張曉榮,陳嵐嵐,胡善文
(1.福建醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫學(xué)系,福州350122;2.福州大學(xué)化學(xué)學(xué)院,福州350108)
細(xì)菌是一類廣泛存在于自然環(huán)境中的個(gè)體微小、肉眼難以辨別、必須借助顯微鏡觀察的原核生物,其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,多以二分裂方式進(jìn)行繁殖[1,2].細(xì)菌在與人體的共生中發(fā)揮著促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)和代謝、增強(qiáng)屏障功能、抑制病原體和調(diào)節(jié)免疫等重要作用,在維持腸道穩(wěn)態(tài)和預(yù)防炎癥方面也起著至關(guān)重要的作用[2~4].然而,生活中致病菌的存在對(duì)公眾健康和安全造成了嚴(yán)重威脅,尤其是目前致病菌變異且出現(xiàn)耐藥性,給細(xì)菌的檢測(cè)和治療增加了難度[5~7].由細(xì)菌引起的傳染病如鼠疫、霍亂和肺結(jié)核等對(duì)經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展造成了極大影響.隨著對(duì)細(xì)菌群落研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)身體中細(xì)菌失調(diào)會(huì)導(dǎo)致不同的疾病,如腸道菌群的改變會(huì)引起免疫相關(guān)炎癥以及心理和行為的障礙[8]、口腔菌群的變化會(huì)導(dǎo)致牙周炎、齲齒以及糖尿病和癌癥等疾?。?].已有證據(jù)顯示,由某些細(xì)菌或真菌引起的感染是導(dǎo)致癌癥發(fā)展的危險(xiǎn)因素[10].因此,檢測(cè)細(xì)菌的種類及其數(shù)量變化情況對(duì)于公共衛(wèi)生和醫(yī)療健康具有重要作用.
自然界中細(xì)菌的種類龐大、數(shù)量眾多,使得檢測(cè)結(jié)果的特異性不高.另外,細(xì)菌在環(huán)境或生理樣本中總是以極低的濃度存在,而且檢測(cè)過(guò)程常常受到背景干擾,準(zhǔn)確檢測(cè)細(xì)菌的含量面臨著極大挑戰(zhàn)[11].傳統(tǒng)的細(xì)菌檢測(cè)方法基于培養(yǎng)分離、顯微鏡檢查和生化鑒定,通常需要較長(zhǎng)的時(shí)間(幾天甚至幾周),而且檢測(cè)過(guò)程中需要經(jīng)驗(yàn)判定,給檢測(cè)結(jié)果帶來(lái)不確定性[12,13].近幾年利用分子識(shí)別模式檢測(cè)和鑒定細(xì)菌的方法備受關(guān)注.分子識(shí)別是利用細(xì)菌體內(nèi)或表面的相關(guān)分子(如核酸分子和膜蛋白等),通過(guò)生物大分子來(lái)完成對(duì)目標(biāo)細(xì)菌的特異性識(shí)別,并利用信號(hào)放大等方式實(shí)現(xiàn)高靈敏檢測(cè).本文根據(jù)分子識(shí)別模式的差異,分別從免疫識(shí)別、核酸分子探針識(shí)別和核酸適體識(shí)別3個(gè)方面綜述了近年來(lái)細(xì)菌檢測(cè)的最新進(jìn)展(Scheme 1),分析了不同識(shí)別模式的優(yōu)勢(shì)和不足,并展望了細(xì)菌檢測(cè)識(shí)別方式的發(fā)展前景.
Scheme 1 Molecular recognition methods of bacte?ria based on immune,aptamer and nu?cleic acid probe
免疫識(shí)別是通過(guò)抗原-抗體特異性結(jié)合而達(dá)到檢測(cè)目的方式.最常用的免疫識(shí)別方法是酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),根據(jù)試劑來(lái)源和具體檢測(cè)條件的不同,ELISA又可以分為直接法、間接法、雙抗體比色夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法等類型.直接法是通過(guò)固定抗原再加入抗體形成抗原-抗體復(fù)合物,再加入底物后進(jìn)行顯色.間接法則是將抗原聯(lián)結(jié)到固相載體上,分別加入待測(cè)抗體和酶標(biāo)記抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)抗體的檢測(cè).常規(guī)的雙抗體比色夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)原理是抗原被附著在微孔板上的特異性抗體捕獲,形成抗原-抗體復(fù)合物;然后加入酶偶聯(lián)抗體,形成抗體-抗原-抗體“三明治”結(jié)構(gòu),清洗后,加入酶促反應(yīng)的底物,通過(guò)顏色變化等方式推斷目標(biāo)分子濃度[14~16].競(jìng)爭(zhēng)法是將特異性抗原固定在載體上,待測(cè)抗體與固相抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,通過(guò)結(jié)合固相抗體量與待測(cè)抗體量成反比來(lái)完成定量檢測(cè).酶聯(lián)免疫吸附方法具有簡(jiǎn)便、易于操作以及可視化等特點(diǎn),被認(rèn)為是臨床診斷、食品安全和環(huán)境監(jiān)測(cè)等應(yīng)用的金標(biāo)準(zhǔn)方法.在微生物鑒定方面,也常采用血清凝集實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行定性檢測(cè).由于細(xì)菌表面含有可供識(shí)別的菌體O及鞭毛H等不同類型的抗原,當(dāng)?shù)渭右阎贵w時(shí),在數(shù)分鐘內(nèi)可出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象,并根據(jù)有無(wú)凝集判斷細(xì)菌的種類.該方法可直接對(duì)細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè),但無(wú)法定量檢測(cè)細(xì)菌的含量.Nouri等[17]設(shè)計(jì)了一種用于檢測(cè)牛奶中金黃色葡萄球菌分泌的腸毒素的ELISA試劑盒,相比于夾心ELISA、電泳法和高效液相色譜法等,該方法能夠更快、更加準(zhǔn)確地測(cè)定金黃色葡萄球菌的含量.
Fig.1 Molecular recognition methods of bacteria based on immune
近年來(lái),隨著納米技術(shù)的發(fā)展,抗體-抗原分子識(shí)別與納米材料相結(jié)合為細(xì)菌的高靈敏、高特異性檢測(cè)提供了新方法[18].一方面,納米材料可以有效提高免疫識(shí)別分子的負(fù)載量,從而提高識(shí)別效率.如,Zhang等[19]利用磁珠修飾犬IgG抗體,特異性捕獲金黃色葡萄球菌,與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的雞IgY抗體形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu),實(shí)現(xiàn)了金黃色葡萄球菌的含量檢測(cè),此方法具有一定的商業(yè)應(yīng)用潛力.Bonnet等[20]用抗體修飾的磁珠從血小板濃縮物樣本中特異性捕捉大腸桿菌,并通過(guò)亞甲基藍(lán)標(biāo)記的DNA雙鏈組裝在納米顆粒上,利用亞甲基藍(lán)的電化學(xué)信號(hào)對(duì)大腸桿菌進(jìn)行了檢測(cè).另一方面,種類豐富的納米材料為提高檢測(cè)方法的靈敏度提供了豐富的選擇.如圖1(A)所示,Ye等[21]通過(guò)抗體修飾的磁珠捕捉大腸桿菌,再加入金鉑雙金屬功能化二氧化硅納米顆粒,其表面結(jié)合抗大腸桿菌的抗體和轉(zhuǎn)化酶,與捕獲的大腸桿菌結(jié)合后催化底物發(fā)生反應(yīng)引起電信號(hào)變化,通過(guò)納米材料的多重使用提高了方法的靈敏度,實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌的定量檢測(cè).
對(duì)細(xì)菌的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)在食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)及衛(wèi)生檢疫等領(lǐng)域具有重要意義.免疫層析試紙檢測(cè)方法是指在紙或?yàn)V膜等便攜式基底上構(gòu)建免疫識(shí)別傳感界面,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè).Vyas等[22]建立了一種熒光膠束二氧化硅納米免疫層析試紙,能夠在受感染奶牛的牛奶樣本中特異性檢測(cè)布魯氏菌IgG抗體,可以僅用幾微升樣品檢測(cè)牛乳中的布魯氏菌抗體[圖1(B)].Pang等[23]開(kāi)發(fā)了新型紙基酶聯(lián)免疫吸附試紙(Paper-ELISA)用于檢測(cè)大腸桿菌.Zhao等[24]使用蠟在紙上圖案化構(gòu)建功能區(qū),通過(guò)修飾辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體來(lái)識(shí)別大腸桿菌,檢測(cè)過(guò)程用時(shí)低于3 h,可檢測(cè)微升級(jí)別的樣品量,并且對(duì)大腸桿菌的檢出限達(dá)到104CFU/mL,比傳統(tǒng)ELISA更靈敏[圖1(C)].
核酸探針識(shí)別是一種高特異性、高效率的識(shí)別方式,通過(guò)核酸雜交過(guò)程完成分子識(shí)別,即核酸探針?lè)肿优c其互補(bǔ)鏈(目標(biāo)鏈)的堿基互補(bǔ)配對(duì)作用[25,26].由于核酸結(jié)構(gòu)本身不具有易于檢測(cè)的特性,核酸探針識(shí)別方法通常利用識(shí)別前后的構(gòu)象差異,結(jié)合相應(yīng)的標(biāo)記分子,將目標(biāo)分子的濃度信息轉(zhuǎn)化為電化學(xué)、熒光或拉曼等可檢測(cè)的信號(hào)[27].Xu等[28]將石墨烯/殼聚糖復(fù)合納米材料覆蓋在玻碳電極(GCE)上,結(jié)合靜電吸附與共價(jià)鍵合的雙重作用力固定大腸桿菌探針序列,目標(biāo)序列可與探針特異性結(jié)合,使得探針上標(biāo)記的亞甲基藍(lán)(MB)的信號(hào)發(fā)生變化,通過(guò)電化學(xué)信號(hào)定量大腸桿菌的核酸濃度.為了實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)物檢測(cè),Melaine等[29]建立了一種可同時(shí)檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌、銅綠假單胞菌和鼠傷寒沙門氏菌的16S rRNA的傳感方法,利用DNA探針產(chǎn)生金納米顆粒增強(qiáng)表面等離子共振信號(hào)進(jìn)行成像檢測(cè).因?yàn)楸砻嬖鰪?qiáng)拉曼基底與拉曼信號(hào)分子之間的表面等離子共振效應(yīng)強(qiáng)度與距離高度相關(guān),所以這種距離變化型傳感策略與表面增強(qiáng)拉曼散射光譜法(SERS)可以更好地結(jié)合.如,Hwang等[30]將帶有雙信號(hào)標(biāo)記的捕獲探針修飾在磁微粒上,當(dāng)存在目標(biāo)鏈時(shí),探針與其結(jié)合,釋放出拉曼標(biāo)記的探針,通過(guò)SERS信號(hào)的大小對(duì)細(xì)菌的濃度進(jìn)行定量,可同時(shí)檢測(cè)大腸桿菌、糞腸球菌和金黃色葡萄球菌的目標(biāo)DNA序列.Lu等[31]將單鏈DNA探針組裝在Fe3O4@SiO2-Au材料上組成SERS傳感器來(lái)識(shí)別抗生素耐藥基因tetA基因的單鏈DNA序列,并根據(jù)SERS信號(hào)確定細(xì)菌耐藥基因的含量.
由于實(shí)際樣品中細(xì)菌的目標(biāo)核酸鏈的濃度極低,核酸探針直接識(shí)別方法的靈敏度往往無(wú)法滿足需求,可利用核酸循環(huán)策略進(jìn)行信號(hào)放大,如雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、鏈置換反應(yīng)(SDR)、催化發(fā)夾組裝法(CHA)和環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增(LAMP)等,以有效提高核酸探針識(shí)別的靈敏度,從而更好地應(yīng)用于食品、環(huán)境或生理樣品的細(xì)菌檢測(cè)中[32].
HCR反應(yīng)是將2個(gè)部分互補(bǔ)的單鏈DNA設(shè)計(jì)為長(zhǎng)莖短環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)(H1和H2),目標(biāo)DNA鏈不存在時(shí)2個(gè)DNA發(fā)夾的混合物是穩(wěn)定的;而目標(biāo)單鏈DNA存在時(shí)可以打破長(zhǎng)莖保護(hù)環(huán)的能量平衡,觸發(fā)交替雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng),生成雙鏈DNA產(chǎn)物,通過(guò)累積修飾在發(fā)卡DNA上的標(biāo)記分子實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大[33].Lv等[34]發(fā)展了一種基于金納米顆粒結(jié)合HCR循環(huán)擴(kuò)增手段的電化學(xué)夾心法用于檢測(cè)幽門螺旋桿菌DNA.Liang等[35]基于大腸桿菌特定的fliCh7基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得單鏈DNA,再通過(guò)設(shè)計(jì)發(fā)夾探針H1/H2對(duì)單鏈DNA序列進(jìn)行HCR擴(kuò)增.該方法對(duì)信號(hào)進(jìn)行了2次擴(kuò)增,檢測(cè)結(jié)果優(yōu)于傳統(tǒng)單一方式的擴(kuò)增.Tang等[36]將HCR反應(yīng)與氧化石墨烯(GO)材料結(jié)合,開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)便的無(wú)酶信號(hào)放大策略,用于敏感檢測(cè)金黃色葡萄球菌16sRNA[圖2(A)].他們?cè)O(shè)計(jì)了2個(gè)用熒光團(tuán)6-羧基熒光素(FAM)標(biāo)記的發(fā)夾探針(HP1和HP2).HP1和HP2不僅可以觸發(fā)HCR,還可以與靶標(biāo)形成長(zhǎng)切口的雙鏈DNA.在無(wú)靶標(biāo)情況下,游離的FAM標(biāo)記的HP1和HP2被GO吸附,熒光信號(hào)被猝滅.當(dāng)存在靶標(biāo)時(shí),靶標(biāo)打開(kāi)HP1,開(kāi)環(huán)的HP1可以打開(kāi)HP2,而開(kāi)環(huán)的HP2又可以再次打開(kāi)1個(gè)新的HP1,于是HCR被觸發(fā),生成雙鏈DNA復(fù)合物,使得熒光信號(hào)可以通過(guò)FAM和雙鏈DNA染料SYBR Green I的協(xié)同作用而被放大.
RCA是一種等溫酶促過(guò)程,使用環(huán)形DNA模板和特殊的DNA或RNA聚合酶將短DNA或RNA引物擴(kuò)增形成長(zhǎng)單鏈DNA或RNA產(chǎn)物,通常是包含數(shù)十至數(shù)百個(gè)與環(huán)狀模板互補(bǔ)的串聯(lián)重復(fù)序列的多聯(lián)體[37,38].Li等[39]提出了一種基于3D DNA行走,RCA和HCR多重?cái)U(kuò)增策略的超靈敏生物傳感器,實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌的超靈敏定量檢測(cè).該方法首先從大腸桿菌中提取目的基因序列,采用DNA行走的方式對(duì)其進(jìn)行第一次擴(kuò)增,然后再分別通過(guò)RCA和HCR反應(yīng)進(jìn)行第二、第三次擴(kuò)增,產(chǎn)生長(zhǎng)的DNA雙鏈,接著將電化學(xué)標(biāo)記物嵌插入DNA雙鏈產(chǎn)物中,產(chǎn)生增強(qiáng)的電化學(xué)信號(hào).重復(fù)序列的RCA產(chǎn)物可以結(jié)合更多的檢測(cè)標(biāo)記物,從而提高響應(yīng)性能.Yang等[40]設(shè)計(jì)了基于金納米粒子(AuNPs)和RCA的太赫茲超材料生物傳感器,通過(guò)RCA過(guò)程擴(kuò)增了金黃色葡萄球菌的DNA片段,并產(chǎn)生了大量的長(zhǎng)單鏈DNA分子;然后這些分子與AuNPs結(jié)合形成復(fù)合物,使樣品的折射率異常增加,從而相應(yīng)提高了超材料的太赫茲響應(yīng).此方法具有操作簡(jiǎn)單快速的特點(diǎn),特別適用于醫(yī)院大量樣本的快速檢測(cè)[圖2(B)].
SDR技術(shù)是通過(guò)設(shè)計(jì)包含黏性末端的特異性序列,使目標(biāo)鏈可以結(jié)合并啟動(dòng)分支的單鏈DNA片段,最終產(chǎn)生有標(biāo)記的產(chǎn)物用于信號(hào)檢測(cè).DNA鏈置換反應(yīng)的原理是核酸堿基對(duì)通過(guò)氫鍵的雜交和雜交誘導(dǎo)的熱動(dòng)力學(xué)驅(qū)動(dòng),主要是焓驅(qū)動(dòng)[41].Lu等[42]將微芯片電泳(MCE)與等溫鏈置換聚合酶反應(yīng)整合在一起(ISDPR)用于檢測(cè)耐甲氧西林菌株有關(guān)的mecA基因.Cai等[43]基于精細(xì)設(shè)計(jì)的功能嵌合序列及分子信標(biāo),并結(jié)合鏈置換反應(yīng)的回收靶標(biāo)策略,建立了金黃色葡萄球菌的熒光檢測(cè)方法,帶有分子信標(biāo)的雙鏈在核酸內(nèi)切酶和聚合酶的作用下可以從嵌合體中置換出金黃色葡萄球菌,釋放的金黃色葡萄球菌與溶液中游離的嵌合體結(jié)合而進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)[圖2(C)].
CHA是一種催化發(fā)夾組裝的無(wú)酶信號(hào)擴(kuò)增方法,典型的CHA反應(yīng)是由單鏈分析物引發(fā)的,基底發(fā)夾被連續(xù)打開(kāi),產(chǎn)生熱力學(xué)穩(wěn)定的雙鏈物,主要是通過(guò)DNA雜交(自組裝和分離)而不是連鎖反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的[44].CHA循環(huán)擴(kuò)增方法檢測(cè)細(xì)菌時(shí)常與其它擴(kuò)增策略相結(jié)合.Tao等[45]基于附著在表面的DNA walker和催化劑觸發(fā)的催化發(fā)夾組裝(CHA)實(shí)現(xiàn)了乙型肝炎病毒(HBV)的高靈敏檢測(cè).Ning等[46]利用納米顆粒作為電化學(xué)探針,并基于CHA信號(hào)擴(kuò)增策略去檢測(cè)金黃色葡萄球菌中三磷酸腺苷(ATP)的電化學(xué)信號(hào),從而達(dá)到定量檢測(cè)金黃色葡萄球菌的目的.
Fig.2 Detection of bacteria based on nucleic acid base pairing recognition methods
環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)是一種在等溫(60~65℃)條件下使用具有鏈位移特性的聚合酶進(jìn)行核酸擴(kuò)增的方法,利用一套專門設(shè)計(jì)的引物識(shí)別目標(biāo)核酸不同的序列,生成擴(kuò)增產(chǎn)物,是一種無(wú)需重復(fù)熱變性循環(huán)的方法[47].Huang等[48]研制了一種新型的實(shí)時(shí)電化學(xué)LAMP裝置,用于檢測(cè)食品中大腸桿菌中vt基因和沙門氏菌invA基因.探針MB嵌插入雙鏈DNA中,并通過(guò)電化學(xué)裝置進(jìn)行信號(hào)監(jiān)測(cè),若MB處于自由狀態(tài),則氧化還原電流相對(duì)較強(qiáng).然而,當(dāng)MB被插入DNA雙鏈中時(shí),MB氧化還原信號(hào)顯著降低[圖2(D)].Sharif等[49]通過(guò)LAMP對(duì)食源性致病菌DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增,并利用結(jié)合微流控系統(tǒng)和磁分離技術(shù)的阻抗傳感器檢測(cè)擴(kuò)增片段.LAMP過(guò)程比普通的堿基互補(bǔ)配對(duì)反應(yīng)具有更高的特異性,從而有利于對(duì)突變堿基的檢測(cè).Nanayakkara等[50]通過(guò)釋放-淬滅型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(DARQ LAMP)方法同時(shí)檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的3個(gè)不同基因.Takarada等[51]利用LAMP結(jié)合色譜的方法鑒別耐利福平結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥區(qū)的4個(gè)突變體,可用于醫(yī)院快速檢測(cè)耐藥結(jié)核分枝桿菌.
另外,酶輔助擴(kuò)增的方式是近年來(lái)核酸分子識(shí)別過(guò)程中一種重要的信號(hào)放大策略,應(yīng)用較多的主要有DNA酶和基因編輯酶[52,53].DNA酶(DNAzyme)是一類功能核酸,又稱為脫氧核酶,對(duì)其底物具有輔因子依賴性的催化活性,可以對(duì)目標(biāo)DNA或RNA進(jìn)行特異性地切割[54~56].Ali等[57]基于DNA酶比色法檢測(cè)幽門螺旋桿菌,在該研究中DNA酶通過(guò)鏈霉親和素-生物素相互作用固定在瓊脂糖珠上,同時(shí)將脲酶接在DNA酶的另一端.當(dāng)幽門螺桿菌存在時(shí),DNA酶發(fā)生切割反應(yīng)將脲酶釋放出來(lái),當(dāng)加入含有尿素和酚紅的溶液時(shí),脲酶催化尿素水解產(chǎn)生氨,使溶液的顏色由黃色變?yōu)榧t色.為了提高檢測(cè)體系的便攜性,Ali等[58]還利用DNA酶研制了一種熒光紙基傳感器,可以快速、靈敏地檢測(cè)肺炎克雷伯菌.G-四聯(lián)體是由4個(gè)鳥(niǎo)嘌呤(G)組成的平面,通過(guò)Hoogsteen氫鍵連接疊加而形成的二級(jí)DNA結(jié)構(gòu),在配體存在時(shí)具有一定的催化活性.Shang等[59]通過(guò)血紅素/G-四聯(lián)體DNA酶觸發(fā)反應(yīng),以魯米諾/H2O2的化學(xué)發(fā)光體系作為檢測(cè)信號(hào),實(shí)現(xiàn)了對(duì)牛奶樣品中李斯特氏菌DNA的檢測(cè).磁珠可以有效提高DNAzyme的負(fù)載量,并且通過(guò)磁分離降低背景干擾,有利于提高檢測(cè)靈敏度.Lee等[60]基于G-四聯(lián)體相關(guān)的催化反應(yīng)建立了一種比色分析方法,用于快速、靈敏和方便地檢測(cè)副溶血弧菌.若分子信標(biāo)的互補(bǔ)序列插入副溶血性弧菌LDH基因擴(kuò)增的LAMP產(chǎn)物中,使其不能折疊成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu),不能催化APTS和H2O2發(fā)生氧化反應(yīng),則不顯色;若LAMP產(chǎn)物沒(méi)有嵌入目標(biāo)基因,分子信標(biāo)則折疊成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu),在hemin存在下發(fā)生催化反應(yīng)而顯色.Zheng等[61]將DNAzyme和乙酰膽堿酯酶(AChE)修飾在磁性納米顆粒上作為識(shí)別單元,以大腸桿菌核酸為目標(biāo)分子,DNAzyme識(shí)別目標(biāo)DNA后產(chǎn)生切割作用釋放AChE,再利用AChE對(duì)納米銀簇的熒光增強(qiáng)作用實(shí)現(xiàn)檢測(cè).Mondal等[62]利用DNA酶生物傳感器策略,并通過(guò)免疫磁珠分離技術(shù)從食品和臨床樣品中快速簡(jiǎn)便地檢測(cè)金黃色葡萄球菌的腸毒素B.
基因編輯系統(tǒng)可以在RNA引導(dǎo)下捕獲部分外來(lái)基因組并將其插入CRISPR位點(diǎn)[63],其中幾種典型的基因編輯酶(如Cas12a和Cas13a)在細(xì)菌檢測(cè)領(lǐng)域展現(xiàn)了良好的性能[64~66].Wang等[67]建立了多重PCR與CRISPR-Cas12a芯片集成的快速檢測(cè)平臺(tái),用于檢測(cè)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌.Peng等[68]利用CRISPR-Cas12a系統(tǒng)結(jié)合基本的邏輯門對(duì)致病性細(xì)菌基因進(jìn)行了檢測(cè),首先提取基因組DNA(gDNA),并利用PCR擴(kuò)增出標(biāo)記基因產(chǎn)物,之后PCR產(chǎn)物在crRNA的幫助下很容易被Cas12a識(shí)別,從而觸發(fā)預(yù)先添加的雙標(biāo)記的單鏈report-DNA的反式剪切,report-DNA的斷裂導(dǎo)致FAM遠(yuǎn)離猝滅基團(tuán),產(chǎn)生了更強(qiáng)的熒光,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)致病菌DNA的檢測(cè).Wang等[69]開(kāi)發(fā)了一種基于重組聚合酶等溫?cái)U(kuò)增方法的Cas12a/crRNA工具用于檢測(cè)大腸桿菌和金黃色鏈球菌,由于成本低且用時(shí)短,可以應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè).Zhou等[70]利用CRISPR-Cas13a系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)去檢測(cè)食品中的金黃色葡萄球菌,檢出限為1 CFU/mL.
核酸適體是一種單鏈寡核苷酸,可與靶標(biāo)分子之間形成分子形狀互補(bǔ),或通過(guò)氫鍵、靜電、堿基對(duì)堆積、偶極-偶極相互作用、疏水作用和π?π堆積等作用產(chǎn)生空間折疊,從而形成特定的二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu),實(shí)現(xiàn)高特異性、高穩(wěn)定性的結(jié)合[71~73].核酸適體可與細(xì)菌的多種成分特異性結(jié)合,如整個(gè)菌體、多糖、蛋白質(zhì)、毒素,甚至由細(xì)菌產(chǎn)生的孢子等,核酸適體傳感器也被大量應(yīng)用于細(xì)菌檢測(cè)中[74~77].
Cai等[78]利用適體捕獲金黃色葡萄球菌,再通過(guò)SDR過(guò)程進(jìn)行信號(hào)擴(kuò)增,最終產(chǎn)生增強(qiáng)的電化學(xué)信號(hào),實(shí)現(xiàn)了對(duì)金黃色葡萄球菌的高靈敏、特異性檢測(cè).Wu等[79]篩選出一種可以與幽門螺旋桿菌特異性結(jié)合的核酸適體,并利用此適體構(gòu)建了一種在手持式激發(fā)光照射下可以肉眼檢測(cè)幽門螺旋桿菌的傳感方法,檢測(cè)用時(shí)短至5 min.Pla等[80]開(kāi)發(fā)了一種基于核酸適體門控納米材料用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌.在該研究中,納米多孔陽(yáng)極氧化鋁(NAA)模板內(nèi)裝載有羅丹明B染料,并用核酸適體將孔封住.當(dāng)金黃色葡萄球菌存在時(shí),可以與表面的核酸適體特異性結(jié)合,打開(kāi)孔洞,裝載的熒光染料釋放到培養(yǎng)基中產(chǎn)生相應(yīng)的信號(hào),由于檢測(cè)時(shí)間短,在臨床上具有很好的應(yīng)用價(jià)值.Bayra?等[81]篩選了對(duì)腸炎鏈球菌具有高親和力和特異性的核酸適體,并開(kāi)發(fā)了一種比色檢測(cè)傳感器.Xu等[82]構(gòu)建了一種適體與探針結(jié)合的傳感策略,當(dāng)核酸適體與金黃色葡萄球菌結(jié)合后釋放出探針,引發(fā)剪切酶擴(kuò)增反應(yīng)和RCA,實(shí)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的超靈敏、特異性檢測(cè).
Fig.3 Molecular recognition for bacteria detection based on aptamer binding
Li等[83]設(shè)計(jì)了一種基于酶介導(dǎo)的結(jié)合DNA walker和CHA反應(yīng)來(lái)檢測(cè)大腸桿菌及沙門氏菌中的DNA的傳感器.通過(guò)適體(Apt)與目標(biāo)細(xì)菌結(jié)合釋放互補(bǔ)序列(c-Apt),釋放的c-Apt觸發(fā)DNA walker反應(yīng)并通過(guò)堿基配對(duì)及酶催化作用產(chǎn)生裂解片段(Ef)與H1雜交,發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi),暴露出H1的活性ssDNA區(qū)域;然后發(fā)夾H2與活性ssDNA區(qū)域雜交,形成H1@H2@Ef配合物.隨著鏈置換反應(yīng)的進(jìn)行,該配合物分解成H1@H2二聚體,能夠與標(biāo)記熒光猝滅基團(tuán)DNA鏈雜交,導(dǎo)致熒光探針鏈與標(biāo)記猝滅基團(tuán)的互補(bǔ)鏈分離,產(chǎn)生熒光信號(hào).Jiang等[84]開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)單而靈敏的基于熒光強(qiáng)度的微流控檢測(cè)平臺(tái),將聚合物樹(shù)突狀分子固定在PDMS微通道上,進(jìn)一步用DNA適體修飾PDMS微通道,用于檢測(cè)大腸桿菌;并采用RCA對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行增強(qiáng),從而提高了檢測(cè)性能.Li等[85]將核酸適體識(shí)別、HCR擴(kuò)增手段和可視化微流控芯片結(jié)合用于定量測(cè)定大腸桿菌的濃度[圖3(A)].首先通過(guò)大腸桿菌競(jìng)爭(zhēng)性與適體結(jié)合后被釋放,裸露出單鏈引物,可以引發(fā)HCR反應(yīng),由于加入的發(fā)卡H1和H2連接的Pt納米顆??梢源呋疕2O2轉(zhuǎn)化為O2,從而將大腸桿菌濃度轉(zhuǎn)化為微流控通道中墨水的可見(jiàn)位移,實(shí)現(xiàn)快速、可視化的檢測(cè).Jiang等[86]制備了一種基于螺紋的微流控電化學(xué)適體傳感器,采用無(wú)標(biāo)記適體免疫傳感技術(shù)對(duì)副溶血弧菌進(jìn)行快速檢測(cè).該方法通過(guò)螺紋來(lái)制作微通道以及用于電化學(xué)測(cè)量的電極,并將適體功能化的MoS2納米片固定在線狀電極上進(jìn)行選擇性傳感[圖3(B)].Liu等[87]提出了一種適體識(shí)別的可視化方法用于檢測(cè)食源性細(xì)菌阪崎腸桿菌.通過(guò)預(yù)先設(shè)計(jì)的模擬過(guò)氧化物酶活性的DNAzyme探針的2個(gè)分裂的互補(bǔ)序列與阪崎腸桿菌的適體完全雜交,形成G-四聯(lián)體構(gòu)象,該結(jié)構(gòu)可在hemin存在下發(fā)生催化反應(yīng)顯色.當(dāng)存在阪崎腸桿菌時(shí),其可與適體結(jié)合,使得G-四聯(lián)體發(fā)生解離,并失去模擬過(guò)氧化物酶的催化活性,從而不顯色.Zhang等[88]構(gòu)建了一種與發(fā)光染料相結(jié)合的RNA適體介導(dǎo)的CRISPRCas13a檢測(cè)方法用于檢測(cè)食品中活的蠟樣芽孢桿菌.在活細(xì)菌體內(nèi)存在的目標(biāo)RNA可以與CRISPRCas13a的位點(diǎn)進(jìn)行特異性結(jié)合激活催化位點(diǎn),切割RNA適體從而釋放出發(fā)光染料,此方法有望用于活的病原體的定點(diǎn)檢測(cè)和生物安全控制.核酸適體具有高度的特異性,在細(xì)菌檢測(cè)領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景,但仍然有一些亟待解決的問(wèn)題限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用,例如適體結(jié)合的穩(wěn)定性有較大差異,部分適體無(wú)法與目標(biāo)蛋白進(jìn)行牢固的結(jié)合;適體的生物穩(wěn)定性不足,在進(jìn)行檢測(cè)的過(guò)程中容易被降解;適體識(shí)別容易受到溫度等環(huán)境因素的干擾等.
基于分子識(shí)別的細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)在醫(yī)療、食品衛(wèi)生及環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景,但對(duì)于滿足實(shí)際應(yīng)用需求仍具有一定的挑戰(zhàn):(1)高靈敏的識(shí)別檢測(cè)策略往往更容易受到樣品背景的干擾,從而難以應(yīng)用于生理樣本的分析中;(2)當(dāng)前臨床檢測(cè)需求量較大的一些重要病原微生物均已經(jīng)有大量的突變體,而且多為點(diǎn)基因突變,這類突變體會(huì)產(chǎn)生對(duì)常規(guī)藥物的耐藥性,現(xiàn)在的細(xì)菌識(shí)別檢測(cè)中對(duì)突變體尤其是點(diǎn)基因突變體的識(shí)別效果很難滿足臨床需求;(3)現(xiàn)有的識(shí)別傳感策略通常更關(guān)注在從核酸濃度到信號(hào)的轉(zhuǎn)化,缺乏從信號(hào)到細(xì)菌層次的關(guān)聯(lián)性,更缺乏從信號(hào)到病理病程的研究,這也限制了多種新型技術(shù)在臨床醫(yī)療中的應(yīng)用;(4)各類識(shí)別模式的開(kāi)發(fā)和優(yōu)化過(guò)程中較少考慮經(jīng)濟(jì)性,但面向細(xì)菌的識(shí)別檢測(cè)是基于實(shí)際需求的,在未來(lái)的研究中應(yīng)更多考慮經(jīng)濟(jì)性和實(shí)用性問(wèn)題.總之,如何實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的特異性識(shí)別和高靈敏檢測(cè)是醫(yī)療健康和公共衛(wèi)生領(lǐng)域的一個(gè)核心問(wèn)題,開(kāi)發(fā)面向復(fù)雜背景樣本、面向細(xì)菌突變體、面向醫(yī)療衛(wèi)生實(shí)際應(yīng)用、面向日常家用場(chǎng)景的細(xì)菌識(shí)別新方法迫在眉睫.