基于分子識別的細菌檢測研究進展

張曉榮，陳嵐嵐，胡善文

（1.福建醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生檢驗與檢疫學系,福州350122；2.福州大學化學學院,福州350108）

細菌是一類廣泛存在于自然環(huán)境中的個體微小、肉眼難以辨別、必須借助顯微鏡觀察的原核生物，其結(jié)構(gòu)簡單，多以二分裂方式進行繁殖［1，2］.細菌在與人體的共生中發(fā)揮著促進營養(yǎng)和代謝、增強屏障功能、抑制病原體和調(diào)節(jié)免疫等重要作用，在維持腸道穩(wěn)態(tài)和預防炎癥方面也起著至關重要的作用［2~4］.然而，生活中致病菌的存在對公眾健康和安全造成了嚴重威脅，尤其是目前致病菌變異且出現(xiàn)耐藥性，給細菌的檢測和治療增加了難度［5~7］.由細菌引起的傳染病如鼠疫、霍亂和肺結(jié)核等對經(jīng)濟社會發(fā)展造成了極大影響.隨著對細菌群落研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)身體中細菌失調(diào)會導致不同的疾病，如腸道菌群的改變會引起免疫相關炎癥以及心理和行為的障礙［8］、口腔菌群的變化會導致牙周炎、齲齒以及糖尿病和癌癥等疾?。?］.已有證據(jù)顯示，由某些細菌或真菌引起的感染是導致癌癥發(fā)展的危險因素［10］.因此，檢測細菌的種類及其數(shù)量變化情況對于公共衛(wèi)生和醫(yī)療健康具有重要作用.

自然界中細菌的種類龐大、數(shù)量眾多，使得檢測結(jié)果的特異性不高.另外，細菌在環(huán)境或生理樣本中總是以極低的濃度存在，而且檢測過程常常受到背景干擾，準確檢測細菌的含量面臨著極大挑戰(zhàn)［11］.傳統(tǒng)的細菌檢測方法基于培養(yǎng)分離、顯微鏡檢查和生化鑒定，通常需要較長的時間（幾天甚至幾周），而且檢測過程中需要經(jīng)驗判定，給檢測結(jié)果帶來不確定性［12，13］.近幾年利用分子識別模式檢測和鑒定細菌的方法備受關注.分子識別是利用細菌體內(nèi)或表面的相關分子（如核酸分子和膜蛋白等），通過生物大分子來完成對目標細菌的特異性識別，并利用信號放大等方式實現(xiàn)高靈敏檢測.本文根據(jù)分子識別模式的差異，分別從免疫識別、核酸分子探針識別和核酸適體識別3個方面綜述了近年來細菌檢測的最新進展（Scheme 1），分析了不同識別模式的優(yōu)勢和不足，并展望了細菌檢測識別方式的發(fā)展前景.

Scheme 1 Molecular recognition methods of bacte?ria based on immune,aptamer and nu?cleic acid probe

1 分子識別與細菌檢測

1.1 基于抗體?抗原免疫識別的細菌檢測

免疫識別是通過抗原-抗體特異性結(jié)合而達到檢測目的方式.最常用的免疫識別方法是酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），根據(jù)試劑來源和具體檢測條件的不同，ELISA又可以分為直接法、間接法、雙抗體比色夾心法和競爭法等類型.直接法是通過固定抗原再加入抗體形成抗原-抗體復合物，再加入底物后進行顯色.間接法則是將抗原聯(lián)結(jié)到固相載體上，分別加入待測抗體和酶標記抗體來實現(xiàn)對待測抗體的檢測.常規(guī)的雙抗體比色夾心酶聯(lián)免疫吸附實驗原理是抗原被附著在微孔板上的特異性抗體捕獲，形成抗原-抗體復合物；然后加入酶偶聯(lián)抗體，形成抗體-抗原-抗體“三明治”結(jié)構(gòu)，清洗后，加入酶促反應的底物，通過顏色變化等方式推斷目標分子濃度［14~16］.競爭法是將特異性抗原固定在載體上，待測抗體與固相抗體進行競爭結(jié)合，通過結(jié)合固相抗體量與待測抗體量成反比來完成定量檢測.酶聯(lián)免疫吸附方法具有簡便、易于操作以及可視化等特點，被認為是臨床診斷、食品安全和環(huán)境監(jiān)測等應用的金標準方法.在微生物鑒定方面，也常采用血清凝集實驗對細菌進行定性檢測.由于細菌表面含有可供識別的菌體O及鞭毛H等不同類型的抗原，當?shù)渭右阎贵w時，在數(shù)分鐘內(nèi)可出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象，并根據(jù)有無凝集判斷細菌的種類.該方法可直接對細菌進行檢測，但無法定量檢測細菌的含量.Nouri等［17］設計了一種用于檢測牛奶中金黃色葡萄球菌分泌的腸毒素的ELISA試劑盒，相比于夾心ELISA、電泳法和高效液相色譜法等，該方法能夠更快、更加準確地測定金黃色葡萄球菌的含量.

Fig.1 Molecular recognition methods of bacteria based on immune

近年來，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，抗體-抗原分子識別與納米材料相結(jié)合為細菌的高靈敏、高特異性檢測提供了新方法［18］.一方面，納米材料可以有效提高免疫識別分子的負載量，從而提高識別效率.如，Zhang等［19］利用磁珠修飾犬IgG抗體，特異性捕獲金黃色葡萄球菌，與辣根過氧化物酶標記的雞IgY抗體形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)了金黃色葡萄球菌的含量檢測，此方法具有一定的商業(yè)應用潛力.Bonnet等［20］用抗體修飾的磁珠從血小板濃縮物樣本中特異性捕捉大腸桿菌，并通過亞甲基藍標記的DNA雙鏈組裝在納米顆粒上，利用亞甲基藍的電化學信號對大腸桿菌進行了檢測.另一方面，種類豐富的納米材料為提高檢測方法的靈敏度提供了豐富的選擇.如圖1（A）所示，Ye等［21］通過抗體修飾的磁珠捕捉大腸桿菌，再加入金鉑雙金屬功能化二氧化硅納米顆粒，其表面結(jié)合抗大腸桿菌的抗體和轉(zhuǎn)化酶，與捕獲的大腸桿菌結(jié)合后催化底物發(fā)生反應引起電信號變化，通過納米材料的多重使用提高了方法的靈敏度，實現(xiàn)了大腸桿菌的定量檢測.

對細菌的現(xiàn)場快速檢測在食品安全、環(huán)境監(jiān)測及衛(wèi)生檢疫等領域具有重要意義.免疫層析試紙檢測方法是指在紙或濾膜等便攜式基底上構(gòu)建免疫識別傳感界面，從而實現(xiàn)對目標分子的現(xiàn)場快速檢測.Vyas等［22］建立了一種熒光膠束二氧化硅納米免疫層析試紙，能夠在受感染奶牛的牛奶樣本中特異性檢測布魯氏菌IgG抗體，可以僅用幾微升樣品檢測牛乳中的布魯氏菌抗體［圖1（B）］.Pang等［23］開發(fā)了新型紙基酶聯(lián)免疫吸附試紙（Paper-ELISA）用于檢測大腸桿菌.Zhao等［24］使用蠟在紙上圖案化構(gòu)建功能區(qū)，通過修飾辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體來識別大腸桿菌，檢測過程用時低于3 h，可檢測微升級別的樣品量，并且對大腸桿菌的檢出限達到104CFU/mL，比傳統(tǒng)ELISA更靈敏［圖1（C）］.

1.2 基于核酸堿基互補配對識別的細菌檢測

核酸探針識別是一種高特異性、高效率的識別方式，通過核酸雜交過程完成分子識別，即核酸探針分子與其互補鏈（目標鏈）的堿基互補配對作用［25，26］.由于核酸結(jié)構(gòu)本身不具有易于檢測的特性，核酸探針識別方法通常利用識別前后的構(gòu)象差異，結(jié)合相應的標記分子，將目標分子的濃度信息轉(zhuǎn)化為電化學、熒光或拉曼等可檢測的信號［27］.Xu等［28］將石墨烯/殼聚糖復合納米材料覆蓋在玻碳電極（GCE）上，結(jié)合靜電吸附與共價鍵合的雙重作用力固定大腸桿菌探針序列，目標序列可與探針特異性結(jié)合，使得探針上標記的亞甲基藍（MB）的信號發(fā)生變化，通過電化學信號定量大腸桿菌的核酸濃度.為了實現(xiàn)多目標物檢測，Melaine等［29］建立了一種可同時檢測嗜肺軍團菌、銅綠假單胞菌和鼠傷寒沙門氏菌的16S rRNA的傳感方法，利用DNA探針產(chǎn)生金納米顆粒增強表面等離子共振信號進行成像檢測.因為表面增強拉曼基底與拉曼信號分子之間的表面等離子共振效應強度與距離高度相關，所以這種距離變化型傳感策略與表面增強拉曼散射光譜法（SERS）可以更好地結(jié)合.如，Hwang等［30］將帶有雙信號標記的捕獲探針修飾在磁微粒上，當存在目標鏈時，探針與其結(jié)合，釋放出拉曼標記的探針，通過SERS信號的大小對細菌的濃度進行定量，可同時檢測大腸桿菌、糞腸球菌和金黃色葡萄球菌的目標DNA序列.Lu等［31］將單鏈DNA探針組裝在Fe3O4@SiO2-Au材料上組成SERS傳感器來識別抗生素耐藥基因tetA基因的單鏈DNA序列，并根據(jù)SERS信號確定細菌耐藥基因的含量.

由于實際樣品中細菌的目標核酸鏈的濃度極低，核酸探針直接識別方法的靈敏度往往無法滿足需求，可利用核酸循環(huán)策略進行信號放大，如雜交鏈式反應（HCR）、滾環(huán)擴增（RCA）、鏈置換反應（SDR）、催化發(fā)夾組裝法（CHA）和環(huán)介導擴增（LAMP）等，以有效提高核酸探針識別的靈敏度，從而更好地應用于食品、環(huán)境或生理樣品的細菌檢測中［32］.

HCR反應是將2個部分互補的單鏈DNA設計為長莖短環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)（H1和H2），目標DNA鏈不存在時2個DNA發(fā)夾的混合物是穩(wěn)定的；而目標單鏈DNA存在時可以打破長莖保護環(huán)的能量平衡，觸發(fā)交替雜交鏈式反應，生成雙鏈DNA產(chǎn)物，通過累積修飾在發(fā)卡DNA上的標記分子實現(xiàn)信號放大［33］.Lv等［34］發(fā)展了一種基于金納米顆粒結(jié)合HCR循環(huán)擴增手段的電化學夾心法用于檢測幽門螺旋桿菌DNA.Liang等［35］基于大腸桿菌特定的fliCh7基因進行PCR擴增獲得單鏈DNA，再通過設計發(fā)夾探針H1/H2對單鏈DNA序列進行HCR擴增.該方法對信號進行了2次擴增，檢測結(jié)果優(yōu)于傳統(tǒng)單一方式的擴增.Tang等［36］將HCR反應與氧化石墨烯（GO）材料結(jié)合，開發(fā)了一種簡便的無酶信號放大策略，用于敏感檢測金黃色葡萄球菌16sRNA［圖2（A）］.他們設計了2個用熒光團6-羧基熒光素（FAM）標記的發(fā)夾探針（HP1和HP2）.HP1和HP2不僅可以觸發(fā)HCR，還可以與靶標形成長切口的雙鏈DNA.在無靶標情況下，游離的FAM標記的HP1和HP2被GO吸附，熒光信號被猝滅.當存在靶標時，靶標打開HP1，開環(huán)的HP1可以打開HP2，而開環(huán)的HP2又可以再次打開1個新的HP1，于是HCR被觸發(fā)，生成雙鏈DNA復合物，使得熒光信號可以通過FAM和雙鏈DNA染料SYBR Green I的協(xié)同作用而被放大.

RCA是一種等溫酶促過程，使用環(huán)形DNA模板和特殊的DNA或RNA聚合酶將短DNA或RNA引物擴增形成長單鏈DNA或RNA產(chǎn)物，通常是包含數(shù)十至數(shù)百個與環(huán)狀模板互補的串聯(lián)重復序列的多聯(lián)體［37，38］.Li等［39］提出了一種基于3D DNA行走，RCA和HCR多重擴增策略的超靈敏生物傳感器，實現(xiàn)了對大腸桿菌的超靈敏定量檢測.該方法首先從大腸桿菌中提取目的基因序列，采用DNA行走的方式對其進行第一次擴增，然后再分別通過RCA和HCR反應進行第二、第三次擴增，產(chǎn)生長的DNA雙鏈，接著將電化學標記物嵌插入DNA雙鏈產(chǎn)物中，產(chǎn)生增強的電化學信號.重復序列的RCA產(chǎn)物可以結(jié)合更多的檢測標記物，從而提高響應性能.Yang等［40］設計了基于金納米粒子（AuNPs）和RCA的太赫茲超材料生物傳感器，通過RCA過程擴增了金黃色葡萄球菌的DNA片段，并產(chǎn)生了大量的長單鏈DNA分子；然后這些分子與AuNPs結(jié)合形成復合物，使樣品的折射率異常增加，從而相應提高了超材料的太赫茲響應.此方法具有操作簡單快速的特點，特別適用于醫(yī)院大量樣本的快速檢測［圖2（B）］.

SDR技術(shù)是通過設計包含黏性末端的特異性序列，使目標鏈可以結(jié)合并啟動分支的單鏈DNA片段，最終產(chǎn)生有標記的產(chǎn)物用于信號檢測.DNA鏈置換反應的原理是核酸堿基對通過氫鍵的雜交和雜交誘導的熱動力學驅(qū)動，主要是焓驅(qū)動［41］.Lu等［42］將微芯片電泳（MCE）與等溫鏈置換聚合酶反應整合在一起（ISDPR）用于檢測耐甲氧西林菌株有關的mecA基因.Cai等［43］基于精細設計的功能嵌合序列及分子信標，并結(jié)合鏈置換反應的回收靶標策略，建立了金黃色葡萄球菌的熒光檢測方法，帶有分子信標的雙鏈在核酸內(nèi)切酶和聚合酶的作用下可以從嵌合體中置換出金黃色葡萄球菌，釋放的金黃色葡萄球菌與溶液中游離的嵌合體結(jié)合而進入下一個循環(huán)［圖2（C）］.

CHA是一種催化發(fā)夾組裝的無酶信號擴增方法，典型的CHA反應是由單鏈分析物引發(fā)的，基底發(fā)夾被連續(xù)打開，產(chǎn)生熱力學穩(wěn)定的雙鏈物，主要是通過DNA雜交（自組裝和分離）而不是連鎖反應來實現(xiàn)的［44］.CHA循環(huán)擴增方法檢測細菌時常與其它擴增策略相結(jié)合.Tao等［45］基于附著在表面的DNA walker和催化劑觸發(fā)的催化發(fā)夾組裝（CHA）實現(xiàn)了乙型肝炎病毒（HBV）的高靈敏檢測.Ning等［46］利用納米顆粒作為電化學探針，并基于CHA信號擴增策略去檢測金黃色葡萄球菌中三磷酸腺苷（ATP）的電化學信號，從而達到定量檢測金黃色葡萄球菌的目的.

Fig.2 Detection of bacteria based on nucleic acid base pairing recognition methods

環(huán)介導等溫擴增（LAMP）是一種在等溫（60~65℃）條件下使用具有鏈位移特性的聚合酶進行核酸擴增的方法，利用一套專門設計的引物識別目標核酸不同的序列，生成擴增產(chǎn)物，是一種無需重復熱變性循環(huán)的方法［47］.Huang等［48］研制了一種新型的實時電化學LAMP裝置，用于檢測食品中大腸桿菌中vt基因和沙門氏菌invA基因.探針MB嵌插入雙鏈DNA中，并通過電化學裝置進行信號監(jiān)測，若MB處于自由狀態(tài)，則氧化還原電流相對較強.然而，當MB被插入DNA雙鏈中時，MB氧化還原信號顯著降低［圖2（D）］.Sharif等［49］通過LAMP對食源性致病菌DNA片段進行擴增，并利用結(jié)合微流控系統(tǒng)和磁分離技術(shù)的阻抗傳感器檢測擴增片段.LAMP過程比普通的堿基互補配對反應具有更高的特異性，從而有利于對突變堿基的檢測.Nanayakkara等［50］通過釋放-淬滅型環(huán)介導等溫擴增（DARQ LAMP）方法同時檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的3個不同基因.Takarada等［51］利用LAMP結(jié)合色譜的方法鑒別耐利福平結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥區(qū)的4個突變體，可用于醫(yī)院快速檢測耐藥結(jié)核分枝桿菌.

另外，酶輔助擴增的方式是近年來核酸分子識別過程中一種重要的信號放大策略，應用較多的主要有DNA酶和基因編輯酶［52，53］.DNA酶（DNAzyme）是一類功能核酸，又稱為脫氧核酶，對其底物具有輔因子依賴性的催化活性，可以對目標DNA或RNA進行特異性地切割［54~56］.Ali等［57］基于DNA酶比色法檢測幽門螺旋桿菌，在該研究中DNA酶通過鏈霉親和素-生物素相互作用固定在瓊脂糖珠上，同時將脲酶接在DNA酶的另一端.當幽門螺桿菌存在時，DNA酶發(fā)生切割反應將脲酶釋放出來，當加入含有尿素和酚紅的溶液時，脲酶催化尿素水解產(chǎn)生氨，使溶液的顏色由黃色變?yōu)榧t色.為了提高檢測體系的便攜性，Ali等［58］還利用DNA酶研制了一種熒光紙基傳感器，可以快速、靈敏地檢測肺炎克雷伯菌.G-四聯(lián)體是由4個鳥嘌呤（G）組成的平面，通過Hoogsteen氫鍵連接疊加而形成的二級DNA結(jié)構(gòu)，在配體存在時具有一定的催化活性.Shang等［59］通過血紅素/G-四聯(lián)體DNA酶觸發(fā)反應，以魯米諾/H2O2的化學發(fā)光體系作為檢測信號，實現(xiàn)了對牛奶樣品中李斯特氏菌DNA的檢測.磁珠可以有效提高DNAzyme的負載量，并且通過磁分離降低背景干擾，有利于提高檢測靈敏度.Lee等［60］基于G-四聯(lián)體相關的催化反應建立了一種比色分析方法，用于快速、靈敏和方便地檢測副溶血弧菌.若分子信標的互補序列插入副溶血性弧菌LDH基因擴增的LAMP產(chǎn)物中，使其不能折疊成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，不能催化APTS和H2O2發(fā)生氧化反應，則不顯色；若LAMP產(chǎn)物沒有嵌入目標基因，分子信標則折疊成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，在hemin存在下發(fā)生催化反應而顯色.Zheng等［61］將DNAzyme和乙酰膽堿酯酶（AChE）修飾在磁性納米顆粒上作為識別單元，以大腸桿菌核酸為目標分子，DNAzyme識別目標DNA后產(chǎn)生切割作用釋放AChE，再利用AChE對納米銀簇的熒光增強作用實現(xiàn)檢測.Mondal等［62］利用DNA酶生物傳感器策略，并通過免疫磁珠分離技術(shù)從食品和臨床樣品中快速簡便地檢測金黃色葡萄球菌的腸毒素B.

基因編輯系統(tǒng)可以在RNA引導下捕獲部分外來基因組并將其插入CRISPR位點［63］，其中幾種典型的基因編輯酶（如Cas12a和Cas13a）在細菌檢測領域展現(xiàn)了良好的性能［64~66］.Wang等［67］建立了多重PCR與CRISPR-Cas12a芯片集成的快速檢測平臺，用于檢測多重耐藥鮑曼不動桿菌.Peng等［68］利用CRISPR-Cas12a系統(tǒng)結(jié)合基本的邏輯門對致病性細菌基因進行了檢測，首先提取基因組DNA（gDNA），并利用PCR擴增出標記基因產(chǎn)物，之后PCR產(chǎn)物在crRNA的幫助下很容易被Cas12a識別，從而觸發(fā)預先添加的雙標記的單鏈report-DNA的反式剪切，report-DNA的斷裂導致FAM遠離猝滅基團，產(chǎn)生了更強的熒光，從而實現(xiàn)對致病菌DNA的檢測.Wang等［69］開發(fā)了一種基于重組聚合酶等溫擴增方法的Cas12a/crRNA工具用于檢測大腸桿菌和金黃色鏈球菌，由于成本低且用時短，可以應用于現(xiàn)場檢測.Zhou等［70］利用CRISPR-Cas13a系統(tǒng)的優(yōu)勢去檢測食品中的金黃色葡萄球菌，檢出限為1 CFU/mL.

1.3 基于核酸適體-配體識別的細菌檢測

核酸適體是一種單鏈寡核苷酸，可與靶標分子之間形成分子形狀互補，或通過氫鍵、靜電、堿基對堆積、偶極-偶極相互作用、疏水作用和π?π堆積等作用產(chǎn)生空間折疊，從而形成特定的二級或三級結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)高特異性、高穩(wěn)定性的結(jié)合［71~73］.核酸適體可與細菌的多種成分特異性結(jié)合，如整個菌體、多糖、蛋白質(zhì)、毒素，甚至由細菌產(chǎn)生的孢子等，核酸適體傳感器也被大量應用于細菌檢測中［74~77］.

Cai等［78］利用適體捕獲金黃色葡萄球菌，再通過SDR過程進行信號擴增，最終產(chǎn)生增強的電化學信號，實現(xiàn)了對金黃色葡萄球菌的高靈敏、特異性檢測.Wu等［79］篩選出一種可以與幽門螺旋桿菌特異性結(jié)合的核酸適體，并利用此適體構(gòu)建了一種在手持式激發(fā)光照射下可以肉眼檢測幽門螺旋桿菌的傳感方法，檢測用時短至5 min.Pla等［80］開發(fā)了一種基于核酸適體門控納米材料用于檢測金黃色葡萄球菌.在該研究中，納米多孔陽極氧化鋁（NAA）模板內(nèi)裝載有羅丹明B染料，并用核酸適體將孔封住.當金黃色葡萄球菌存在時，可以與表面的核酸適體特異性結(jié)合，打開孔洞，裝載的熒光染料釋放到培養(yǎng)基中產(chǎn)生相應的信號，由于檢測時間短，在臨床上具有很好的應用價值.Bayra?等［81］篩選了對腸炎鏈球菌具有高親和力和特異性的核酸適體，并開發(fā)了一種比色檢測傳感器.Xu等［82］構(gòu)建了一種適體與探針結(jié)合的傳感策略，當核酸適體與金黃色葡萄球菌結(jié)合后釋放出探針，引發(fā)剪切酶擴增反應和RCA，實現(xiàn)金黃色葡萄球菌的超靈敏、特異性檢測.

Fig.3 Molecular recognition for bacteria detection based on aptamer binding

Li等［83］設計了一種基于酶介導的結(jié)合DNA walker和CHA反應來檢測大腸桿菌及沙門氏菌中的DNA的傳感器.通過適體（Apt）與目標細菌結(jié)合釋放互補序列（c-Apt），釋放的c-Apt觸發(fā)DNA walker反應并通過堿基配對及酶催化作用產(chǎn)生裂解片段（Ef）與H1雜交，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，暴露出H1的活性ssDNA區(qū)域；然后發(fā)夾H2與活性ssDNA區(qū)域雜交，形成H1@H2@Ef配合物.隨著鏈置換反應的進行，該配合物分解成H1@H2二聚體，能夠與標記熒光猝滅基團DNA鏈雜交，導致熒光探針鏈與標記猝滅基團的互補鏈分離，產(chǎn)生熒光信號.Jiang等［84］開發(fā)了一種簡單而靈敏的基于熒光強度的微流控檢測平臺，將聚合物樹突狀分子固定在PDMS微通道上，進一步用DNA適體修飾PDMS微通道，用于檢測大腸桿菌；并采用RCA對熒光信號進行增強，從而提高了檢測性能.Li等［85］將核酸適體識別、HCR擴增手段和可視化微流控芯片結(jié)合用于定量測定大腸桿菌的濃度［圖3（A）］.首先通過大腸桿菌競爭性與適體結(jié)合后被釋放，裸露出單鏈引物，可以引發(fā)HCR反應，由于加入的發(fā)卡H1和H2連接的Pt納米顆?？梢源呋疕2O2轉(zhuǎn)化為O2，從而將大腸桿菌濃度轉(zhuǎn)化為微流控通道中墨水的可見位移，實現(xiàn)快速、可視化的檢測.Jiang等［86］制備了一種基于螺紋的微流控電化學適體傳感器，采用無標記適體免疫傳感技術(shù)對副溶血弧菌進行快速檢測.該方法通過螺紋來制作微通道以及用于電化學測量的電極，并將適體功能化的MoS2納米片固定在線狀電極上進行選擇性傳感［圖3（B）］.Liu等［87］提出了一種適體識別的可視化方法用于檢測食源性細菌阪崎腸桿菌.通過預先設計的模擬過氧化物酶活性的DNAzyme探針的2個分裂的互補序列與阪崎腸桿菌的適體完全雜交，形成G-四聯(lián)體構(gòu)象，該結(jié)構(gòu)可在hemin存在下發(fā)生催化反應顯色.當存在阪崎腸桿菌時，其可與適體結(jié)合，使得G-四聯(lián)體發(fā)生解離，并失去模擬過氧化物酶的催化活性，從而不顯色.Zhang等［88］構(gòu)建了一種與發(fā)光染料相結(jié)合的RNA適體介導的CRISPRCas13a檢測方法用于檢測食品中活的蠟樣芽孢桿菌.在活細菌體內(nèi)存在的目標RNA可以與CRISPRCas13a的位點進行特異性結(jié)合激活催化位點，切割RNA適體從而釋放出發(fā)光染料，此方法有望用于活的病原體的定點檢測和生物安全控制.核酸適體具有高度的特異性，在細菌檢測領域有廣闊的應用前景，但仍然有一些亟待解決的問題限制了其進一步的應用，例如適體結(jié)合的穩(wěn)定性有較大差異，部分適體無法與目標蛋白進行牢固的結(jié)合；適體的生物穩(wěn)定性不足，在進行檢測的過程中容易被降解；適體識別容易受到溫度等環(huán)境因素的干擾等.

2 總結(jié)與展望

基于分子識別的細菌檢測技術(shù)在醫(yī)療、食品衛(wèi)生及環(huán)境監(jiān)測等領域展現(xiàn)了良好的應用前景，但對于滿足實際應用需求仍具有一定的挑戰(zhàn)：（1）高靈敏的識別檢測策略往往更容易受到樣品背景的干擾，從而難以應用于生理樣本的分析中；（2）當前臨床檢測需求量較大的一些重要病原微生物均已經(jīng)有大量的突變體，而且多為點基因突變，這類突變體會產(chǎn)生對常規(guī)藥物的耐藥性，現(xiàn)在的細菌識別檢測中對突變體尤其是點基因突變體的識別效果很難滿足臨床需求；（3）現(xiàn)有的識別傳感策略通常更關注在從核酸濃度到信號的轉(zhuǎn)化，缺乏從信號到細菌層次的關聯(lián)性，更缺乏從信號到病理病程的研究，這也限制了多種新型技術(shù)在臨床醫(yī)療中的應用；（4）各類識別模式的開發(fā)和優(yōu)化過程中較少考慮經(jīng)濟性，但面向細菌的識別檢測是基于實際需求的，在未來的研究中應更多考慮經(jīng)濟性和實用性問題.總之，如何實現(xiàn)對細菌的特異性識別和高靈敏檢測是醫(yī)療健康和公共衛(wèi)生領域的一個核心問題，開發(fā)面向復雜背景樣本、面向細菌突變體、面向醫(yī)療衛(wèi)生實際應用、面向日常家用場景的細菌識別新方法迫在眉睫.