（計(jì)算值），m/z：343.0583（343.0583）.

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將40 mg（0.12 mmol）化合物C-3溶解于8 mL干燥的二氯甲烷中，冰浴下逐滴加入72 mg（0.36 mmol）四甲基碘硅烷，室溫下攪拌反應(yīng)3 h，加入8 mL 3 mmol/L HCl淬滅反應(yīng)；再攪拌反應(yīng)12 h；用氯仿清洗反應(yīng)液，直到有機(jī)相和水相均呈無(wú)色為止，收集水相，經(jīng)冷凍干燥后得到產(chǎn)物C-4，產(chǎn)率為53%.1H NMR（600 MHz，D2O，25℃），δ：7.65（d，J=8.8 Hz，1H），7.24~7.16（m，2H），6.39（s，1H），3.98（s，2H），3.69（s，3H）.

1.2.2 球刷酶SP-AKP的制備 參照文獻(xiàn)［17］方法，在粒徑為116 nm的二氧化硅納米顆粒表面聚合丙烯酸鏈段，得到聚合物為300的球刷SP-300.參照文獻(xiàn)［11］方法制備SP-AKP.將80μL MEST（AKP濃度為2 mg/mL）加入至120μL含20 mg球刷SP-300的MEST中，于37℃旋轉(zhuǎn)反應(yīng)15 min；產(chǎn)物用MEST清洗2遍后，加入120μL 0.5 mmol/L EDC的MEST溶液，室溫下反應(yīng)2 h；所得產(chǎn)物用PBST緩沖液洗3遍，保存在200μL Tris-HCl緩沖液中.AKP的偶聯(lián)量檢測(cè)使用BCA方法，收集原液、反應(yīng)上清液和每一步的洗滌液上清液.采用每30 s測(cè)得的酶催化底物C-4產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度變化（λex=370 nm，λem=465 nm）計(jì)算AKP和SP-AKP的催化活性.

“紅船精神”是激勵(lì)我們大膽探索、創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)的強(qiáng)大思想武器。首創(chuàng)精神昭示我們，在社會(huì)發(fā)展的歷史進(jìn)程中，我們不能因循守舊、安于現(xiàn)狀，必須勇立潮頭、敢為人先，堅(jiān)持用時(shí)代發(fā)展要求審視自己，以改革精神創(chuàng)新發(fā)展理念，以創(chuàng)新的精神永葆黨的生機(jī)和活力。面對(duì)新挑戰(zhàn)、新機(jī)遇、新形勢(shì)和新任務(wù)，我們要堅(jiān)持和發(fā)揚(yáng)“紅船精神”，有敢于突破前人的勇氣和智慧，自覺(jué)克服安于現(xiàn)狀、不思進(jìn)取的思想觀念，堅(jiān)持用創(chuàng)新的理論成果武裝頭腦，用創(chuàng)新的思想觀念謀劃工作，緊緊扭住發(fā)展不放松，與時(shí)俱進(jìn)，勇于改革創(chuàng)新，不斷推進(jìn)建設(shè)中國(guó)特色社會(huì)主義的偉大事業(yè)。勇于改革創(chuàng)新，敢為人先，始終保持共產(chǎn)黨人的首創(chuàng)精神，奪取新征程上的更大勝利。

1.2.3 底物的酶催化性能檢測(cè) 將熒光產(chǎn)物4-MU和C-2溶解于100μL Tris-HCl緩沖液中，濃度為50μmol/L，采用酶標(biāo)儀測(cè)定其熒光光譜并繪制熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線.使用不同濃度的底物（0.01 nmol/L~2μmol/L），光柵確定為λex=9 nm，λem=15 nm，在最佳激發(fā)波長(zhǎng)處激發(fā)，在最佳發(fā)射波長(zhǎng)處檢測(cè)熒光強(qiáng)度用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（C-2：λex=370 nm，λem=465 nm；4-MU：λex=365 nm，λem=455 nm）.

先用Tris-HCl緩沖液配制系列濃度底物C-4和4-MUP（濃度為0.1μmol/L~200μmol/L），同時(shí)用Tris-HCl將AKP濃度稀釋至所需濃度，然后混合底物和酶，使總體積為100μL.在室溫下使用酶標(biāo)儀測(cè)試酶催化動(dòng)力學(xué)，光柵確定為λex=9 nm，λem=15 nm，每隔30 s測(cè)試一次，共測(cè)試30 min（C-4：λex=370 nm，λem=465 nm；4-MUP：λex=365 nm，λem=455 nm）.通過(guò)熒光產(chǎn)物的熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線得到催化過(guò)程中熒光產(chǎn)物的濃度，進(jìn)而通過(guò)米氏方程（Michaelis-Menten equation）擬合得到酶催化反應(yīng)常數(shù).

1.2.4 液滴生成和檢測(cè)方法 液滴生成裝置由液滴生成儀和對(duì)應(yīng)的液滴生成芯片組成，每個(gè)芯片一次性可以做8個(gè)通道，每個(gè)通道10 min可以生成約3×105個(gè)液滴，每個(gè)液滴直徑為50μm，體積為65 pL.檢測(cè)系統(tǒng)包括熒光顯微鏡和CCD相機(jī).

液滴生成芯片采用經(jīng)典的流體聚集液滴制備方法，使用的是“十字形”單水相芯片結(jié)構(gòu)，油相為配備的氟化油，水相需要先混合底物和球刷酶再加入水相通道中.首先，用Tris-HCl緩沖液稀釋系列濃度的SP-AKP溶液，再將5 mmol/L的底物與SP-AKP溶液按體積比1∶1混合后加入20μL至水相孔中，同時(shí)向油相孔中加入60μL氟化油.將芯片放入儀器約10 min即可制得所需的油包水液滴.然后，將液滴加入液滴儲(chǔ)存腔室內(nèi)，在室溫下孵育，液滴中SP-AKP催化底物生成熒光產(chǎn)物使得液滴產(chǎn)生熒光信號(hào).最后，利用倒置熒光顯微鏡在10倍物鏡下使用CCD相機(jī)拍攝熒光圖片（曝光時(shí)間固定為20 ms），同時(shí)拍攝液滴的明場(chǎng)圖片用于分析（曝光時(shí)間固定為10 ms）.液滴的熒光信號(hào)讀取及分析使用Image J軟件.

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光產(chǎn)物C?2的熒光性質(zhì)及底物C?4的酶催化性能

如圖1（A）所示，經(jīng)過(guò)在線ACD/I-Lab模擬計(jì)算（https：//ilab.acdlabs.com/iLab2/index.php）發(fā)現(xiàn)，在pH=9的環(huán)境中，C-2和4-MU的辛醇-水分配系數(shù)lgD分別為0.35和0.78，表明C-2具有更好的水溶性.

為避免改性對(duì)染料熒光性質(zhì)的影響，首先對(duì)C-2的熒光光譜、熒光強(qiáng)度與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行了檢測(cè)和對(duì)比.由圖1（A）可見(jiàn)，修飾后的C-2與4-MU相比，最佳激發(fā)峰和發(fā)射峰均略有右移，但與文獻(xiàn)［7］報(bào)道的4-MU的λex=372 nm和λem=445 nm相近.從2種熒光物質(zhì)的熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線圖［圖1（B）］也可看出，在相同條件下，修飾后的C-2熒光性能略優(yōu)于4-MU.以上結(jié)果表明，在香豆素4位上修飾的乙酸甲酯基團(tuán)并未對(duì)香豆素?zé)晒庑阅墚a(chǎn)生顯著影響.

進(jìn)一步探究了其對(duì)應(yīng)C-4底物的酶催化活性.通過(guò)分別配制不同濃度的底物溶液，加入相同量的堿性磷酸酶后，根據(jù)熒光產(chǎn)物的摩爾量計(jì)算反應(yīng)速率，進(jìn)而擬合得到酶催化的米氏方程：

式中：v0［mol/（L?s）］為反應(yīng)初始速率；Km（mol/L）為米氏常數(shù)；vmax［mol/（L?s）］為酶反應(yīng)最大速度；［S］（mol/L）為底物濃度.

Fig.1 Basic property characterization of 4?MU,C?2,4?MUP,C?4 and SP?AKP

通過(guò)方程擬合，可以得到米氏常數(shù)（Km）和最大催化速率vmax，酶催化的速率常數(shù)Kcat（s?1）按照下式計(jì)算：

式中：Etotal（mol/L）為加入酶的總濃度.

由圖1（C）可見(jiàn)，修飾后的C-4底物和4-MUP底物的米氏常數(shù)分別為8.88和11.33μmol/L，最大反應(yīng)速率分別為1.94和1.17 nmol/（L·s），由式（2）計(jì)算得到C-4底物和4-MUP底物酶催化反應(yīng)常數(shù)分別為936和1552 s?1.結(jié)果表明，與未修飾的4-MUP底物相比，修飾后的C-4仍具有較高的酶催化活性，具備應(yīng)用于ddELISA檢測(cè)的潛力.此外，兩底物的催化速率與文獻(xiàn)［7，18］報(bào)道的數(shù)據(jù)略有差異，可能是由于使用的酶不同導(dǎo)致的.

本文采用前文［11］方法制備SP-AKP，經(jīng)過(guò)BCA法測(cè)得球刷偶聯(lián)酶的濃度為608.7μg APK/mg球刷，每個(gè)SP-AKP納米顆粒含有大于1×10?4個(gè)AKP分子.圖1（D）結(jié)果顯示，SP-AKP固定酶的催化活性是自由酶AKP的0.26倍，即相當(dāng)于每個(gè)SP-AKP含有2600個(gè)AKP，具有較強(qiáng)的催化性能.上述結(jié)果均與文獻(xiàn)［11，19］結(jié)果吻合.

2.2 熒光產(chǎn)物C?2的防擴(kuò)散性能

為驗(yàn)證熒光分子C-2在液滴中的防擴(kuò)散性能，以含有2 mmol/L C-2或4-MU的液滴作為初始陽(yáng)性液滴，以不含有熒光產(chǎn)物的液滴作為陰性液滴，將初始陽(yáng)性液滴與陰性液滴以體積比1∶4混合后通入液滴儲(chǔ)存腔中，并在不同時(shí)間點(diǎn)統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性液滴和陰性液滴的熒光強(qiáng)度和比例.將初始陰性液滴熒光分布峰進(jìn)行高斯擬合，得到高斯擬合的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，取平均值加上10倍標(biāo)準(zhǔn)差得到的數(shù)值作為陽(yáng)性/陰性液滴的劃分閾值.由圖2（A），（C）和（E）可見(jiàn)，4-MU組的液滴在5 min時(shí)即出現(xiàn)4-MU從陽(yáng)性液滴擴(kuò)散進(jìn)入陰性液滴的現(xiàn)象，導(dǎo)致陽(yáng)性液滴熒光信號(hào)降低而陰性液滴熒光信號(hào)增強(qiáng)的現(xiàn)象，從而使部分陰性液滴被誤認(rèn)為陽(yáng)性液滴；在第10 min時(shí)，已有60%以上的陰性液滴由于擴(kuò)散導(dǎo)致的信號(hào)增強(qiáng)而被辨別為陽(yáng)性液滴；在60 min時(shí)，由于所有液滴均有熒光信號(hào)，陰陽(yáng)性液滴已無(wú)法區(qū)分.與4-MU組相比，C-2組在24 h時(shí)仍維持20%的初始陽(yáng)性液滴比例［圖2（B），（D）和（E）］.由圖2（D）可見(jiàn)，陰性液滴的熒光強(qiáng)度始終維持在2500以下，而陽(yáng)性液滴平均熒光強(qiáng)度維持在15000以上，陽(yáng)性/陰性液滴區(qū)分顯著，證明C-2在液滴中的防擴(kuò)散性能顯著優(yōu)于4-MU，可實(shí)現(xiàn)24 h以上的穩(wěn)定檢測(cè)及陰性液滴和陽(yáng)性液滴的準(zhǔn)確讀取.

Fig.2 Characterization of fluorescent product(C?2 and 4?MU)leakage in droplets

已有研究表明，在以氟化油為油相的液滴體系中，香豆素染料在液滴中的保留時(shí)間與辛醇-水分配系數(shù)（lgD）有關(guān)，lgD越小的熒光分子在液滴中的保留時(shí)間越長(zhǎng)，越不容易擴(kuò)散［8，9］.實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，4-MU和C-2的lgD分別為0.78和0.35，雖然2種熒光物質(zhì)均傾向于溶解在油相中，但是與4-MU相比，C-2的lgD更小，在液滴中的保留時(shí)間更長(zhǎng).小分子熒光染料C-2和4-MU在氟化油的溶解度較低［19］，且C-2長(zhǎng)時(shí)間放置也會(huì)引起背景的微弱增強(qiáng)［圖2（D），放置24 h后背景液滴的熒光強(qiáng)度有所增加］，可見(jiàn)C-2與4-MU在氟化油體系中的擴(kuò)散可能是染料在水油界面的擴(kuò)散所致［8］.但由于液滴體系的酶促數(shù)字式檢測(cè)所需時(shí)間相對(duì)較短，通常在十幾分鐘至1小時(shí)內(nèi)均可完成［7］，在此期間C-2幾乎無(wú)擴(kuò)散，因此C-2對(duì)應(yīng)的堿性磷酸酶底物C-4有望應(yīng)用于液滴體系的酶促數(shù)字式檢測(cè)中，從而改善現(xiàn)有4-MU熒光分子擴(kuò)散的情況.

2.3 液滴數(shù)字式檢測(cè)中的底物防擴(kuò)散性能

在驗(yàn)證了對(duì)應(yīng)熒光產(chǎn)物的防擴(kuò)散性能后，進(jìn)一步對(duì)2種底物在液滴數(shù)字式檢測(cè)體系中的防擴(kuò)散性能進(jìn)行了驗(yàn)證.在2.5 mmol/L底物終濃度下，測(cè)試了不同孵育時(shí)間下的液滴熒光強(qiáng)度分布，結(jié)果如圖3（A）和（B）所示.將SP-AKP分散液與5 mmol/L的底物按體積比1∶1混合后，加入液滴生成儀中生成液滴；在室溫下孵育不同時(shí)間后，將液滴放入液滴存儲(chǔ)腔中進(jìn)行觀察.在隨機(jī)分布中，當(dāng)目標(biāo)物SPAKP的濃度較低時(shí)，每個(gè)液滴中裝載的SP-AKP數(shù)量服從泊松分布.大部分液滴均沒(méi)有裝載SP-AKP（陰性液滴），只有少部分的液滴裝載1個(gè)或多個(gè)SP-AKP（陽(yáng)性液滴）.使用理論上每個(gè)液滴中裝載的平均SP-AKP的數(shù)量（λT）來(lái)計(jì)算SP-AKP的濃度，λT使用泊松分布公式計(jì)算［19］：

式中：fon為陽(yáng)性液滴占總液滴的比例.

由于4-MUP擴(kuò)散性較強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)選用較低的SP-AKP濃度（平均每個(gè)液滴可以分配0.04個(gè)SP-AKP，即理論λT=0.04），結(jié)果如圖3（A）所示.由于4-MUP酶促熒光產(chǎn)物4-MU的擴(kuò)散，使得陽(yáng)性液滴與陰性液滴熒光強(qiáng)度分布峰難以區(qū)分，故采用統(tǒng)一閾值的方法.以陽(yáng)性峰和陰性峰區(qū)分較為明顯的10 min為基準(zhǔn)，將陽(yáng)性峰和陰性峰相交處的熒光強(qiáng)度確定為區(qū)分陽(yáng)性和陰性液滴的閾值，以此閾值作為其余時(shí)間點(diǎn)的陽(yáng)性和陰性液滴的劃分界限.圖3（C）和（D）分別為孵育不同時(shí)間下的液滴熒光強(qiáng)度分布和實(shí)際計(jì)算得到的λT.可以看出，4-MUP在實(shí)際孵育過(guò)程中，陽(yáng)性液滴的熒光強(qiáng)度逐漸升高，實(shí)際計(jì)算的λT也逐漸升高，在孵育10 min時(shí)與理論λT最為接近.后續(xù)由于熒光產(chǎn)物4-MU的擴(kuò)散影響，孵育10 min后實(shí)際計(jì)算的λT超過(guò)了理論λT，說(shuō)明大量的陰性液滴由于熒光強(qiáng)度增加而被劃分為陽(yáng)性液滴.從圖3（A）中30 min的液滴熒光圖也可看出陽(yáng)性液滴出現(xiàn)明顯擴(kuò)散現(xiàn)象，導(dǎo)致其周圍的陰性液滴熒光強(qiáng)度顯著增加，難以與陽(yáng)性液滴區(qū)分，從而影響檢測(cè)結(jié)果.該結(jié)果與文獻(xiàn)［11］報(bào)道一致.

Fig.3 Characterization of 4?MUP and C?4 in droplets over time

由圖3（B）與3（E）可見(jiàn)，與4-MUP相比，C-4在10 min時(shí)即可較好區(qū)分陰性液滴與陽(yáng)性液滴，且隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，陽(yáng)性液滴的熒光強(qiáng)度逐漸增加，而陰性液滴熒光強(qiáng)度基本不變；孵育20 min時(shí)陽(yáng)性液滴信號(hào)峰已與陰性液滴完全分離；延長(zhǎng)孵育時(shí)間至60 min時(shí)，陽(yáng)性液滴和陰性液滴依然可明顯區(qū)分.由圖3（F）可見(jiàn)，從5 min到60 min，實(shí)際計(jì)算的λT與理論λT均較為吻合，即無(wú)陰性液滴被識(shí)別為假陽(yáng)性液滴的情況發(fā)生.

以上結(jié)果可證明，合成的C-4可在液滴體系中酶促產(chǎn)生不易擴(kuò)散的C-2熒光分子，且在不同的檢測(cè)時(shí)間均可得到準(zhǔn)確的λT值.與4-MUP相比，C-4體系對(duì)檢測(cè)時(shí)間的選取可操作性較大，更有利于ddELISA檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)信號(hào)的準(zhǔn)確判讀.

2.4 模擬液滴數(shù)字式檢測(cè)中的性能對(duì)比

為了探究底物C-4在ddELISA檢測(cè)中的檢測(cè)性能，以4-MUP底物作為參照，使用球刷酶SP-AKP模擬待測(cè)物進(jìn)行數(shù)字式檢測(cè).根據(jù)2.3節(jié)所得結(jié)果分別選擇10和20 min作為4-MUP和C-4的孵育時(shí)間.圖4（A），（C）和（D）示出了4-MUP在模擬數(shù)字式檢測(cè)中的結(jié)果.由于4-MUP的酶催化熒光產(chǎn)物4-MU擴(kuò)散性較強(qiáng)，較難區(qū)分陽(yáng)性峰和陰性峰.故實(shí)驗(yàn)中以最低λT（0.0007）時(shí)的結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)此條件下的陰性液滴峰進(jìn)行高斯擬合，采用陰性液滴峰的平均值加上10倍標(biāo)準(zhǔn)差作為區(qū)分陰陽(yáng)性峰的閾值，所有濃度均使用該閾值.由圖4（A）和（C）可見(jiàn)，隨著SP-AKP濃度的增加，即理論λT的增加，實(shí)驗(yàn)所得實(shí)際λT也隨之增加.然而由于熒光產(chǎn)物4-MU的擴(kuò)散，即使在較低λT（0.0007）時(shí)，依然存在熒光物質(zhì)擴(kuò)散的現(xiàn)象［見(jiàn)圖4（A）］，陽(yáng)性液滴和陰性液滴判讀困難，導(dǎo)致每個(gè)濃度的變異系數(shù)（CV）均高于20%.在理論λT低于0.069時(shí)，檢測(cè)得到的實(shí)際λT低于理論λT，說(shuō)明部分陽(yáng)性液滴由于熒光擴(kuò)散的影響被劃為陰性液滴.但是在高濃度時(shí)由于陽(yáng)性液滴數(shù)量較多，大量熒光產(chǎn)物4-MU擴(kuò)散進(jìn)入陰性液滴，部分陰性液滴因熒光強(qiáng)度升高而被劃為陽(yáng)性液滴，導(dǎo)致最終計(jì)算得到的實(shí)際λT遠(yuǎn)大于理論λT.從結(jié)果來(lái)看，4-MUP的檢測(cè)時(shí)間較難控制，且在不同SP-AKP濃度下均會(huì)受到擴(kuò)散的影響，陰性、陽(yáng)性峰區(qū)分不明顯，判讀誤差大，難以應(yīng)用于基于液滴的酶促數(shù)字式檢測(cè)中.

底物C-4則展示了優(yōu)異的數(shù)字式檢測(cè)性能.由圖4（B）可見(jiàn)，隨著SP-AKP濃度的增加，均能明顯區(qū)分陽(yáng)性峰和陰性峰.由圖4（E）可以看出，實(shí)際得到的λT與理論λT符合，一致性高，除背景CV略大于20%，其余濃度下的檢測(cè)CV均低于10%.即使在高濃度λT=0.55的檢測(cè)中，CV僅為6%，依然保持了較低的變異系數(shù).以背景加3倍的標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算檢出限（LOD），發(fā)現(xiàn)該檢測(cè)體系LOD達(dá)到了29.9 amol/L［圖4（F）］，與相同體系使用微陣列隔離液滴降低擴(kuò)散的方法相比降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)［11］，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的酶促數(shù)字式檢測(cè)體系.本文方法的線性范圍為29.9 amol/L~14.5 fmol/L，檢測(cè)范圍近3個(gè)數(shù)量級(jí)，也比微陣列隔離的數(shù)字式檢測(cè)方法顯著提升.以上結(jié)果均證明，本文構(gòu)建的底物C-4適用于基于液滴的酶促數(shù)字式檢測(cè)，并可達(dá)到比傳統(tǒng)數(shù)字式檢測(cè)方法更優(yōu)的檢測(cè)性能與線性范圍.

3 結(jié) 論

對(duì)香豆素?zé)晒猱a(chǎn)物進(jìn)行簡(jiǎn)單改造，即合成了水溶性較高的熒光產(chǎn)物C-2，降低了熒光產(chǎn)物的辛醇-水分配系數(shù)；改造后的熒光產(chǎn)物C-2在液滴中具有顯著的抑制熒光擴(kuò)散作用，即使存放24 h仍無(wú)明顯擴(kuò)散現(xiàn)象.作為對(duì)比，常用的4-MU在液滴中擴(kuò)散明顯，在5 min時(shí)即出現(xiàn)明顯的擴(kuò)散.在液滴數(shù)字式檢測(cè)SP-AKP時(shí)發(fā)現(xiàn)，改性后底物C-4可有效抑制熒光產(chǎn)物的擴(kuò)散，確保了數(shù)字式信號(hào)讀取的準(zhǔn)確性，檢出限低至29.9 amol/L，檢測(cè)性能顯著優(yōu)于以4-MU為底物的數(shù)字式檢測(cè)系統(tǒng)，且對(duì)于高濃度的SP-AKP檢測(cè)依然表現(xiàn)出低變異系數(shù)和高一致性的優(yōu)良性能.因此，底物C-4有望替代4-MUP用于數(shù)字式檢測(cè)應(yīng)用中.此外，本文方法還可拓展到以C-2為熒光產(chǎn)物的其它酶底物的合成中，如半乳糖苷酶等.