基于核酸適體的外泌體分子識別研究進(jìn)展

黃 玲，莊梓健，李 翔，石沐玲，劉高強(qiáng)

（中南林業(yè)科技大學(xué)林業(yè)生物技術(shù)湖南省重點實驗室,森林資源生物技術(shù)湖南省國際科技創(chuàng)新合作基地,長沙410004）

外泌體（Exosomes）是活細(xì)胞分泌的包含內(nèi)腔的脂雙層膜結(jié)構(gòu)的球形小體（直徑30~150 nm）.細(xì)胞通過內(nèi)體膜的向內(nèi)出芽，形成含有多個內(nèi)囊泡的多泡體，然后通過細(xì)胞內(nèi)的微管轉(zhuǎn)運(yùn)與膜錨定過程，最終質(zhì)膜融合并釋放內(nèi)囊泡到胞外從而形成外泌體（圖1）.

外泌體是細(xì)胞間信息的重要傳遞者，可通過傳遞各種蛋白質(zhì)、生物活性脂質(zhì)和遺傳信息來改變受體細(xì)胞的表型和功能［1］.納米尺寸的外泌體所攜帶的物質(zhì)的多樣性、外泌體內(nèi)包裝分子的性質(zhì)以及外泌體與靶細(xì)胞或組織之間的強(qiáng)大相互作用已使其成為內(nèi)環(huán)境平衡和疾病發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵角色.此外，腫瘤衍生的外泌體包含各種有用的生物學(xué)信息，其醫(yī)學(xué)鑒定依賴于膜表面蛋白的特定識別，被視為癌癥診斷和預(yù)后評估的非侵入性生物標(biāo)志物.

Fig.1 Biogenesis and composition of exosomes

1 外泌體的化學(xué)組成

外泌體通常攜帶來自母細(xì)胞的大量生物分子，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，并在多種體液環(huán)境中存在，如尿液、血液、母乳、腦脊液、唾液、膽汁、腹水、眼淚、精液和羊水等［2］.外泌體曾一度被認(rèn)為是細(xì)胞外DNA分泌的載體.2019年，Jeppesen等［3］在前人研究的基礎(chǔ)上，對外泌體組成進(jìn)行了重新評估，明確蛋白質(zhì)、RNA和DNA在外泌體和非外泌體性胞外物質(zhì)之間的分布差異，確定了小型外泌體不是活性DNA釋放的載體［3］.并提出了不依賴外泌體而依賴自噬和多泡內(nèi)體的細(xì)胞外dsDNA和組蛋白的主動分泌機(jī)制.因此，下文以學(xué)界得到廣泛認(rèn)可的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、RNA 3類物質(zhì)為代表，討論外泌體的化學(xué)組成.

1.1 蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)是組成外泌體的重要分子之一.外泌體的蛋白質(zhì)組分分為2類：一類是維持外泌體的結(jié)構(gòu)和基本功能的普遍存在的蛋白質(zhì)，大部分與細(xì)胞內(nèi)吞網(wǎng)絡(luò)和多泡體生物合成相關(guān)，反映了外泌體生物發(fā)生過程，例如細(xì)胞骨架蛋白、膜轉(zhuǎn)運(yùn)和融合蛋白、熱休克蛋白、四次跨膜蛋白超家族（如CD63、CD81）等.通常認(rèn)為四次跨膜蛋白超家族是外泌體特有的標(biāo)記蛋白，有一些常用的內(nèi)參標(biāo)記蛋白也廣泛存在于各類細(xì)胞的外泌體中，如Alix蛋白［4~7］和HSP70蛋白［8］可用于鑒定分離出的外泌體的粗產(chǎn)物.2021年，Kugeratski等［9］在鑒定外泌體的核心蛋白質(zhì)組時發(fā)現(xiàn)Syntenin-1蛋白為外泌體中最豐富的蛋白質(zhì)（圖2），可作為外泌體潛在的生物標(biāo)志物.

Fig.2 Representative results of the identification of Syntenin?1 as a consistently abundant protein in exosomes from different species and biofluids[9]

外泌體的另一類蛋白質(zhì)具有功能特異性，具體的蛋白種類與外泌體的細(xì)胞來源有關(guān).外泌體蛋白提供了關(guān)于微環(huán)境的發(fā)展和轉(zhuǎn)移的重要特定信息，如最近的研究證明TSG-101存在于幾乎所有來自尿液的外泌體中［10］.Lyden等［11］發(fā)現(xiàn)腫瘤源外泌體被器官特異性細(xì)胞吸收，為腫瘤轉(zhuǎn)移做好準(zhǔn)備，而且外泌體整合素可用于預(yù)測腫瘤在器官中的特異性轉(zhuǎn)移.Zhang等［12］研究發(fā)現(xiàn)，來自于鼻咽癌（NPC）細(xì)胞且呈LMP1-陽性的外泌體可誘導(dǎo)受體NPC細(xì)胞增殖和侵襲并抑制凋亡，尤其是促進(jìn)放射抗性.這使得少數(shù)表達(dá)LMP1的細(xì)胞可以通過潛在影響感染宿主和調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境來增強(qiáng)NPC細(xì)胞的放射抗性.

外泌體表面的蛋白質(zhì)在免疫應(yīng)答、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化和腫瘤侵襲中起著重要作用，因此，它們可以作為非侵入性診斷的生物標(biāo)志物［13］.一些特異性蛋白如GPC-1在胰腺癌細(xì)胞的外泌體上過度表達(dá)，且具有優(yōu)秀的特異性，這使得對GPC-1陽性循環(huán)外泌體的檢測可用于區(qū)分健康人、胰腺良性疾病患者和早期、晚期胰腺癌患者疾病并監(jiān)測治療反應(yīng).因而GPC-1被認(rèn)為是用于胰腺癌診斷的新生物標(biāo)記［14］.CD109蛋白在NPC細(xì)胞系和腫瘤組織源外泌體中都觀察到高水平的表達(dá)，但在正常組織中沒有，因此可作為一種優(yōu)秀的NPC診斷生物標(biāo)記［4］.酪氨酸激酶7（PTK7）僅在人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞源外泌體表面會出現(xiàn)高水平的表達(dá)，因而可作為一種很有前景的液體活檢生物標(biāo)記［15］.非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞源外泌體上的CD81和CD9蛋白可作為此病癥診斷的特異性蛋白［16］.Goel等［17］在結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞源外泌體中發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記蛋白A33會在患者體內(nèi)富集，因此其可作為判斷結(jié)直腸癌的特異性生物標(biāo)記.

一些蛋白質(zhì)并不會只存在于一種源外泌體中，而會普遍存在于一類相似的外泌體中.研究發(fā)現(xiàn)，CD63和CD9是癌細(xì)胞源外泌體上普遍存在的跨膜蛋白.EpCAM廣泛存在于乳腺癌MCF-7細(xì)胞、宮頸癌HeLa細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌A549，H460和H1299細(xì)胞的外泌體中［18］，且尤其在在乳腺癌細(xì)胞系和HeLa細(xì)胞外泌體中進(jìn)行高豐度表達(dá).CD63是在乳腺癌細(xì)胞系中普遍存在的外泌體生物標(biāo)志物，與EpCAM和MUC1相比，CD63的表達(dá)更豐富［8］.此外，MCF-7、HepG2、HeLa和Ramos細(xì)胞衍生外泌體表面還存在一種HER2蛋白，但與其它EpCAM、CD63和MUC1相比，表達(dá)此蛋白的水平較低［19］.這些特性使得初步鑒定病癥變得更加便捷，且通過外泌體各類蛋白表達(dá)豐度的不同，可區(qū)分不同的細(xì)胞系或細(xì)胞，并可在靶向治療時作為潛在的靶點.

1.2 脂 質(zhì)

外泌體的膜結(jié)構(gòu)決定其富含磷脂類、鞘脂類、膽固醇類等相關(guān)脂質(zhì).同時，外泌體含有的脂質(zhì)載體（如脂肪酸結(jié)合蛋白）能夠輔助外泌體運(yùn)輸具有生物活性的脂質(zhì).外泌體的脂質(zhì)成分與其來源細(xì)胞的種類相關(guān)，但不同脂質(zhì)成分的比例與來源細(xì)胞相比有一定差異.外泌體所含鞘磷脂和膽固醇的比例較其來源細(xì)胞更高，提示外泌體可能具有調(diào)節(jié)受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的功能［20］.Nishida-Aoki等［21］從細(xì)胞中的19類脂質(zhì)中鑒定出484種脂質(zhì)，從外泌體中鑒定出229種脂質(zhì)，并揭示了特定脂質(zhì)種類的選擇性富集.通過比較細(xì)胞和外泌體之間以及具有不同轉(zhuǎn)移頻率的細(xì)胞之間的脂質(zhì)成分，發(fā)現(xiàn)低轉(zhuǎn)移MDA-MB-231-luc-D3H1（D3H1）和高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移MDA-MB-231-luc-D3H2LN（D3H2LN）的外泌體中膽固醇和鞘磷脂的摩爾分?jǐn)?shù)較高，而磷脂酰膽堿的摩爾分?jǐn)?shù)較低.同時發(fā)現(xiàn)D3H2LN-外泌體中的不飽和二酰甘油物種比D3H1-外泌體中的不飽和二酰甘油物種上調(diào)，而細(xì)胞中的不飽和二酰甘油物種的數(shù)量沒有增加.這進(jìn)一步證實了富含二酰甘油的外泌體具有誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞PKD/PKC和PKCδ磷酸化的生物活性，從而刺激新生血管生成.越來越多的研究表明，外泌體的生物活性不僅存在于其蛋白質(zhì)和RNA中，還存在于其脂質(zhì)分子中.

1.3 RNA

2007年，Valadi等［22］發(fā)現(xiàn)外泌體介導(dǎo)的mRNAs和microRNAs的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而揭示了細(xì)胞之間基因交流的新的機(jī)理，并以此引發(fā)了外泌體內(nèi)含RNA研究的熱潮.外泌體中含有豐富的RNA，包括mRNAs、miRNAs和其它非編碼RNA.外泌體RNA可以隨著外泌體在體循環(huán)時被吸收，最終改變受體細(xì)胞的基因表達(dá)和生物學(xué)功能.外泌體內(nèi)含RNA的分布不是隨機(jī)的，而是有高度特異的分選機(jī)制，并受內(nèi)源目標(biāo)序列調(diào)控.特定序列的mRNA會選擇性地包載進(jìn)外泌體，使細(xì)胞內(nèi)和外泌體內(nèi)的mRNA種類不同.部分類別的miRNA會優(yōu)先裝載到外泌體中，如miR-320和miR-150.在生理或病理條件下，外泌體miRNA表達(dá)可能發(fā)生改變.且RNA組研究表明不同來源外泌體內(nèi)含的RNA的種類存在較大差異.外泌體RNA不僅具有生物標(biāo)記特性，而且外泌體結(jié)構(gòu)可為其內(nèi)含的miRNA提供保護(hù)作用，抵抗來自RNAase的降解，從而穩(wěn)定地存在于循環(huán)中的血漿和血清中，因此外泌體RNAs作為一種理想的臨床診斷的生物標(biāo)志物得到了大量研究［23］.

Pasini等［24］用外泌體RNA定量EGFR譜揭示了非小細(xì)胞肺癌患者的突變動力學(xué)，通過比較研究27例非小細(xì)胞肺癌患者的外泌體RNA，證明了外泌體RNA可作為臨床研究接受TKIs治療的非小細(xì)胞肺癌患者的EGFR突變的動態(tài)變化的有效工具.Walravens等［25］在心球源性細(xì)胞（MSCs）和間充質(zhì)干細(xì)胞（CDCs）源外泌體中檢測到了非編碼RNA，包括miR-10b、miR-146a和Y RNA片段.其中相對于MSC細(xì)胞外泌體，CDC細(xì)胞外泌體含有更高豐度的miRNA和Y RNA片段.Xu等［6］發(fā)現(xiàn)了膽管癌相關(guān)環(huán)狀RNA circ-CCAC1在膽管癌患者膽汁中的外泌體上高豐度表達(dá)，具有作為診斷性生物標(biāo)記的功能，而且circ-CCAC1可促進(jìn)膽管癌的惡化，因而抑制其表達(dá)或阻斷外泌體circ-CCAC1的傳播具有作為新的膽管癌治療方法的可能.Zhou等［26］在乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞外泌體中發(fā)現(xiàn)了一種新的核限制性和癌癥相關(guān)的lncRNA，即NEAT1.NEAT1在血清中外泌體的高表達(dá)促進(jìn)了更高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，并促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移、化療耐藥性和體內(nèi)轉(zhuǎn)移.此發(fā)現(xiàn)有助于乳腺癌治療方式的創(chuàng)新與發(fā)展.

1.4 小 結(jié)

外泌體的組成較復(fù)雜，根據(jù)外泌體數(shù)據(jù)庫Exocarta最新的數(shù)據(jù)顯示，不同組織細(xì)胞所產(chǎn)生的外泌體中含有9769種蛋白、1116種脂質(zhì)、3408種mRNA和2838種miRNA（http：//exocarta.org/）.外泌體的化學(xué)組成初步?jīng)Q定了其作用的功能和途徑.不同外泌體之間具有各自獨特的生物標(biāo)志物.因此，對于外泌體的研究中，對生物標(biāo)志物的研究尤為重要.上述工作中對一些具體和典型的外泌體化學(xué)組分進(jìn)行了一定的研究，但對外泌體的認(rèn)識隨著組學(xué)等分子譜分析技術(shù)的進(jìn)步還在不斷深化與更新.

2 基于核酸適體的外泌體分子識別

分子識別是指分子選擇性相互作用，例如抗體與抗原之間、酶與底物之間及激素與受體之間的專一結(jié)合.分子識別是一種普遍的生物學(xué)現(xiàn)象.糖鏈、蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)各自間以及相互之間都存在分子識別.分子識別作用在生命體系中至關(guān)重要，是生物分子的生理功能的根本基礎(chǔ).分子識別是通過2個分子各自的結(jié)合部位來實現(xiàn)的.在此過程中，可以與靶標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行特異性結(jié)合的分子被稱為識別單元.在生物學(xué)研究中，最常用的分子識別單元是抗體，而核酸適體（Aptamer）作為“化學(xué)家的抗體”，在外泌體的分子識別研究中占有一席之地.

2.1 核酸適體的來源與特性

核酸適體是指利用體外篩選——指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）從特定的寡核苷酸文庫中篩選出的能與靶標(biāo)物特異性結(jié)合的寡核苷酸序列——脫氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）［27］.核酸適體在20世紀(jì)90年代初由Ellington和Szostak、Robertson，Tuerk和Gold及其同事初步研究［28~30］.核酸適體是有意設(shè)計的寡核苷酸序列，不同于天然存在的配體.

核酸適體具有多靶點、低免疫原性和毒性、易于準(zhǔn)確合成和修飾、高化學(xué)穩(wěn)定性、低分子量等特點，其特異性和親和力與抗體相當(dāng)［31］.核酸適體可以折疊成獨特的三維構(gòu)象，通過分子間相互作用（范德華力、氫鍵、靜電相互作用、扁平部分的堆疊和形狀互補(bǔ)）與目標(biāo)物結(jié)合，靶標(biāo)包括小分子、蛋白質(zhì)，甚至細(xì)胞，結(jié)合功能類似于抗體，也被稱為化學(xué)抗體.核酸適體的獨特性質(zhì)使其成為生物識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的理想載體.因此在核酸適體應(yīng)用中最具代表性的方式為利用核酸適體的分子識別特性開發(fā)基于核酸適體的生物傳感器，用于外泌體檢測.

對于研究和醫(yī)學(xué)診斷中的分子分析，核酸適體由于具有可編程的堿基序列和結(jié)構(gòu)，且在低免疫原性和批次間差異、高特異性和敏感性以及更深的腫瘤穿透方面優(yōu)于常規(guī)抗體，已被用于在細(xì)胞、亞細(xì)胞和分子水平上跟蹤腫瘤，成為生物醫(yī)學(xué)研究、診斷和治療學(xué)中一類重要的親和配體.為了靶向癌細(xì)胞，Zhang等［32］使用核酸適體作為指導(dǎo)，將粘蛋白1（MUC1）在人乳腺腺癌細(xì)胞上的核酸適體整合到納米片中，顯著提高了乳腺腺癌細(xì)胞的抗腫瘤活性.針對外泌體特定的標(biāo)志物（包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、RNA），研究者可以選擇相應(yīng)的核酸適體特異性地與標(biāo)志物結(jié)合，從而識別外泌體，達(dá)到檢測、診斷治療的目的.當(dāng)前已報道的能夠特異性分子識別外泌體的核酸適體主要是DNA核酸適體，詳見表1.

Table 1 Reported aptamers with exosome recognition function

Continued

2.2 核酸適體識別外泌體普遍存在的CD63生物標(biāo)志物

通過識別外泌體膜上的特異性蛋白來進(jìn)行外泌體的檢測已有較多應(yīng)用，其中最有代表性的蛋白為四跨膜蛋白家族（CD9、CD63和CD81）.CD63是四跨膜蛋白超家族的一員，是一種高度n-糖基化的III型溶酶體膜蛋白.目前主要采用的CD63核酸適體是由Base pair生物公司針對靶蛋白CD63從隨機(jī)文庫篩選得到，它包含32個堿基，通過微尺度熱泳分析得出其親和力（Kd）為17.1 nmol/L.

2016年，CD63核酸適體即已被用于外泌體的檢測［66］.此后，研究者發(fā)展了基于CD63核酸適體的外泌體捕獲、鑒定、檢測等工作.Zhang等［56］利用CD63核酸適體結(jié)合外泌體表面過表達(dá)的CD63蛋白，從細(xì)胞培養(yǎng)基和血漿中捕獲并分離外泌體，同時保持所捕獲外泌體的高純度，也可以從臨床樣本中分離外泌體.此外，CD63核酸適體可以通過識別外泌體的CD63表面蛋白來執(zhí)行外泌體的醫(yī)學(xué)鑒定.Yu等［67］基于針對外泌體膜上CD63蛋白的核酸適體，成功開發(fā)了使用金納米顆粒（AuNPs）作為可視化探針的低成本側(cè)流核酸適體分析（LFAA）測試條，用于方便地鑒定從人肺癌細(xì)胞分離的A549外泌體.CD63核酸適體還被用來開發(fā)外泌體表征和定量的方法.Zhao等［68］提出一種用于在雙探針策略中準(zhǔn)確識別外泌體的核酸適體-膽固醇介導(dǎo)的鄰近連接分析方法.在此工作中，CD63核酸適體探針用來識別外泌體先天表面蛋白CD63，另一種膽固醇探針用來生物脂層靶向，可以極大地消除從游離CD63蛋白中廣泛識別的潛在非特異性熒光信號.作者開發(fā)的外泌體表面方法不僅可以對外泌體進(jìn)行定量，還可以用于追蹤，實現(xiàn)特異性外泌體的分離和準(zhǔn)確鑒定.Miao等［69］也通過引入CD63核酸適體實現(xiàn)了特異性識別，結(jié)合磁性Fe3O4@AuNPs易于分離的優(yōu)勢，制作了一種基于多足DNA步行器的超靈敏和選擇性的生物傳感器，通過定量分析可以評價目標(biāo)外泌體水平.為了適用于基于腫瘤外泌體的液體活檢，Li等［70］開發(fā)了一種低成本、易于處理的集成外泌體納米傳感器.此傳感器通過GPC-1抗體包被的磁珠來特異性捕獲來自乳腺癌的外泌體，通過用延伸的CD63核酸適體特異性識別外泌體，形成“三明治”狀復(fù)合物珠-外泌體-核酸適體，結(jié)合信號擴(kuò)增反應(yīng)，可實現(xiàn)在跨越5個數(shù)量級的動態(tài)范圍內(nèi)高特異性地檢測外泌體.由于近些年來CD63作為一種經(jīng)典的外泌體標(biāo)志物的重要作用得到了眾多學(xué)者的認(rèn)可，最近Song等［41］為了實現(xiàn)基于CD63的外泌體分離，通過設(shè)計的競爭性SELEX程序，同時引入NaCl作為洗脫系統(tǒng)，篩選出了新的CD63蛋白靶向核酸適體序列CD63-1.CD63-1顯示了與CD63蛋白的特異性結(jié)合能力，結(jié)合親和力中等（Kd≈100 nmol/L）.Wang等［57］還比較了4種不同腫瘤細(xì)胞（MCF-7，HepG2，HeLa，Ramos）源外泌體上CD63表達(dá)的細(xì)微差異，結(jié)果顯示CD63蛋白在HepG2外泌體上的表達(dá)最高，這為根據(jù)CD63表達(dá)水平區(qū)分不同的外泌體奠定了基礎(chǔ).而在研究了在MCF-7衍生外泌體上的4種不同膜蛋白的表達(dá)水平后，發(fā)現(xiàn)CD63蛋白仍然具有最高的表達(dá)水平.

2.3 核酸適體檢測癌細(xì)胞來源外泌體蛋白

外泌體攜帶其來源細(xì)胞的信息，因此可以在一定程度上代替來源細(xì)胞作為蛋白質(zhì)標(biāo)記的載體.而且外泌體在體液中分布，是比細(xì)胞更易獲得的診斷樣本.通過對外泌體的分析不僅能顯示出來源細(xì)胞的不同，還能在一定程度上區(qū)分癌細(xì)胞與非癌細(xì)胞.雖然腫瘤源外泌體含有來自母癌細(xì)胞的多種蛋白質(zhì)，已成為癌癥診斷的生物標(biāo)志物，但是腫瘤外泌體在生物液體中的濃度較低.研究者們基于DNA核酸適體和外泌體表面生物標(biāo)志物之間的分子識別，設(shè)計了外泌體的高度敏感和特異性感測平臺.Chen等［61］基于DNA核酸適體sgc8和外泌體表面生物標(biāo)志物PTK7之間的分子識別，設(shè)計了一種策略用于外泌體的高度敏感和特異性感知.在相同濃度下，CEM細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體的強(qiáng)度遠(yuǎn)高于Ramos和HL-7702細(xì)胞，略高于B16F1細(xì)胞和HeLa細(xì)胞，與其它文獻(xiàn)報道的結(jié)論一致［35，62］.此策略具有高度的特異性來區(qū)分來自不同細(xì)胞系（CEM，B16F1，Ramos，HeLa和HL-7702）的外泌體，并已成功地在患者和健康的血漿樣本中得到驗證.Xu等［39］利用CD63和PMSA的核酸適體設(shè)計了外泌體觸發(fā)的酶驅(qū)動DNA馬達(dá)，并用其實現(xiàn)了不同癌細(xì)胞來源的外泌體的熒光檢測.Li等［71］開發(fā)了一種用于腫瘤源外泌體超痕量膜蛋白的高靈敏度分析方法.該方法通過結(jié)合鼻咽癌（NPC）生物標(biāo)志物CD109和EGFR的核酸適體，基于PCR的指數(shù)擴(kuò)增和CRISPR/Cas12a實時DNA檢測，用于檢測細(xì)胞系和復(fù)雜生物流體中的CD109+和EGFR+腫瘤源外泌體.臨床血清樣本分析證實，通過外泌體水平可獲得較高的診斷準(zhǔn)確性，用于區(qū)分NPC與健康對照.Wang等［72］利用CD63的核酸適體作為外泌體捕獲單元，通過雙AuNPs輔助信號放大的表面等離子體共振（SPR），報導(dǎo)了一種可用于外泌體檢測的靈敏的感應(yīng)體傳感器.該方法與商業(yè)酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）相比，檢出限（LOD）提高了104倍，能夠區(qū)分MCF-7乳腺癌細(xì)胞和MCF-10A正常乳腺細(xì)胞源外泌體.

外泌體還攜帶特定疾病的進(jìn)展和預(yù)后的信息.例如，癌細(xì)胞衍生的外泌體可以攜帶參與癌癥進(jìn)展的膜蛋白，所以某些外泌體蛋白可以作為表征不同疾病階段的標(biāo)志物.Xing等［58］開發(fā)了一種利用靶向核仁素和PD-L1的核酸適體直接高靈敏度檢測腫瘤源外泌體蛋白的傳感器分析方法.通過構(gòu)建的檢測方法進(jìn)行了臨床分析，結(jié)果顯示早期NPC患者的核仁素+外泌體水平明顯高于健康對照組，晚期NPC組的水平高于早期NPC組［圖3（D）］；他們還對8名NPC和2名肺癌患者進(jìn)行抗PD-1/PD-L1治療，發(fā)現(xiàn)臨床應(yīng)答者的循環(huán)外泌體PD-L1水平顯著降低，但無應(yīng)答者的循環(huán)外泌體PD-L1水平則沒有顯著降低.該工作初步證實血清核仁素+腫瘤源外泌體是鼻咽癌檢測的潛在生物標(biāo)志物，PD-L1+腫瘤源外泌體水平的變化是免疫檢查點封鎖治療反應(yīng)的潛在預(yù)測生物標(biāo)志物.Li等［50］選擇了一組3種核酸適體（AptEGFR，AptEpCAM和AptHER2）靶向外泌體表面的腫瘤相關(guān)蛋白EGFR、EpCAM和HER2，通過開發(fā)的熒光適體傳感器對其進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)EGFR是3種選定乳腺腫瘤群體相關(guān)蛋白標(biāo)志物中預(yù)測惡性乳腺癌的最佳標(biāo)志物，3種蛋白標(biāo)志物的組合在區(qū)分乳腺腫瘤患者（良性和惡性）和健康對照方面顯示出比單一標(biāo)志物更高的準(zhǔn)確性.EGFR核酸適體傳感器能以較高的效率診斷乳腺腫瘤，且分別以97.37%、92.31%的靈敏度來區(qū)分惡性乳腺癌和檢測到Ⅰ期病例，有望用于液體活檢中對腫瘤源外泌體蛋白的早期診斷.癌癥源外泌體的定量在癌癥的初始階段具有微創(chuàng)診斷的強(qiáng)大潛力，Kashefi?Kheyrabadi等［46］介紹了一種基于EpCAM核酸適體設(shè)計的定量檢測外泌體的電化學(xué)核酸適體傳感器（DeMEA），量化了乳腺癌患者不同疾病階段血漿樣本中的外泌體.利用核酸適體技術(shù)，DeMEA可以在來自其它癌細(xì)胞的外泌體存在的情況下特異性檢測出EPCAM陽性的外泌體，還能夠?qū)θ橄侔┗颊哌M(jìn)行特定階段的分析，在Ⅰ~Ⅳ期疾病進(jìn)展方面與酶聯(lián)免疫吸附分析保持很好的一致性.基于外泌體檢測和外泌體蛋白質(zhì)分析而開發(fā)的傳感平臺在癌癥診斷中都具有潛在的應(yīng)用價值.

Fig.3 Serum sample detection of nucleolin+EVs with the apta?HCR?CRISPR assay[58]

2.4 核酸適體探究外泌體蛋白譜系的異質(zhì)表達(dá)

外泌體的多重膜蛋白的表達(dá)可以精確地描繪外泌體的生物學(xué)信息，而且外泌體與來源細(xì)胞以及疾病發(fā)展的密切聯(lián)系使科研工作者對比較分析來自某些特定來源的外泌體的蛋白譜系產(chǎn)生了興趣.Liu等［48］將一種價格低廉、反應(yīng)快速且只需要較小血清量的熱泳核酸適體傳感器（TAS）分析擴(kuò)展應(yīng)用到臨床血清樣本中的外泌體，發(fā)現(xiàn)淋巴瘤患者血清外泌體中表面蛋白CD63、LZH8、HER2和PSA的表達(dá)水平明顯高于健康對照組.又通過TAS對7個熒光核酸適體（AptPTK7，AptLZH8，AptHER2，AptPSA，AptCA125，AptEpCAM和AptCD63）標(biāo)記的血清細(xì)胞外泌體表面蛋白進(jìn)行了癌癥診斷分析，發(fā)現(xiàn)每種癌癥都顯示出不同水平的外泌體蛋白質(zhì)標(biāo)志物，而健康對照組的外泌體表面蛋白質(zhì)幾乎沒有表達(dá).與健康對照組相比，癌癥外泌體個體標(biāo)志物（PSA除外）及其總和信號顯著升高.此分析方法在臨床驗證中區(qū)分癌癥與健康個體的準(zhǔn)確率為99%，可能有助于癌癥的篩查、分類和監(jiān)測.

Jin等［59］報道了一種基于核酸適體納米探針的面向外泌體的分析方法（ExoAPP）.該方法將氧化石墨烯與目標(biāo)響應(yīng)核酸適體結(jié)合，通過與酶抵抗的外泌體再循環(huán)互補(bǔ)，描繪不同細(xì)胞類型的外泌體標(biāo)記，以一種簡單的混合和檢測方式顯示表面蛋白質(zhì)的表型并定量癌性外泌體.用基于CD63和EpCAM的核酸適體作為分子識別單元，發(fā)現(xiàn)在相同濃度下，乳腺癌MCF-7細(xì)胞系外泌體顯示出比良性MCF-10A細(xì)胞系外泌體EpCAM和CD63的豐度分別增加了大約5倍和2倍.作者又選擇7種針對不同外泌體表面蛋白（CD63，AFP，CEA，EpCAM，PTK-7，PSMA和PDGF）的核酸適體作為分析探針，研究了5種細(xì)胞類型中外泌體的表型，揭示了外體表面蛋白的異質(zhì)性表達(dá).ExoAPP方法觀察到前列腺癌患者樣本的外泌體CD63，EpCAM和PSMA表達(dá)比健康對照組分別平均增加170%，200%和230%.乳腺癌是一種異質(zhì)性疾病，其缺乏特殊的腫瘤標(biāo)志物.因此，An等［44］開發(fā)了一種磁介導(dǎo)的電化學(xué)傳感器來分析乳腺癌細(xì)胞衍生的外泌體中的蛋白質(zhì)標(biāo)記信息.該傳感器利用核酸適體特異性識別4種外泌體蛋白（MUC1，HER2，EpCAM，CEA），并結(jié)合SPCE技術(shù)基于宿主-客體識別的同時檢測，可以區(qū)分4種不同乳腺細(xì)胞亞型間外泌體蛋白的細(xì)微差異.分析發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者源外泌體中MUC1，HER2，EpCAM和CEA蛋白的表達(dá)水平都高于健康個體源外泌體，在檢測乳腺癌患者血清中的外泌體方面具有較高的準(zhǔn)確性和易操作性.

Shi等［63］利用核酸適體作為識別部分和保護(hù)AuNPs免于聚集的雙重特性，報道了一種新型的多重傳感器平臺，該平臺是通過將AuNPs與一組針對普遍存在或推定的胞外表面蛋白的核酸適體組裝而成的.根據(jù)特定的核酸適體-外泌體表面-蛋白質(zhì)相互作用，核酸適體/抗體可以通過視覺和定量檢測，從而產(chǎn)生能夠識別不同癌細(xì)胞外泌體上多種蛋白質(zhì)（CD63，EpCAM，PDGF，PTK7，PSMA）的模式（圖4）.此平臺可以在幾分鐘內(nèi)區(qū)分和描述微小的外泌體表面蛋白差異，使這一策略適用于大規(guī)模高通量篩查，特別是護(hù)理點的臨床標(biāo)本分析中.

Fig.4 Molecular profiling of exosomal proteins using aptamer/AuNP sensor[63]

不同類型細(xì)胞外泌體膜蛋白水平的工作為區(qū)分不同的外泌體奠定了基礎(chǔ)，為腫瘤細(xì)胞的無創(chuàng)分類提供了可能，為基于外泌體膜蛋白鑒定的外泌體分子信息的準(zhǔn)確分析鋪平了道路，還為聯(lián)合檢測腫瘤標(biāo)志物實現(xiàn)癌癥的早期診斷提供了可能.

3 化學(xué)調(diào)控核酸適體用于外泌體識別

常規(guī)核酸適體存在著生物穩(wěn)定性差、組織穿透能力弱等局限性，限制了其從實驗到臨床的成功轉(zhuǎn)化，其主要表現(xiàn)為易被核酸酶降解、自身分子量小易通過腎臟快速清除、低熱穩(wěn)定性和有限的官能團(tuán)多樣性.克服這些限制的辦法在于通過序列設(shè)計以及共價修飾等化學(xué)調(diào)控手段對核酸適體進(jìn)行功能化改性以識別不同應(yīng)用場景下的外泌體.核酸適體的高度可編程性和靈活性為基于分析識別的外泌體研究開啟了一個新的視角.

3.1 核酸適體嵌合DNA納米結(jié)構(gòu)

DNA納米技術(shù)的進(jìn)步使得許多動態(tài)DNA納米結(jié)構(gòu)的構(gòu)建成為可能，DNA四面體（圖5）憑借其優(yōu)異的機(jī)械剛性和幾何穩(wěn)定性，已經(jīng)在生物傳感表面工程中得到了應(yīng)用.核酸適體序列可以通過序列設(shè)計嵌合入DNA四面體的構(gòu)成序列中，成為頂端帶有核酸適體序列、能夠?qū)ν饷隗w進(jìn)行識別與捕獲的DNA四面體.嵌合于DNA四面體的核酸適體具有更好的取向性，其識別與捕獲外泌體的效率更高.例如Wang等［73］結(jié)合先進(jìn)的核酸適體技術(shù)，基于DNA的納米結(jié)構(gòu)和便攜式電化學(xué)設(shè)備的優(yōu)勢，開發(fā)了一種納米四面體（NTH）輔助的核酸適體傳感器，用于直接捕獲和檢測肝細(xì)胞外泌體.定向固定化核酸適體顯著提高了人工含堿基的核酸適體對懸浮外泌體的可及性，與單鏈核酸適體功能化核酸適體傳感器相比，NTH輔助的核酸適體傳感器可檢測外泌體，靈敏度高出100倍.Jiang等［35］基于核酸適體修飾的DNA NTH結(jié)合AuNPs和酶信號放大，設(shè)計了一種用于分析癌性外泌體蛋白的電化學(xué)感應(yīng)傳感器.該核酸適體傳感器對HepG2肝癌外泌體的檢出限為1.66×104particles/mL，還實現(xiàn)了對不同癌癥階段的肝癌荷瘤小鼠血漿衍生的外泌體的分析.更重要的是，通過使用相應(yīng)的核酸適體，該傳感器可以用于分析4種外泌體蛋白，有望區(qū)分和描繪不同的外泌體表面蛋白.這種敏感的、多功能的電化學(xué)核酸適體傳感器為外泌體蛋白分析提供了一種新的方法.在感知細(xì)胞對環(huán)境刺激的適應(yīng)性反應(yīng)時或識別并結(jié)合目標(biāo)物時，這種膜錨定的納米結(jié)構(gòu)可被激活，然后通過串聯(lián)DNA雜交將多個功能模塊合并，為定制細(xì)胞工程和智能合成生物學(xué)提供了新的范式.

Fig.5 Aptamer?containing nanotetrahedron

3.2 核酸適體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換與信號放大

各種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，如雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）、滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）、鏈置換擴(kuò)增（SDA）和重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA），已被用于生物傳感中的信號擴(kuò)增，但通常需要完整的信號放大引發(fā)序列來啟動放大過程.大多數(shù)核酸適體傳感器是根據(jù)核酸適體與靶分子相互作用后的構(gòu)象變化或結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變而設(shè)計的.據(jù)此，如果在核酸適體序列的前后設(shè)計信號引發(fā)序列，核酸適體在識別其目標(biāo)物后結(jié)構(gòu)將發(fā)生變化，從而暴露信號引發(fā)序列，就能實現(xiàn)信號放大.目前已報道的外泌體檢測信號放大策略主要包括雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和滾環(huán)擴(kuò)增兩種.

由Pierce等［74］開發(fā)的HCR顯示出優(yōu)異的擴(kuò)增效率和通用的序列設(shè)計靈活性.由于具有無酶反應(yīng)性質(zhì)，HCR成本低，易于執(zhí)行.HCR是一種簡單但穩(wěn)健且高效的等溫擴(kuò)增過程.此外，HCR等溫擴(kuò)增技術(shù)是一種不涉及靶標(biāo)擴(kuò)增的探針擴(kuò)增技術(shù)，有效減少了RPA和PCR中經(jīng)常出現(xiàn)的擴(kuò)增物交叉污染和假陽性結(jié)果.由于上述良好特性，近些年基于核酸適體特異識別結(jié)合HCR信號擴(kuò)增技術(shù)用于外泌體檢測、定量的研究取得了較豐富的成果.如前文所述，Xing等［58］開發(fā)的腫瘤源外泌體蛋白檢測方法就是基于HCR和CRISPR-Cas12a的雙重擴(kuò)增［圖3（A）］.該方法可以直接從復(fù)雜的樣品環(huán)境中檢測腫瘤源外泌體，LOD約為102particles/μL.Wan等［75］提出了一種基于核酸適體的外泌體表面DNA納米組裝方法.這種原位組裝方法是基于DNA核酸適體與其外泌體表面標(biāo)志物之間的分子識別，以及由核酸適體-嵌合觸發(fā)的DNA雜交鏈反應(yīng)，表明DNA納米結(jié)構(gòu)可以成功地組裝在一個納米尺寸的細(xì)胞器上.Shen等［76］設(shè)計了構(gòu)象可切換探針來識別外泌體中非常豐富的經(jīng)典四酯蛋白標(biāo)志物CD63.該探針包含一個帶有CD63抗體核酸適體序列的目標(biāo)識別域和一個通過HCR啟動DNA生長的觸發(fā)域.這兩個結(jié)構(gòu)域的兩側(cè)有一個鉸鏈序列，以實現(xiàn)核酸適體-靶相互作用引發(fā)的構(gòu)象變化.由每個外泌體上的DNA納米結(jié)構(gòu)的靶引發(fā)工程實現(xiàn)單外泌體計數(shù)和表型.Gao等［37］開發(fā)了一種結(jié)合發(fā)夾式DNA級聯(lián)反應(yīng)（HDCR）和DNA樹突狀分子組裝的雙信號擴(kuò)增方法，用于特異性檢測CD63結(jié)合外泌體，從而實現(xiàn)了外泌體的定量檢測.將DNA探針連接到磁珠上的CD63核酸適體作為捕獲組件，在目標(biāo)外泌體存在的情況下，核酸適體識別并與外泌體結(jié)合，釋放DNA探針作為觸發(fā)器，通過打開與AuNPs結(jié)合的發(fā)夾DNA（HP1）來啟動HDCR.熒光標(biāo)記的DNA樹枝狀大分子與HP1連接，作為第二個信號放大階段，以提高信噪比.在最優(yōu)條件下，此方法對HepG2細(xì)胞來源的外泌體在1.75×103~7.0×106particles/μL范圍內(nèi)具有良好的線性響應(yīng)，檢出限為1.16×103particles/μL.該設(shè)計為生物樣本中的外泌體分析和定量檢測提供了有用的平臺.

滾環(huán)擴(kuò)增是一種在室溫下進(jìn)行的新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，能夠產(chǎn)生高分子量的產(chǎn)物以完成信號放大的反應(yīng).由于具有簡單、穩(wěn)定和高靈敏度的特點，RCA被認(rèn)為是一種有效的生化分析工具.Huang等［53］于2019年開發(fā)了一種MUC1特異性核酸適體用作檢測探針，RCA用于實現(xiàn)信號放大的熒光核酸適體傳感器來檢測胃癌外泌體.該方法對目標(biāo)外泌體具有較高的特異性，還對胃癌患者的血漿進(jìn)行了檢測，驗證了該方法的臨床適用性.該研究表明，這種基于核酸適體的生物傳感器為胃癌提供了一種簡單、快速、廉價的檢測方法，顯示出在胃癌診斷和預(yù)后方面的潛力.緊接著，該課題組［77］又于2020年初提出了一種通過結(jié)合血紅素/G-四鏈體系統(tǒng)和RCA來高選擇性靈敏檢測胃癌外泌體的無標(biāo)記核酸適體傳感器.他們先篩選幾種胃癌細(xì)胞或癌癥過表達(dá)的蛋白質(zhì)核酸適體以選擇胃癌外泌體特異性核酸適體，然后在抗CD63抗體修飾的金電極上捕獲不同種類的外泌體，發(fā)現(xiàn)只有胃癌外泌體能夠觸發(fā)RCA實現(xiàn)大量G-四鏈體單位的生成.最后利用氯化血紅素/G-四鏈脫氧核酶對RCA反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2進(jìn)行還原和信號放大，產(chǎn)生顯著強(qiáng)的電化學(xué)和比色響應(yīng)，驗證了基于胃癌患者血漿外泌體MUC1與健康者外泌體的差異.Zhao等［68］設(shè)計了一種核酸適體-膽固醇介導(dǎo)的鄰近連接分析，再整合用于信號擴(kuò)增的RCA策略，通過添加熒光報告分子顯著減少干擾信號，實現(xiàn)了高度特異性地識別和定量檢測外泌體，同時確保了相對高的靈敏度.

3.3 核酸適體的末端修飾

對核酸適體進(jìn)行末端修飾有許多方式，如修飾氨基、巰基、羧基、生物素或熒光分子等（圖6）.末端修飾的核酸適體隨著修飾基團(tuán)的不同和整體傳感體系設(shè)計的不同而具有不同的功能，一方面有利于其固定于基底，從而增強(qiáng)其穩(wěn)定性和抗酶切能力，增強(qiáng)對外泌體的分子識別功能；另一方面便于連接信號分子實現(xiàn)信號輸出.

Fig.6 Terminal modification of aptamers

生物素標(biāo)記的核酸序列可長期保存而不影響使用效果，標(biāo)記容易、簡單、時間短.Xu等［78］利用生物素修飾的核酸適體連接鏈霉親和素共軛的辣根過氧化物酶，從而釋放比色信號，用于外泌體檢測；而Zhang等［79］將生物素修飾的核酸適體連接于鏈霉親和素磁珠上，用于外泌體的捕獲與分離.除了生物素-親和素作用，核酸適體與載體的連接還可以通過酰胺反應(yīng)來完成，通過縮合劑EDC將羧基和氨基連接.如Wu等［80］將末端修飾氨基的核酸適體錨定在表面有羧基的微珠表面，并與DNA多聯(lián)體相連，用于識別和結(jié)合外泌體上CD63蛋白的傳感器.該生物傳感器在識別和定量檢測人類唾液外泌體方面具有良好的臨床可行性，為從體液中一步敏感定量檢測外泌體提供了一種新穎和通用的策略.Zhang等［81］基于末端修飾了羧基的CD63適體修飾的SA-PAM電極界面，利用原位形成的AuNPs-MXenes-Apt納米探針，開發(fā)了一種高靈敏的電致化學(xué)發(fā)光（ECL）生物傳感器，用于高靈敏度檢測外泌體.來自HeLa細(xì)胞系的外泌體的檢出限為30 particles/μL，比常規(guī)ELISA低1000多倍，線性范圍為102~105particles/μL.該ECL傳感平臺對來自不同腫瘤細(xì)胞系（HeLa、OVCAR和HepG2）的外泌體及其表面蛋白具有高選擇性，能夠靈敏、準(zhǔn)確地檢測人血清中的外泌體.核酸適體相對于抗體尺寸較?。ê怂徇m體分子量平均為1×104，而抗體超過1.5×105），可以很容易地用熒光染料標(biāo)記.外泌體的分子量估計為1×105~5×105，固有的巨大質(zhì)量/體積充當(dāng)基于質(zhì)量的熒光偏振放大器.因此，熒光染料標(biāo)記的核酸適體與外泌體的結(jié)合將顯著改變適體的分子量，從而導(dǎo)致熒光偏振信號的顯著變化.因此，F(xiàn)ang等［33］使用末端修飾TMR的核酸適體，采用一步混合讀取熒光蛋白法直接定量了癌細(xì)胞中的外泌體且無需分離.該工作證明了可在臨床樣本中定量檢測來自肺癌患者和健康供體的外泌體，描述了一種新的簡單的液體活組織檢查分析方法以直接檢測生物基質(zhì)中的外泌體，這有助于癌癥診斷和治療監(jiān)測.

3.4 多價核酸適體

在生物分析中，基于雙重識別機(jī)制的三明治法具有較高的特異性和敏感性，是蛋白質(zhì)測定的主要策略.例如Shen等［76］通過針對單個外泌體上不同蛋白標(biāo)志物（CD63和HERG2）同時被核酸適體識別的反應(yīng)，再結(jié)合HCR擴(kuò)大信號反應(yīng)用于檢測外泌體.此工作不僅實現(xiàn)了在同一外泌體上同時識別雙重表面標(biāo)記，而且通過簡單地修改探針，可以靶向更多不同類別的標(biāo)記，以提高核酸適體檢測方法對更多外泌體亞群體的區(qū)分能力［76］.而Chang等［82］則將用于癌癥生物標(biāo)記識別的多個DNA核酸適體和用于信號整合與擴(kuò)增的激活趾點作為兩個分子鑰匙，成功操作了可以執(zhí)行多個生物標(biāo)記的“AND”布爾邏輯分析的細(xì)胞表面裝置.該裝置可通過不同生物標(biāo)記的存在或不存在，在大量相似細(xì)胞中精確標(biāo)記靶細(xì)胞亞型.此研究能以優(yōu)異的靈敏度和準(zhǔn)確度實現(xiàn)單步癌細(xì)胞識別和分離.

Hou等［15］提出了一種基于雙核酸適體的三明治型表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）傳感器，用于腫瘤源外泌體的快速、特異定量檢測.CD63核酸適體首先通過Au—S鍵修飾在AuNPs表面，構(gòu)成SERS信號探針.然后將PTK7核酸適體固定在瓊脂糖珠表面以獲得捕獲探針（AAP）.在復(fù)雜的血清樣本中，AAP可以選擇性地與靶腫瘤外泌體膜表面的PTK7蛋白結(jié)合，而正常對照外泌體和各種蛋白聚集物可以通過簡單的離心去除.隨后加入特定的SERS探針識別目標(biāo)外泌體，最終形成一個三明治型核酸核酸適體-免疫復(fù)合物（AAP-Exo-SP）.盡管一些針對核酸適體的生物標(biāo)志物仍然未知，但隨著單細(xì)胞蛋白質(zhì)組高通量分析方法的增加，它們的發(fā)現(xiàn)過程正在加速.通過并行操作兩個基于多核酸適體的方法可以進(jìn)一步擴(kuò)大規(guī)模，以同時識別更多的受體.根據(jù)生物標(biāo)記的不同表達(dá)水平，核酸適體可以以更高的精確度識別細(xì)胞，這種集成的基于多核酸適體的方法可能將優(yōu)于當(dāng)前基于單一生物標(biāo)志物的細(xì)胞鑒定系統(tǒng)以及多步標(biāo)記方法.

3.5 分裂核酸適體

分裂核酸適體由完整核酸適體的2個或多個片段組成，2個片段在靶分子存在下可形成特殊的三元復(fù)合物.在沒有靶分子的情況下，分裂的核酸適體不能折疊成正確的二級結(jié)構(gòu)，缺乏二級結(jié)構(gòu)的分離鏈不能產(chǎn)生假陽性或非特異性信號.只有在靶分子存在的情況下，分裂的核酸適體才會選擇性地組裝.在這種情況下，它大大降低了細(xì)胞表面非特異性吸附的背景信號.但是目前將此項技術(shù)應(yīng)用至識別胞外外泌體檢測的工作還很少.受此概念啟發(fā)，Chen等［38］使用了一個簡單的基于發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（LRET）的紙支撐的自組裝傳感器，從上轉(zhuǎn)換納米粒子（UCNPs）到金納米棒（Au NRs）用于外泌體的可及性測定.當(dāng)外泌體存在時，核酸適體的兩段與外泌體表面的CD63蛋白結(jié)合，形成共軛，縮小UCNPs和Au NRs之間的距離，從而啟動LRET效應(yīng)，促進(jìn)發(fā)光猝滅，然后用圖像系統(tǒng)監(jiān)測、提取以量化發(fā)光.UCNPs的發(fā)光猝滅與外泌體的濃度線性相關(guān)，便能夠定量檢測外泌體.此方法不僅快速、便利，還可通過選擇相應(yīng)的核酸適體來檢測不同的目標(biāo).Zhang等［83］也設(shè)計了2個含有PTK7核酸適體片段的寡核苷酸探針來識別和捕獲含有PTK7的外泌體.在靶外泌體存在的情況下，核酸適體-靶三元復(fù)合物可以誘導(dǎo)鄰近雜交并在電極上形成dsDNA，進(jìn)而結(jié)合更多電活性增加陰極電流信號.利用這種方法構(gòu)建的簡易的外泌體電化學(xué)核酸適體傳感器對不同腫瘤源外泌體具有良好的選擇性，可用于復(fù)雜生物樣品中的外泌體檢測，也可擴(kuò)展到其它外泌體的檢測.

4 總結(jié)與展望

外泌體的研究始于30多年前［84］，但將核酸適體用于外泌體的研究是近5年新興的研究熱點，其中2019~2020年間發(fā)表的相關(guān)研究論文數(shù)量超過了以往的總和.本文主要綜述了以核酸適體為識別單元的對外泌體的組分進(jìn)行分子識別的研究工作，為外泌體以及核酸適體的研究工作者提供參考.此外，將核酸適體用于外泌體研究的另一個重要領(lǐng)域是以靶向細(xì)胞表面受體分子的核酸適體為核心構(gòu)建功能核酸，對外泌體表面進(jìn)行修飾，從而利用功能化的外泌體實現(xiàn)外泌體的改性與定向運(yùn)輸［85，86］.此方面的研究未作詳細(xì)討論.

盡管核酸適體獨特的特性使其成為構(gòu)建生物識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體系的理想材料，但適用于外泌體分子識別的核酸適體仍存在需要改進(jìn)或解決的問題和挑戰(zhàn).首要問題是可識別外泌體的核酸適體的種類有限，其數(shù)量遠(yuǎn)低于抗體，且可識別的靶標(biāo)種類僅僅局限于部分表達(dá)量相對較高的外泌體蛋白，缺乏針對脂質(zhì)、肽等其它活性成分的核酸適體.為了豐富靶向外泌體的核酸適體庫，除了采用已有的通過重組蛋白篩選出的核酸適體之外，通過篩選得到新的核酸適體是必由之路.對從外泌體上已鑒定出的具有醫(yī)學(xué)診斷意義的某一生物標(biāo)志分子作為靶標(biāo)進(jìn)行篩選是核酸適體篩選研究者的領(lǐng)域之一.此外，組學(xué)研究已證明了不同源外泌體的分子譜存在差異，因此，從宏觀組學(xué)思維出發(fā)，研究者嘗試以乳腺癌細(xì)胞源外泌體作為正篩靶標(biāo)，以普通細(xì)胞源外泌體為反篩靶標(biāo)，進(jìn)行核酸適體的篩選［87］.此工作的思維與Shangguan等［88］開發(fā)的Cell-SELEX有異曲同工之處.直接以外泌體整體作為靶標(biāo)進(jìn)行篩選所得到的核酸適體不僅可區(qū)分不同源外泌體，也可作為特定細(xì)胞的外泌體功能拮抗劑，從而為核酸適體藥物的開發(fā)拓展新的領(lǐng)域.與某一具體分子作靶標(biāo)相比，外泌體成分多樣，即使來源細(xì)胞相同，外泌體由于細(xì)胞生理狀態(tài)的不同仍然存在異質(zhì)性，因此在篩選文庫的選擇上選用何種豐富結(jié)構(gòu)多樣性的手段，如何優(yōu)化篩選過程控制和監(jiān)測方法，是提高外泌體篩選成功率需要考慮的問題［89］.

其次，識別外泌體的核酸適體在實際應(yīng)用方面的挑戰(zhàn)在于親和力和穩(wěn)定性.目前針對外泌體上某一特定靶標(biāo)蛋白進(jìn)行分子識別的核酸適體是直接采用的能夠結(jié)合同一體外重組蛋白或同一細(xì)胞表面蛋白的核酸適體.而外泌體作為非接觸介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊的載體，其生物發(fā)生過程復(fù)雜，且能夠響應(yīng)外界刺激，因此外泌體表面某一靶標(biāo)分子的構(gòu)象以及存在形式可能與細(xì)胞以及體外不同，因此導(dǎo)致此靶標(biāo)的核酸適體對于外泌體上的靶標(biāo)的結(jié)合能力降低.為解決這個問題，除了篩選或優(yōu)化得到新的核酸適體序列之外，還可以利用核酸適體便于化學(xué)調(diào)控的優(yōu)勢，結(jié)合輔助手段增大對外泌體的結(jié)合能力.基于生物正交反應(yīng)的方法和基于分子印跡的方法是有希望與核酸適體耦合、從而實現(xiàn)外泌體多維分子識別的途徑.

如前文所述，外泌體可作為生物分子標(biāo)記，特別是在癌癥診斷和治療方面有較突出的潛力，而且外泌體可從那些易于獲得的體液中分離，這使得外泌體成分發(fā)展液體活檢方法的重要目標(biāo)物.外泌體體積小，密度低，易在流體中分散，核酸適體如果用于循環(huán)體液中的外泌體的識別，就需要有更高的穩(wěn)定性，擁有抗酶切、長循環(huán)等特性.這些特性在核酸適體活體診療領(lǐng)域通常通過化學(xué)修飾來實現(xiàn)［90］，如在堿基2′位添加氟（F）、氨基（NH2）或甲氧基（OCH3）等基團(tuán)或在序列3′端加帽.篩選中也可加入鎖核酸（LNA）L型RNA核酸適體以獲得抗酶切的核酸適體.這些化學(xué)調(diào)控方法有望為體液中外泌體的識別提供借鑒，但應(yīng)注意在提供抗酶切能力的同時保留核酸適體的親和力.另一方面，為了延長活體內(nèi)循環(huán)時間，核酸適體可以通過設(shè)計與聚乙二醇、脂質(zhì)體、有機(jī)或無機(jī)納米材料等大體積單元連接，此方法在外泌體的識別中已經(jīng)得到了部分應(yīng)用［91］.在核酸適體化學(xué)不斷發(fā)展的背景下，隨著在體內(nèi)水平上對外泌體生理功能的進(jìn)一步探索以及外泌體臨床應(yīng)用的進(jìn)一步開發(fā)，核酸適體在外泌體分子識別方面的探索與應(yīng)用將有更廣闊的發(fā)展.