水提法和醇提法對(duì)舒肝和絡(luò)醒脾方抗肝纖維化作用的影響*

張秋菊，王奎淞，孫墨晗，李婕妠，郭嘉琪，劉 靚，劉 靜，趙鯤鵬

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)， 甘肅 蘭州 730000)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是由各種原因引起的慢性肝損傷后，肝臟正常結(jié)構(gòu)被破壞而致的肝細(xì)胞外基質(zhì)的異常積聚。目前尚無(wú)療效確切的抗HF藥物，復(fù)方中藥因其多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)在HF的防治上有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。肝纖維化屬中醫(yī)學(xué)“積聚”“癥積”“臌脹”范疇。綜合歷代醫(yī)家的認(rèn)識(shí)，在氣血的關(guān)系上，慢性肝病的發(fā)生發(fā)展符合葉天士“初病在經(jīng)在氣，久病入血入絡(luò)”的病機(jī)演變推論。甘肅中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)周信有教授基于多年臨床經(jīng)驗(yàn)和久病入絡(luò)理論，總結(jié)出了治療慢性肝病的舒肝化癥方，而舒肝和絡(luò)醒脾方是在其基礎(chǔ)上凝練而來(lái)，由醋柴胡、岷當(dāng)歸、炙黃芪、莪術(shù)、鱉甲、枳椇子6味藥組成。臨床上，復(fù)方中藥多以水提法和醇提法提取后服用。水提法和醇提法是中藥提取最常用的兩種方法，分別代表了傳統(tǒng)水煎用藥和現(xiàn)代制劑工藝[1-3]。舒肝和絡(luò)醒脾方的水提物和醇提對(duì)肝纖維的治療是否有差異目前尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過觀察水提和醇提兩種不同提取物對(duì)四氯化碳(CCL4)肝纖維化模型大鼠的作用，探討舒肝和絡(luò)醒脾方水提和醇提方式對(duì)其抗纖維化療效的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)Wistar大鼠40只，體質(zhì)量(200±20) g，雌雄各半，購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心并飼養(yǎng)于此，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(甘)2015-0002，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(甘)2015-0005。

1.2 藥物、試劑與儀器

舒肝和絡(luò)醒脾方處方：醋柴胡10 g，岷當(dāng)歸15 g，炙黃芪12 g，莪術(shù)12 g，鱉甲10 g，枳椇子10 g。藥材購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，并經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鑒定。舒肝和絡(luò)醒脾方水提法按臨床用藥比例取單味藥物混合，加5倍量水，不浸泡，回流提取0.5 h，趁熱過濾；藥渣再加4倍水回流提取0.5 h，趁熱過濾；合并濾液；濃縮，使生藥含量為 2 g/L。醇提法按方取單味藥物混合浸泡，加10倍量體積分?jǐn)?shù)為 700 mL/L乙醇，不浸泡，回流提取1.5 h，趁熱過濾；藥渣再加8倍量 700 mL/L 乙醇煎煮1.5 h，趁熱過濾；合并濾液；濃縮，使生藥含量為2 g/L。秋水仙堿片，西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號(hào)180101，0.5 mg/片。用研缽將秋水仙堿片磨碎，以生理鹽水溶解，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.1 g/L。食用橄欖油，山東魯花集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號(hào)為GB/T23347；CCl4分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號(hào)20120211；透明質(zhì)酸酶(HA)和IV型膠原(CIV)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，均為江蘇菲亞生物科技有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號(hào)依次為MM-0853R1、MM-0296R1；Masson三色染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號(hào)G1340；Infinite M200 Pro酶標(biāo)儀，奧地利TECAN公司產(chǎn)品；TC6010L全自動(dòng)生化分析儀，江西特康科技有限公司產(chǎn)品；ASP200S全自動(dòng)組織脫水機(jī)和RM2235型切片機(jī)，均為德國(guó)Leica公司產(chǎn)品；BX51M顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)，日本OLYMPUS株式會(huì)產(chǎn)品。

1.3 分組與造模

將40只大鼠分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、秋水仙堿組、疏肝活絡(luò)醒脾方水提組和疏肝活絡(luò)醒脾方醇提組5組，每組8只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。造模開始第1天，除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠均腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為400 mL /L 的CCl4橄欖油溶液，注射劑量2.0 μL/g體質(zhì)量，每周3次，至第8周末[4-7]。

1.4 給藥方法

從造模第2天開始給藥，1 d 1次至第8周末。參考《實(shí)驗(yàn)藥理方法學(xué)》[8]按體表面積換算大鼠灌胃劑量。舒肝和絡(luò)醒脾方水提組和醇提組分別給予水提物和醇提物，以4倍等效劑量28.75 g/kg體質(zhì)量灌胃；秋水仙堿組用秋水仙堿溶液5.0 μL/g體質(zhì)量灌胃；模型對(duì)照組以等量生理鹽水灌胃；正常對(duì)照組不做任何處理。各組均正常喂食喂水。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 取 材

于第8周末當(dāng)晚，大鼠禁食不禁水12 h，次日上午稱量體質(zhì)量后，用20 g/L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，剝離腹主動(dòng)脈，以真空采血管腹主動(dòng)脈取血，靜置 2 h，離心，取血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。取肝臟，以4 ℃生理鹽水沖洗，去除薄膜和殘留組織，稱量質(zhì)量；取肝臟中葉，于肝右葉離邊緣1 cm處切取大小為1 cm×1 cm×0.1 cm的肝組織，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40 g/L的甲醛固定。

1.5.2 肝指數(shù)

肝指數(shù)(%)=肝質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%[9-11]。

1.5.3 肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)

取大鼠血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠血清HA、CIV水平。

1.5.4 肝臟功能血清學(xué)指標(biāo)

采用全自動(dòng)生化儀以賴氏法檢測(cè)各組血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的含量。

1.5.5 肝臟結(jié)構(gòu)觀察及纖維化程度評(píng)估

甲醛固定的肝臟組織經(jīng)脫水、包埋、切片后，以Masson染色，光鏡下每張切片選取10個(gè)不同視野，觀察肝小葉結(jié)構(gòu)、纖維間隔、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等情況，對(duì)肝纖維化程度進(jìn)行評(píng)估。切片用雙盲法由3位病理醫(yī)師評(píng)估。肝纖維化分期參照2002年肝纖維化診斷評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)[12-13]。0期：無(wú)纖維化。1期：匯管區(qū)纖維化擴(kuò)大，局限于竇周和小葉內(nèi)纖維化。2期匯管區(qū)周圍纖維化，纖維間隔形成，小葉結(jié)構(gòu)保留。3期：纖維間隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無(wú)肝硬化。4期：早期肝硬化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肝指數(shù)對(duì)比

與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組肝指數(shù)升高，3個(gè)藥物組的肝指數(shù)均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。舒肝和絡(luò)醒脾方水提組與醇提組的肝指數(shù)對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肝指數(shù)對(duì)比

2.2 各組大鼠血清HA、CIV水平對(duì)比

與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠血清中HA、CIV水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，3個(gè)藥物組大鼠血清HA、CIV均下降(P<0.05)。與秋水仙堿組對(duì)比，舒肝和絡(luò)醒脾方水提組大鼠血清HA水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而水提組的CIV及醇提組的HA、CIV水平降低，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。舒肝和絡(luò)醒脾方水提和醇提組兩組間對(duì)比，血清HA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而血清CIV水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠HA、CIV水平對(duì)比

2.3 各組大鼠ALT、AST水平對(duì)比

與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠血清ALT、AST水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，3個(gè)藥物組大鼠血清ALT、AST水平均降低(P<0.05)。3個(gè)藥物組之間的兩指標(biāo)對(duì)比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠ALT、AST水平對(duì)比

2.4 各組大鼠肝纖維化程度對(duì)比

Masson染色后增生的膠原纖維呈現(xiàn)亮藍(lán)色。光鏡下，正常對(duì)照組大鼠肝臟小葉輪廓清晰，肝細(xì)胞索圍繞中央靜脈呈放射狀排列，竇周和小葉內(nèi)未見纖維間隔。模型對(duì)照組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)紊亂，竇周和小葉內(nèi)可見明顯纖維間隔形成，纖維間隔分割肝小葉，肝細(xì)胞脂肪變、壞死明顯。3個(gè)藥物組大鼠肝臟小葉結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，纖維分割明顯減少，肝細(xì)胞脂肪變、壞死減輕，舒肝和絡(luò)醒脾方水提組和醇提組尤為明顯。見圖1。

A.正常對(duì)照組:肝臟結(jié)構(gòu)正常，肝小葉輪廓清晰，肝索圍繞中央靜脈呈放射狀排列。B.模型對(duì)照組：肝臟結(jié)構(gòu)紊亂，纖維間隔分割肝小葉，肝細(xì)胞脂肪變、壞死明顯。C.秋水仙堿組：肝臟結(jié)構(gòu)紊亂減輕，分割肝小葉的纖維間隔減少，肝細(xì)胞脂肪變、壞死減輕。D.舒肝和絡(luò)醒脾方水提組：肝臟結(jié)構(gòu)紊亂明顯減輕，纖維間隔基本消失。E.疏肝和絡(luò)醒脾方醇提組：肝臟結(jié)構(gòu)紊亂有所減輕，偶見纖維間隔。黑色箭頭所示為纖維間隔。

根據(jù)Masson染色結(jié)果，參照2002年肝纖維化診斷評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)肝纖維化程度進(jìn)行量化，結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠肝臟纖維化程度加重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，3個(gè)藥物組大鼠肝臟纖維化程度均減輕(P<0.05)。舒肝和絡(luò)醒脾方水提和醇提組大鼠肝臟纖維化程度對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠肝纖維化程度對(duì)比 只

3 討 論

實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，舒肝和絡(luò)醒脾方具有明顯的改善肝纖維化的功效[14-17]。本實(shí)驗(yàn)分別采用水提法和醇提法提取舒肝和絡(luò)醒脾方的有效成分，觀察其對(duì)CCl4所致HF模型大鼠肝臟形態(tài)和功能的影響，對(duì)兩種提取物的抗肝纖維化功效進(jìn)行了比較。中藥水提法即傳統(tǒng)煎煮法，指利用水的溶解性將中草藥中親水性的有效成分溶解出來(lái)，因其符合中醫(yī)傳統(tǒng)用藥習(xí)慣，制備方法簡(jiǎn)單易行，是中藥提取中應(yīng)用最早也是至今應(yīng)用最為廣泛的方法；但由于其提取成分復(fù)雜、雜質(zhì)多、有效成分損失多(尤其是脂溶性成分)等缺點(diǎn)，為中藥精制帶來(lái)了一定困難。醇提法多指利用乙醇的溶解性，將乙醇作為溶劑對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離提純的方法。乙醇的溶解性能比較好，對(duì)中草藥細(xì)胞的穿透能力較強(qiáng)，彌補(bǔ)了水提法的一些不足之處[18-19]。

肝指數(shù)是衡量肝臟大小的指標(biāo)，血清HA和CIV是評(píng)估肝纖維化程度最為敏感的血清學(xué)指標(biāo)，血清ALT、AST水平是評(píng)估肝臟功能的常用指標(biāo)，肝臟的HE和Masson染色是從形態(tài)學(xué)角度對(duì)肝纖維化程度進(jìn)行評(píng)估。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：肝指數(shù)、血清學(xué)指標(biāo)HA、CIV、ALT、AST含量及肝纖維化程度方面，與模型對(duì)照組對(duì)比，舒肝和絡(luò)醒脾方水提組和醇提組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而水提組與醇提組之間對(duì)比，雖然HA、ALT和AST差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但數(shù)值向反方向背離(如水提組降低AST的效果不及醇提組，但醇提組降低ALT的效果不及水提組)，因此，此數(shù)據(jù)無(wú)法證明兩組間治療效果的差異。結(jié)果表明：舒肝和絡(luò)醒脾方水提物和醇提物對(duì)肝纖維化均有明顯療效，不同提取方法對(duì)其療效無(wú)明顯影響。

水提法和醇提法對(duì)舒肝和絡(luò)醒脾方療效無(wú)明顯影響，但是其有效成分目前仍未明確，治療肝纖維化的機(jī)制還處于探索階段，因此，還需進(jìn)一步深入研究以明確其有效成分及作用機(jī)制[20]。