多價環(huán)狀模板法合成交聯(lián)膠束和類環(huán)膠體

張 淼，彭金磊，劉 映，劉芳君，馬 偉，魏 華

（1.南華大學藥學院,湖南省分子靶向新藥協(xié)同創(chuàng)新中心,衡陽421001；2.蘭州大學化學化工學院,應用有機化學國家重點實驗室,甘肅省有色金屬化學與資源利用重點實驗室,蘭州730000）

環(huán)狀結構材料（包括環(huán)狀聚合物和環(huán)狀膠體）由于具有豐富的拓撲結構和不同于線性類似物的獨特的物理化學性質而備受關注［1，2］.在相同的分子量（Mw）下，環(huán)狀聚合物的玻璃化轉變溫度（Tg）更高，特性黏度更低，并且熱穩(wěn)定性更高［3~8］.對于藥物控釋應用而言，此類結構獨特的特性使其性能優(yōu)于其線性類似物，包括增強的膠體穩(wěn)定性、更高的細胞吸收效率和對癌細胞更高的體外細胞毒性［9~16］.目前，通過擴環(huán)聚合和閉環(huán)反應合成環(huán)狀聚合物的方法都存在固有的局限性.擴環(huán)法通常需要特定的單體結構和獨特的催化劑，而閉環(huán)反應則需要復雜的化學合成過程和高純度要求［17~21］.因此，尋找新的環(huán)狀聚合物合成方法已成為亟待解決的問題.

環(huán)糊精是一種具有獨特分子結構的天然環(huán)狀低聚糖分子，其自發(fā)現(xiàn)以來就一直備受關注［22，23］.環(huán)糊精的親水性外緣和內部獨特的疏水空腔可以與客體分子絡合［24，25］，并且可以通過主客體識別作用構建基于環(huán)糊精的不同拓撲結構，如線性、環(huán)狀、星形和網(wǎng)狀結構［26~28］.最近報道的以三臂星狀聚合物作為刻蝕模板，精確合成環(huán)狀膠體和環(huán)狀聚合物的研究已被證實是對目前廣泛采用的環(huán)狀聚合物的閉環(huán)反應和擴環(huán)聚合（REP）的有效補充［29］.但該模板在極稀濃度（0.3 mg/mL）的稀釋條件下才會形成作為環(huán)狀結構前體的單分子膠束.因此，開發(fā)一種以更高的濃度生產(chǎn)交聯(lián)膠束和類環(huán)膠體的模板具有重要意義.

本文通過使用一種易于制備且性能良好的環(huán)狀聚合物——環(huán)狀聚甲基丙烯酸羥乙酯［c-P（HEMA）50］作為多價模板可控合成了交聯(lián)膠束和類環(huán)膠體.首先通過點擊偶聯(lián)法，用二茂鐵（Fc）修飾c-P（HEMA）50的側鏈羥基，得到二茂鐵修飾的多價環(huán)狀聚合物模板c-P（HEMA-Fc）50，該模板可通過β-CD/Fc的主客體識別作用，在Fc位點有序偶聯(lián)以親水聚乙二醇（PEG）和硫辛酸（LA）功能化的β-環(huán)糊精（β-CD），形成具有明顯核殼結構的超分子膠束；所得到的超分子膠束可進一步通過加入催化劑量的二硫蘇糖醇（DTT）引發(fā)β-CD上修飾的LA單元的分子內的自交聯(lián)反應，得到交聯(lián)的超分子膠束，該交聯(lián)超分子膠束可以在1.0 mg/mL的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和水溶液中穩(wěn)定存在，以用于大規(guī)模制備交聯(lián)膠束和類環(huán)膠體.進一步研究了交聯(lián)超分子膠束的自組裝行為和體外抗癌藥物傳遞性能.與三臂星狀聚合物模板相比，環(huán)狀聚合物為模板的優(yōu)勢在于環(huán)狀多價結構具有更高的穩(wěn)定性和空間位阻效應，以其為模板制備的交聯(lián)膠束和類環(huán)膠體的膠束前驅溶液的濃度可顯著提高至1.0 mg/mL.利用環(huán)狀多價模板制備環(huán)狀膠體的過程如Scheme 1所示.

Scheme 1 Schematic illustration of a cyclic template with multivalency for the production of ring?like colloids

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

2-溴代異丁酰溴（iBuBr，98%）、2，2′-聯(lián)吡啶（bpy，98.0%）、4-二甲氨基吡啶（DMAP，99%）和三乙胺（TEA，99%），分析純，北京百靈威科技有限公司；二茂鐵甲酸（Fc-COOH）、DL-硫辛酸（LA）、二環(huán)己基碳二亞胺（DCC，99%）、N，N，N’，N’，N”-五甲基二亞乙基三胺（PMDETA，99%）和對甲苯磺酰氯（p-TsCl，99%），分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；N，N-碳酰二咪唑（CDI）、聚乙二醇單甲醚（mPEG350）、二硫蘇糖醇（DTT）和溴化亞銅（CuBr，99.999%），分析純，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；β-環(huán)糊精（β-CD，96%，Mr=1134.98），分析純，梯希愛（TCI）（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，使用前需真空干燥除水；甲基丙烯酸羥乙酯（HEMA，99%），分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，使用前需要通過堿性Al2O3色譜柱除去阻聚劑；疊氮化鈉（NaN3），分析純，上海三友試劑廠；無水乙醚和丙酮，分析純，衡陽市凱信化工試劑股份有限公司；2-異丙醇（IPA，99.0%）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、四氫呋喃（THF）、二氯甲烷（DCM）、乙酸乙酯和正己烷，分析純，利安隆博華（天津）醫(yī)藥化學有限公司，直接使用；無水二氯甲烷（DCM）使用前需在N2氣回流保護下重新蒸餾；透析袋（截留分子量為3500，1000和10000），西安優(yōu)博生物科技有限公司；胎牛血清和達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM），美國Gibico公司.

JEOL-ECS型核磁共振波譜儀（400 MHz，NMR），日本JEOL公司，以CDCl3和DMSO-d6作為氘代試劑；NEXUS 670型傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR），美國Nicolet公司，溴化鉀壓片法，測試范圍4000~400 cm?1；DAWN EOS型體積排除色譜與多角度激光光散射聯(lián)用儀（SEC-MALLS），美國Agilent公司，使用HPLC級含0.1%（質量分數(shù)）溴化鋰的DMF為洗脫劑，測試流速1.0 mL/min，柱溫60℃；Zetasizer Nano ZS型動態(tài)激光光散射儀（DLS），英國Malvern公司；H-7000型透射電子顯微鏡（TEM），日本日立公司，測試時加速電壓為100 kV；Nanite型原子力顯微鏡（AFM），瑞士Nanosurf公司；Multifuge XIR型高速離心機，美國Thermo Scientific公司；Zetasizer Nano ZS型動態(tài)激光光散射（DLS），英國Malvern公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 小分子引發(fā)劑2-溴異丁酸丙炔酯（Alkyne-Br）的制備 將重新蒸餾后的2.0 g丙炔醇和6.8 g三乙胺加入裝有50 mL無水DCM的150 mL圓底燒瓶中，冰浴攪拌30 min；將用無水DCM溶解的9.0 g 2-溴代異丁酰溴溶液緩慢滴入上述混合溶液中，待反應液滴加完成后繼續(xù)冰浴攪拌1 h，然后將燒瓶轉移到室溫下，繼續(xù)攪拌反應12 h.反應完成后對溶液進行抽濾，收集濾液，并用蒸餾水洗滌4次，溶液用無水硫酸鈉進行充分干燥，旋轉蒸發(fā)除去DCM，以體積比為5/1的乙酸乙酯和正己烷溶液為洗脫劑柱層析粗產(chǎn)品，旋轉蒸發(fā)除去有機溶劑，真空干燥，得到無色油狀產(chǎn)物2-溴異丁酸丙炔酯，產(chǎn)率80%.圖S1（見本文支持信息）為2-溴異丁酸丙炔酯的1H NMR圖.

1.2.2 二茂鐵甲酸丙炔酯的制備 將2.30 g（10.00 mmol）二茂鐵甲酸和2.44 g（20.00 mmol）DMAP用30 mL無水DCM充分溶解后，轉移到圓底燒瓶中于冰浴下攪拌；將溶有3.10 g（15.00 mmol）DCC和1.24 g（20.00 mmol）乙二醇的10 mL DCM溶液在冰浴下緩慢滴入上述圓底燒瓶中進行反應，滴加完成后在室溫下繼續(xù)反應12 h；反應完成后抽濾，將濾液濃縮后以硅膠柱純化產(chǎn)物，真空干燥后得到二茂鐵甲酸丙炔酯橙紅色固體，產(chǎn)率65%.圖S2（見本文支持信息）為二茂鐵甲酸丙炔酯的1H NMR譜圖.

1.2.3 l-P（HEMA）50-Br的制備 將0.236 mmol（48.38 mg）小分子引發(fā)劑Alkyne-Br，11.8 mmol（1.44 mL）HEMA和0.471 mmol（73.10 mg）2，2′-聯(lián)吡啶（bpy）溶于1.458 mL DMF和0.195 mL IPA的混合溶液中，待完全溶解后，將混合溶液轉移至25 mL聚合反應管中，擰緊聚合管，進行3次冷凍-抽氣-解凍循環(huán)后，在N2氣保護下，將0.236 mmol（33.98 mg）CuBr迅速用紙筒加入到聚合反應管底部，繼續(xù)進行3次冷凍-抽氣-解凍循環(huán)，封管，于65℃攪拌反應30 min后，打開聚合管，使其與空氣接觸淬滅反應，并加入2 mL DMF稀釋黏稠的深棕色反應物；將該反應物滴加至過量的冰乙醚中沉淀出粗產(chǎn)物，將粗產(chǎn)物用少量DMF溶液溶解，并轉移至截留分子量為3500的透析袋中，用水透析48 h，每24 h換水1次，以保證產(chǎn)物中沒有殘留的銅催化劑和未反應的單體，最后冷凍干燥透析液，得到白色固體l-P（HEMA）50-Br，產(chǎn)率87%.

1.2.4 線性前體l-P（HEMA）50-N3的制備 在裝有磁子的25 mL圓底燒瓶中分別加入800 mg l-P（HEMA）50-Br、154.94 mg NaN3和10 mL DMF，于45℃攪拌反應48 h；反應結束后，將反應液直接轉移到截留分子量為3500的透析袋中，用蒸餾水透析48 h，每12 h換一次水，以去除殘留的鈉鹽；冷凍干燥，得到白色固體l-P（HEMA）50-N3，產(chǎn)率90%.

1.2.5 環(huán)狀聚合物c-P（HEMA）50的制備 在裝有磁子的1000 mL三頸瓶中加入450 mL DMF，接入冷凝回流裝置，緩慢升溫至100℃，向DMF中持續(xù)通入高純N2氣鼓泡除氧1 h，然后向三頸瓶中依次加入187.68μL PMDETA和128.94 mg CuBr；同時，用10 mL DMF溶解300 mg l-P（HEMA）50-N3，小流速通入N2氣鼓泡1 h以盡可能除去溶液中的氧氣；將除去氧氣的l-P（HEMA）50-N3溶液以0.4 mL/h的速度用注射泵緩慢注入CuBr/PMDETA催化體系中，注射完成后于100℃反應24 h；反應結束后，待反應液冷卻至室溫后，于80℃旋轉蒸發(fā)除去大量的DMF；然后將剩余的溶液（5 mL左右的DMF溶液）轉移到截留分子量為3500的透析袋中用水透析；透析24 h后，離心除去銅催化劑，將上清液繼續(xù)用水透析36 h；冷凍干燥得到白色絮狀產(chǎn)物c-P（HEMA）50，產(chǎn)率67%.

1.2.6 c-P（HEMA-Br）50大分子引發(fā)劑的制備 將100 mg c-P（HEMA）50溶解在4 mL無水DMF中，在冰水浴中攪拌，并持續(xù)通入N2氣；在反應混合物中逐滴加入324μL 2-溴代異丁酰溴，滴加完成后繼續(xù)于0℃下攪拌1 h，然后在室溫下攪拌24 h；待反應結束后用過量的冰乙醚對產(chǎn)物進行沉淀，得到的固體沉淀物用2 mL DMF溶解，并轉移到截留分子量為3500的透析袋中用水透析48 h，每24 h換水1次；將透析液冷凍干燥，得到白色固體粉末c-P（HEMA-Br）50，產(chǎn)率95.3%.

1.2.7 環(huán)狀聚合物c-P（HEMA-N3）50的制備 將135.28 mg（0.0045 mmol）c-P（HEMA-Br）50與311.39 mg（10.06 mmol）NaN3溶于3 mL無水DMF溶液中，于45℃攪拌反應48 h；反應結束后，將混合反應液直接轉移到截留分子量為3500的透析袋中用水透析48 h；冷凍干燥，得到淡黃色固體粉末c-P（HEMAN3）50，產(chǎn)率88.7%.

1.2.8 環(huán)狀聚合物模板c-P（HEMA-Fc）50的制備 將20 mg c-P（HEMA-N3）50和28.51 mg二茂鐵甲酸丙炔酯溶于3 mL DMF溶液中，加入17μL配體PMDETA形成均相；將混合溶液轉移至25 mL聚合反應管中，封管，進行3次冷凍-抽氣-解凍循環(huán)，打開N2氣袋，用紙筒迅速將11.74 mg CuBr催化劑加入到聚合管底部，重復上述冷凍-抽氣-解凍循環(huán)3次；封管，在50℃油浴鍋中反應24 h，反應結束后，先用冰乙醚進行沉淀，離心，粗產(chǎn)物用THF溶解后過中性Al2O3柱子，去除未反應完的銅催化劑，真空干燥，得到片狀黃褐色固體c-P（HEMA-Fc）50，產(chǎn)率89.6%.Scheme 2為c-P（HEMA-Fc）50的合成示意圖.

Scheme 2 Synthesis of c?P(HEMA?Fc)50

1.2.9β-CD-（mPEG350）5的制備 將2.37 gN，N-碳酰二咪唑（CDI）和2.56 g mPEG350溶于20 mL無水DCM中；將上述溶液轉移至50 mL圓底燒瓶中反應24 h；補加10 mL無水DCM，用30 mL飽和NaCl溶液洗滌5次，每次從下層油相中收集產(chǎn)物，加入無水Na2SO4干燥4~5 h，過濾后旋轉蒸發(fā)至干，用油泵將產(chǎn)物中殘留的DCM溶液抽干，將抽干的產(chǎn)物放入凍干機中繼續(xù)干燥，得到淡黃色黏稠狀液體CDI-（mPEG350）5，產(chǎn)率48%.

將639.36 mg CDI-（mPEG350）5用5 mL無水DMF溶解，加入0.5 mL TEA，轉移至25 mL圓底燒瓶中；再用2.5 mL無水DMF溶解272.4 mg干燥的CD，轉移至恒壓滴液漏斗中，緩慢滴加入圓底燒瓶中，常溫攪拌反應24 h；反應結束后，反應液用無水乙醚沉淀2次，冷凍干燥，得到黏而硬的白色透明產(chǎn)物β-CD-（mPEG350）5，產(chǎn)率73.6%.

1.2.10β-CD-（mPEG350）5-LA6的制備 將215.22 mgβ-CD-（mPEG350）5、88.37 mg DCC和43.60 mg DMAP溶于4 mL無水DCM中；將溶液轉移至25 mL聚合反應管中，擰緊聚合管，進行冷凍-抽氣-解凍循環(huán)3次，在N2氣保護下，于黑暗中將73.64 mg硫辛酸迅速加入聚合管底部；重復上述冷凍-抽氣-解凍循環(huán)3次，封管，避光冰水浴攪拌1 h后撤去冰浴，室溫避光攪拌24 h；反應完成后過濾除去生成的N，N-二氯氨基甲酸乙酯（DCU）副產(chǎn)物，用冰乙醚沉淀2次，離心，冷凍干燥后得到黃色黏稠狀鍵合硫辛酸的親水段β-CD-（mPEG350）5-LA6，產(chǎn)率68.4%.Scheme 3為β-CD-（mPEG350）5-LA6的合成示意圖.

1.2.11 超分子膠束［c-P（HEMA-Fc）50/β-CD-（mPEG350）5-LA6］的制備及交聯(lián) 用1 mL DMF溶解21.36 mg疏水段聚合物c-P（HEMA-Fc）50，然后轉移到2.64 mgβ-CD-（mPEG350）5-LA6親水段的離心管中，使其充分溶解后，通N2氣5 min，室溫下避光超聲1.5 h；將超聲后的聚合物溶液用注射泵以0.5 mL/h的速度緩慢注入到24 mL通N2氣的去離子水中，注射完成后再攪拌2 h，以確保成功形成超分子膠束；攪拌完成后，將上述聚合物水溶液直接轉移到截留分子量為10000的透析袋中，用去離子水透析24 h以除去有機溶劑DMF，將透析所得聚合物水溶液冷凍干燥，得到c-P（HEMA-Fc）50/β-CD-（mPEG350）5-LA6自組裝體.

用1 mL DMF溶解21.36 mgc-P（HEMA-Fc）50疏水段聚合物，轉移到裝有2.64 mgβ-CD-（mPEG350）5-LA6親水段的離心管中，待其充分溶解后，通入N2氣5 min，室溫下避光超聲1.5 h；將超聲后的聚合物溶液用注射泵以0.5 mL/h的速度緩慢注入到10 mL通N2氣的去離子水中，注射完成后再攪拌2 h；用截留分子量為10000的透析袋用水透析2 h；補入14 mL去離子水，轉移至50 mL圓底燒瓶中，通N2氣攪拌1 h；將2.03 mg催化劑DTT（硫辛酸摩爾數(shù)的10%）用1 mL超純水溶解，用移液槍取33.84μL DTT溶液加入到上述24 mL自組裝溶液中，避光攪拌24 h；反應結束后，直接轉移到截留分子量為10000的透析袋中用水透析24 h，冷凍干燥，得到交聯(lián)產(chǎn)物c-P（HEMA-Fc）50/β-CD-（mPEG350）5-LA6（CLP）.

1.2.12 環(huán)狀核模板的刻蝕 將交聯(lián)后的3 mg聚合物溶于2 mL DMF溶液中，轉移至截留分子量為100000的透析袋中，于含有500 mL DMF的1 L燒杯中透析，加熱至50℃，以脫除環(huán)狀疏水聚合物模板，透析 72 h，每24 h更換一次DMF；有機溶劑透析結束后，將透析袋轉移至5 L去離子水中透析24 h；將透析溶液冷凍干燥，得到類環(huán)聚合物（Cyclic P），產(chǎn)率71.4%.

1.2.13 交聯(lián)載藥膠束的體外細胞毒性 將包藥后的聚合物溶于水，配成母液，逐漸稀釋為一系列濃度的聚合物樣品，將其接種在OptiMEM培養(yǎng)基上；將細胞鋪在細胞密度為2500 Cell/孔的96孔板上，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，然后用PBS緩沖溶液洗滌細胞；將40μL預先接種好的樣品加入到上述培養(yǎng)基中，在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)4 h；培養(yǎng)后的細胞用PBS緩沖溶液洗滌，并加入新鮮的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；在每個孔板上加入20μL MTS試劑，在上述培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)細胞3 h；通過Tecan Safire 2平板讀數(shù)器測定每個孔在490 nm處的吸光度值，計算出加入上述材料后細胞的存活率.

Scheme 3 Synthesis ofβ?CD?(mPEG)5?LA6

2 結果與討論

2.1 環(huán)狀聚合物模板c-P(HEMA-Fc)50的制備與表征

采用ATRP與點擊化學相結合的方法合成目標聚合物c-P（HEMA-Fc）50.主要合成步驟如下：（i）采用ATRP技術，以Alkyne-Br引發(fā)單體HEMA聚合，制備線性聚合物l-P（HEMA）50-Br；（ii）通過線性聚合物l-P（HEMA）50-Br末端溴與疊氮基進行親核取代反應制備線性前體l-P（HEMA）50-N3；（iii）在極稀條件下，通過分子內點擊環(huán)化線性前體l-P（HEMA）50-N3制備環(huán)狀聚合物c-P（HEMA）50；（iv）環(huán)狀聚合物c-P（HEMA）50與過量的iBuBr進行酯化反應，得到環(huán)狀大分子引發(fā)劑c-P（HEMA-Br）50；（v）環(huán)狀大分子引發(fā)劑c-P（HEMA-Br）50與NaN3反應，得到末端含有疊氮基的環(huán)狀聚合物c-P（HEMA-N3）50；（vi）c-P（HEMA-N3）50與二茂鐵甲酸丙炔酯進行點擊耦合反應，制備二茂鐵修飾的環(huán)狀聚合物模板c-P（HEMA-Fc）50.

首先通過ATRP技術合成了線性聚合物l-P（HEMA）50-Br，其1H NMR譜圖見圖S3（見本文支持信息）上出現(xiàn)明顯的HEMA單元的特征信號峰，根據(jù)δ4.60處與炔基相連的亞甲基質子b峰和PHEMA與羰基相連的亞甲基質子f峰及其側鏈末端的羥基質子h峰的積分強度比，得到HEMA單元的聚合度約為50.同時圖S4（見本文支持信息）顯示l-P（HEMA）50-Br在DMF溶液中的SEC-MALLS淋洗曲線呈單峰窄分布.通過線性末端溴與NaN3進行親核取代反應，使l-P（HEMA）50-Br末端帶上可點擊的疊氮基.疊氮化后，SEC-MALLS分析表明，其SEC-MALLS淋洗曲線呈單峰分布，且整體稍微向右移動，表明成功進行了疊氮化反應（見本文支持信息圖S4）.

在極稀的DMF溶液中鏈內點擊環(huán)化線性前體l-P（HEMA）50-N3，成功制備了目標聚合物環(huán)狀c-P（HEMA）50.圖S5（見本文支持信息）中δ4.60處烷基乙烯的乙烯質子峰消失；與線性聚合物相比，環(huán)狀聚合物由于缺少鏈末端而流體力學體積較小，因此，其SEC淋洗曲線整體向右偏移（低分子量）（圖S4）；在FTIR譜圖（圖S6，見本文支持信息）中，2100 cm?1處的疊氮基特征吸收峰消失.以上結果均證實成功進行環(huán)化反應，合成了環(huán)狀聚合物c-P（HEMA）50.

通過酯化反應制備了環(huán)狀大分子引發(fā)劑c-P（HEMA-Br）50.通過比較圖S5中c-P（HEMA）50和圖S7（見本文支持信息）中c-P（HEMA-Br）50的1H NMR譜圖可以發(fā)現(xiàn)，在圖S7中圖S5中δ4.79處HEMA單元的末端羥基峰消失了，同時在δ1.90處出現(xiàn)了新的信號較強的質子峰a，這是發(fā)生酯化反應后緊挨著Br的甲基的質子峰，由此證明c-P（HEMA）50上的羥基被Br完全取代.

c-P（HEMA-Br）50的末端溴與NaN3發(fā)生親核取代反應，疊氮化后，SEC-MALLS分析表明，其SECMALLS淋洗曲線呈單峰分布，且其SECMALLS曲線整體稍微向右移動，表明成功進行了疊氮化反應（圖S8，見本文支持信息）.將c-P（HEMA-N3）50與二茂鐵甲酸丙炔酯進行分子間點擊反應制備側鏈含有二茂鐵單元的環(huán)狀聚合物模板c-P（HEMA-Fc）50.圖1給出c-P（HEMA-Fc）50的1H NMR譜圖，其中的質子峰a，b和c為二茂鐵單元的特征質子峰，通過計算δ1.75處的j峰與二茂鐵在δ4.3處的質子b峰和δ5.25處的質子c峰的積分強度比，得到點擊效率接近100%，并且圖S8中SEC-MALLS淋洗曲線明顯前移，表明點擊反應是成功的.

Fig.1 1H NMR spectrum of c?P(HEMA?Fc)50 in DMSO?d6

2.2 親水段β-CD-(mPEG350)5-LA6的制備與表征

通過CDI與單體mPEG350進行酯化反應得到β-CD-（mPEG350）5；再進一步通過DCC縮合反應，利用環(huán)糊精多羥基位點與硫辛酸（LA）功能化的環(huán)糊精制備β-CD-（mPEG350）5-LA6.

通過酯化反應得到CDI-（mPEG350）5，其1H NMR譜如圖S9（見本文支持信息）所示，由δ3.3處mPEG350鏈末端的甲基質子a峰及與CDI相連的酯基旁邊的亞甲基質子b峰積分面積得到mPEG350的聚合度為5，同時在δ8.2，7.5和7.2處分別出現(xiàn)CDI的特征氫峰（e，c和d峰）.

通過環(huán)糊精與硫辛酸進行DCC縮合反應制備親水段，其1H NMR譜如圖2所示，根據(jù)mPEG350鏈末端的甲基質子a峰與硫辛酸的特征氫b，c和d峰的積分面積比，計算得到硫辛酸的鍵合數(shù)為6.圖3給出了所制備的兩親性聚合物［c-P（HEMA-Fc）50/β-CD-（mPEG350）5-LA6］的SEC-MALLS淋洗曲線.所有制備的聚合物的分子參數(shù)列于表1.

Fig.2 1H NMR spectrum ofβ?CD?(mPEG)5?LA6 in CDCl3

Fig.3 SEC?MALLS elution traces ofβ?CD?(mPEG)5?LA6,c?P(HEMA?Fc)50,cross linking P(CLP)and cyclic P using DMF as an eluent

Table 1 Summary of molecular parameters of all the synthesized polymers

Fig.4 2D NOESY NMR spectra of c?P(HEMA?Fc)50 andβ?CD?(mPEG350)5 in DMSO?d6

2.3 超分子膠束的制備與表征

將親疏水段聚合物溶于有機溶劑DMF中，超聲30 min后將其緩慢注射到大量超純水中，得到均相且澄清透明的聚合物溶液.圖4給出β-CD-（mPEG350）5和c-P（HEMA-Fc）50的二維NOESY譜圖，證明成功制備了β-CD/Fc主-客體包合物.紫色圓圈中突出的交叉峰歸屬于β-CD質子在δ3.25~3.60范圍內的特征吸收峰與Fc在δ4.20~4.50范圍內的共振吸收峰之間的偶極相互作用.環(huán)狀核模板的多價結構使所制備的超分子核-殼膠束比先前報道的基于三臂星形聚合物模板的膠束前體具有更高的穩(wěn)定性和空間位阻，從而顯著提高了制備交聯(lián)膠束和類環(huán)膠體的濃度（1.0 mg/mL，先前使用的環(huán)狀膠體的濃度為0.3 mg/mL）.在37℃，聚合物濃度為1.0 mg/mL時通過動態(tài)光散射（DLS）測得c-P（HEMA-Fc）50與β-CD-（mPEG350）5-LA6自組裝膠束的平均流體動力學直徑為142.6 nm（圖5）.根據(jù)SEC-MALLS測 定 的c-P（HEMA-Fc）50（63.7 nm）和β-CD-（mPEG350）5-LA6（20.3 nm）的Rg值（表1），超分子膠束的直徑約為100 nm，與DLS數(shù)據(jù)吻合較好.該超分子膠束具有優(yōu)異的穩(wěn)定性，其在0.03~1.0 mg/mL的各種稀釋濃度幾乎保持相同的流體力學尺寸和尺寸分布，這歸因于環(huán)狀聚合物作為模板時可能處于具有更大穩(wěn)定性和空間位阻的多價結構中，從而導致制備環(huán)狀材料的膠體濃度顯著增加.同時，該膠束在水相和DMF相的流體力學體積表現(xiàn)出幾乎相同的尺寸及尺寸分布［圖6（A）］.以上結果證實，環(huán)狀聚合物作為多價核心模板具有更大的穩(wěn)定性和空間位阻性，有利于環(huán)類膠體和環(huán)狀聚合物的大規(guī)模生產(chǎn).

Fig.5 Mean hydrodynamic size and size distribution of P micelles at various concentrations ranging from 0.03 mg/mL to 1.2 mg/mL

Fig.6 Mean hydrodynamic size and size distribution of P micelles in water and DMF at a polymer concentration of 1.0 mg/mL(A)and NCLP,CLP and Cyclic P micelles in a polymer concen?tration of 1.0 mg/mL(B)

2.4 DTT催化的交聯(lián)膠束的制備與表征

向c-P（HEMA-Fc）50/β-CD-PEG-LA的超分子膠束中進一步加入催化劑量的二硫蘇糖醇（DTT），引發(fā)β-CD上修飾的LA單元的分子內的自交聯(lián)反應，得到交聯(lián)的超分子膠束（CLP），作為下一步環(huán)狀結構的刻蝕模板.臨界膠束濃度對于制備CL膠束前體至關重要，一方面，該濃度應足夠低，以確保僅發(fā)生膠束內交聯(lián)而沒有任何膠束間反應的發(fā)生；另一方面，該濃度也應該足夠高，以允許以適當?shù)漠a(chǎn)率大規(guī)模生產(chǎn)環(huán)狀膠體.由于使用的環(huán)狀核模板具有多價性、穩(wěn)定性和增強的空間位阻，本文制備環(huán)狀膠體的前體濃度（1.0 mg/mL）明顯高于以三臂星狀聚合物作為模板時的濃度（0.3 mg/mL）.圖6（B）中未交聯(lián)超分子膠束（NCLP）和交聯(lián)超分子膠束幾乎一致的流體力學直徑表明在此關鍵制劑濃度下的膠束內交聯(lián)占主導地位.利用SEC-MALLS進行脫核后的表征，選擇DMF為洗脫劑，柱子的溫度為60℃.可以發(fā)現(xiàn)，交聯(lián)后SEC洗脫曲線明顯前移，并且出現(xiàn)兩個SEC洗脫峰，其保留時間分別為16 min及20 min左右（圖3）.根據(jù)先前的文獻報道，DMF是親疏水段的良溶劑，當在較高溫度（50℃）時，環(huán)糊精會與客體分子之間發(fā)生解組裝［29］，因此出現(xiàn)的雙峰中具有較短保留時間的主峰就合理地歸屬為親水段交聯(lián)后脫去環(huán)狀模板c-P（HEMA-Fc）50的洗脫峰，并且其保留時間與c-P（HEMA-Fc）50相符合.另外環(huán)狀聚合物的SEC-MALLS洗脫峰向較短的洗脫時間明顯轉移，通過計算，環(huán)狀P的Mn（Mn=350100）約是單個親水段β-CD-（mPEG350）5-LA6（Mn=7100）的50倍（表1），這一結果證明通過基于P膠束的充分交聯(lián)成功地形成了包含50個β-CD-（mPEG350）5-LA6親水段的環(huán)狀膠體.上述結果證實了使用DMF和相對較高的溫度來刻蝕環(huán)狀核模板c-P（HEMA-Fc）50的可行性.

2.5 環(huán)狀聚合物和類環(huán)膠體的制備與表征

在較高溫度（50℃）下的DMF溶液中，通過破壞環(huán)糊精與客體分子二茂鐵之間的相互作用力，刻蝕掉環(huán)狀核模板c-P（HEMA-Fc）50.當膠束解組裝后，通過親疏水段聚合物分子量的差異，選擇合適分子量的透析袋（100000）選擇性分離c-P（HEMA-Fc）50，最后得到完全由環(huán)糊精構建的環(huán)狀聚合物.脫核后SEC-MALLS淋洗曲線呈現(xiàn)的單峰表明疏水環(huán)狀聚合物核模板已被脫除，成功制備了環(huán)狀聚合物或類環(huán)膠體.通過DLS測試得到交聯(lián)前c-P（HEMA-Fc）50/β-CD-（mPEG）5-LA6液體力學粒徑為142.6 nm，交聯(lián)后為137.1 nm，脫掉環(huán)狀模板后為214.2 nm.

透射電子顯微鏡（TEM）測量可以直觀地觀察每個階段聚合物的形態(tài)變化.未交聯(lián)超分子膠束（NCLP）和交聯(lián)超分子膠束（CLP）均形成大小相似且分散均勻的球形納米顆粒，其平均直徑約為35 nm［圖7（A）和（B）］，這也證實了交聯(lián)僅發(fā)生在膠束內，而未發(fā)生任何膠束間反應.當刻蝕掉環(huán)狀核模板c-P（HEMA-Fc）50后，TEM圖像顯示出明顯的形態(tài)轉變，其納米粒子的大小已增加到大約45 nm［圖7（C）］.這種尺寸變化說明疏水內核的去除促使親水部分溶脹，這與DLS結果非常吻合［圖6（B）］.圖7（D）給出環(huán)狀聚合物的AFM照片，圖中清晰而均勻的環(huán)有力地證實了環(huán)狀內核的刻蝕及成功生成環(huán)狀聚合物.類環(huán)狀聚合物的平均大小約為42 nm，這與TEM分析結果吻合.與TEM數(shù)據(jù)相比，類環(huán)狀聚合物膠束在DLS下的平均尺寸略大，這可能是由于環(huán)狀聚合物的狀態(tài)不同，即用于TEM觀測的為脫水狀態(tài)而用于DLS測量的為水合狀態(tài)［30］.

Fig.7 TEMimages of NCLP(A),CLP(B)and Cyclic P(C)and AFMimage of Cyclic P(D)

2.6 交聯(lián)載藥膠束的體外細胞毒性

在人肝癌細胞HepG2中，通過MTS法評估了空白和負載抗癌藥物阿霉素（DOX）的交聯(lián)膠束的體外細胞毒性.由圖8可見，即使在濃度高達0.48 mg/mL時，空白膠束對HepG2細胞仍表現(xiàn)為不抑制，細胞存活率高于80%，結果表明空白聚合物膠束對肝癌細胞基本無毒，具有良好的生物相容性.

同時，我們考察了負載DOX的交聯(lián)膠束的體外細胞毒性.經(jīng)GraphPad Prism 6軟件計算得到自由DOX和載藥交聯(lián)膠束的IC50（即細胞存活率為50%對應的藥物濃度）值分別為1.09（置信區(qū)間為0.87~1.32）和70.81（置信區(qū)間為60.50~81.11）μg/mL.載藥交聯(lián)膠束的體外細胞毒性［圖9（A）］明顯低于自由DOX［圖9（B）］，這可能是因為自由DOX具有直接的膜滲透機制，而載藥交聯(lián)膠束是通過較慢的內吞作用進入細胞的，同時相對于直接在胞內發(fā)揮藥效的小分子DOX，載藥膠束在胞內是通過藥物釋放動力學來實現(xiàn)藥物的釋放，說明本文制備的聚合物在藥物控釋與癌癥治療領域具有很大的應用潛力［31］.

Fig.9 In vitro cytotoxicity of HepG2 cells incubated for 24 h with DOX?loaded CLP micelles(A)and free DOX(B)

3 結 論

使用一種易制備且性能良好的環(huán)狀聚合物——環(huán)狀聚甲基丙烯酸羥乙酯［c-P（HEMA）50］作為生產(chǎn)相對較高濃度的環(huán)狀膠體的新型模板.該環(huán)狀聚合物模板具有更高的穩(wěn)定性和空間位阻的多價結構，其制備交聯(lián)膠束和類環(huán)膠體膠束的前驅溶液的濃度可顯著提高至1.0 mg/mL.本文不僅發(fā)展了簡單高效的制備環(huán)狀聚合物的新策略，并且所開發(fā)的具有聚二硫鍵的還原敏感性交聯(lián)膠束和環(huán)狀膠體在控釋應用中具有巨大潛力.

支持信息見http：//www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20210370.