疏肝化積湯對肝癌荷瘤小鼠CD4+CXCR5+ T細胞亞群和IL-6、IL-21、CXCR5的影響*

王 珍，鄒鳳嬌，駱敏翔，錢國強，趙昌林

(1.廣東祈福醫(yī)院， 廣東 廣州 511495； 2.廣東藥科大學(xué)健康學(xué)院，廣東 廣州 510006)

肝癌是發(fā)病率和病死率均較高的惡性腫瘤，每年我國有38.3萬例患者死亡，占世界肝癌死亡人數(shù)的51%[1]，目前病死率仍持續(xù)上升[2]。肝癌的治療方法包括手術(shù)治療、介入治療、靶向藥物和免疫藥物治療等。針對肝癌癌前病變的干預(yù)和術(shù)后康復(fù)仍缺乏有效的措施，而中醫(yī)藥防治起著重要的作用[3]。中醫(yī)藥可調(diào)節(jié)機體內(nèi)環(huán)境，重塑腫瘤免疫微環(huán)境。中藥可調(diào)節(jié)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子和Fas抗原/Fas抗原配體的表達，減弱腫瘤干細胞的致癌能力，促進樹突狀細胞成熟，調(diào)節(jié)輔助性T細胞1(Th1)/輔助性T細胞2(Th2)的平衡[4]。濾泡輔助性T細胞(Tfh)是CD4+T效應(yīng)細胞亞群之一， CD4和趨化因子受體5(CXCR5)是其主要標記，參與慢性感染、B細胞免疫等過程，對感染性疾病的體液免疫起決定性調(diào)節(jié)作用；同時在自身免疫和腫瘤發(fā)生等疾病中具有重要作用，可激活抗腫瘤免疫細胞，增強機體的抗腫瘤作用。CXCR5是Tfh細胞表達的特有受體，Tfh 細胞通過分泌白細胞介素(IL)-21和IL-6，在促進B細胞免疫和抗腫瘤中起關(guān)鍵作用。臨床研究表明：免疫激活和免疫耐受患者外周血中CD4+CXCR5+T細胞數(shù)量及IL-21水平明顯升高[5-6]；慢性乙肝患者外周血中CD4+CXCR5+T細胞升高，且與乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)載量呈負相關(guān)[7]。本研究觀察了疏肝化積湯對肝癌移植瘤小鼠CD4+CXCR5+T細胞亞群和IL-6、IL-21、CXCR5的影響，探討其治療肝癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動 物

無特定病原體(SPF)級C57BL/6小鼠40只，35～42 d齡，體質(zhì)量(20±3)g，雌雄各半，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(粵)2013-0034，動物使用許可證號為44007200010001。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，實驗過程均遵守科技部頒發(fā)的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。本實驗經(jīng)廣東祈福醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 細 胞

H22肝癌細胞株，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。

1.3 藥品、試劑與儀器

疏肝化積湯組成：柴胡10 g，黨參10 g，制附片5 g，女貞子20 g，細辛5 g，桃仁10 g，紅花10 g，桂枝10 g，半枝蓮30 g等。藥物由廣東祈福醫(yī)院制劑室提供并鑒定，使用前制成流浸膏，每毫升含生藥0.87 g。順鉑注射粉針劑，山東齊魯制藥有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號6J015A89，10 mg/支。CD4(批號15004281)、CXCR5(批號25918541)，均為美國eBioscience公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑iScript cDNA synthesis kit，美國BIO-RAD公司產(chǎn)品，批號1708890；定量PCR試劑ABI Power SYBR Green PCR Master Mix，美國ABI公司產(chǎn)品，批號1708891；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒，北京百奧萊博科技有限公司，批號1708891BUN；IL-6、IL-21、CXCR5酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒，上海聯(lián)科生物科技公司產(chǎn)品，批號依次為118041125,226536078,540219677。PT-3502全自動酶標儀，北京普天技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Ts2R/Ts2RFL倒置型熒光顯微鏡、成像系統(tǒng)，均為日本尼康公司產(chǎn)品；FACSCanto流式細胞儀，美國BD公司產(chǎn)品；ABI 7900 HT Sequence Detection System，美國Servicebio公司產(chǎn)品；包埋機，武漢俊杰電子有限公司產(chǎn)品。

1.4 模型的建立

將H22肝癌細胞株接種于C57BL/6小鼠腹腔，5 d后形成腹水；取乳白色腹水離心，調(diào)整細胞濃度為1×107/mL；取0.1 mL懸浮液接種于C57BL/6小鼠左側(cè)胸部，形成肝癌移植瘤。接種5 d后，局部見硬性突起移植瘤，通過組織病理學(xué)檢測，證實造模是否成功。

1.5 動物分組與給藥

按隨機數(shù)字表法將小鼠分為空白對照組、模型對照組、順鉑組和疏肝化積湯組，每組10只。空白對照組不進行干預(yù)，其他3組小鼠左側(cè)胸部接種肝癌移植瘤。在造模成功48 h后開始給藥，空白對照組、模型對照組給予生理鹽水灌胃，5 μL/g體質(zhì)量，1次/d，連續(xù)14 d；順鉑組給以順鉑腹腔注射，4 μg/g體質(zhì)量，1次/d，連續(xù)3 d后停止給藥。疏肝化積湯組給予疏肝化積湯5 μL/g體質(zhì)量灌胃，連用14 d。

1.6 檢測指標

14 d后斷頸處死動物，摘除眼球取血，無菌狀態(tài)下分離脾臟，剝離腋下腫瘤組織，進行檢測。

1.6.1 一般情況

每天稱量各組小鼠體質(zhì)量，觀察小鼠進食量、活動度、毛發(fā)及精神狀態(tài)等。

1.6.2 瘤體生長情況

稱量移植瘤的質(zhì)量，并進行石蠟切片、蘇木精-伊紅染色，觀察各組小鼠移植瘤的組織病理學(xué)變化。

1.6.3 血清IL-6、IL-21和CXCR5水平

采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測。收集血清標本離心，加樣，用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min，洗滌，每孔加入酶標試劑50 μL，溫育，顯色，每孔加終止液50 μL終止反應(yīng)，上機測定。

1.6.4 脾淋巴細胞中CD4+CXCR5+T細胞亞群的數(shù)量

采用流式細胞學(xué)技術(shù)檢測。脾臟剪碎，200目細胞篩上適度研磨。收集細胞混合液，以6 cm為離心半徑、1 500 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min。將裂解后的懸浮細胞緩慢加在淋巴細胞分離液上。取中間的淋巴細胞，計數(shù)，定容量至1×107/mL，加1.25 μL熒光染料APC標記的CD4抗體(CD4-APC)和1.25 μL熒光染料PE標記的CXCR5抗體(CXCR5-PE)，室溫避光孵育30 min。另取樣品加入5 μL熒光染料PE標記的CD90抗體(CD90-FE)、5 μL熒光染料PE標記的免疫球蛋白G (IgG-PE)進行對照，室溫避光孵育30 min，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次。24 h內(nèi)上機檢測。

1.6.5 移植瘤中IL-6、IL-21和CXCR5的基因檢測

采用實時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測，管家基因為β-actin，以ΔCt = Ct靶基因-Ct管家基因方法計算IL-6、IL-21和CXCR5基因的相對表達水平。引物由上海生工生物工程有限公司合成。常規(guī)提取H22肝癌移植瘤的核糖核酸(RNA)凍存。取出RNA，4 ℃下解凍，在0.2 mL PCR管中配制。將PCR管置于25 ℃ 5 min，42 ℃孵育30 min，85 ℃變性5 min，4 ℃保溫。將PCR管置于PCR儀中進行反應(yīng)，50 ℃孵育2 min，然后95 ℃孵育10 min；接著進行40個循環(huán)(95 ℃，15 s；60 ℃，1 min)；最后進行數(shù)據(jù)分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠一般情況對比

與模型對照組小鼠對比，疏肝化積湯組小鼠毛發(fā)光亮，能維持正常體質(zhì)量和食欲，活動程度尚可。與空白對照組小鼠對比，疏肝化積湯組小鼠體質(zhì)量、進食量、毛發(fā)和精神狀態(tài)相似，但活動度有所減少。順鉑組小鼠明顯消瘦，脫毛，進食量減少，活動度差。模型對照組進食量、活動度、毛發(fā)和精神狀態(tài)介于疏肝化積湯組和順鉑組之間。

2.2 移植瘤的組織病理學(xué)變化及各組小鼠瘤體質(zhì)量對比

移植瘤的組織病理學(xué)檢查顯示：細胞體積較大；核大深染，核仁清晰可見，核分裂現(xiàn)象多見；胞漿少，呈暗色嗜酸性染色，證實為H22肝癌移植瘤。與模型對照組對比,順鉑組和疏肝化積湯組的瘤體質(zhì)量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。疏肝化積湯組的瘤體質(zhì)量與順鉑組對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。結(jié)果表明：順鉑與疏肝化積湯均可抑制H22肝癌移植瘤的生長，兩者的抑制作用無顯著差異。

表2 各組小鼠瘤體質(zhì)量對比

2.3 各組小鼠血清中IL-6、IL-21和CXCR5水平對比

與模型對照組、順鉑組和空白對照組對比，疏肝化積湯組小鼠血清中IL-6、IL-21和CXCR5水平升高，除CXCR5水平與模型對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其他對比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與模型對照組對比，順鉑組的IL-6和CXCR5水平下降，IL-21水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表3。結(jié)果表明:H22肝癌移植瘤的形成引起小鼠免疫反應(yīng)，表現(xiàn)為血清IL-6和CXCR5的水平升高；免疫細胞分泌功能下降，出現(xiàn)IL-21下降。疏肝化積湯可提高血清IL-6、IL-21和CXCR5的水平，而順鉑使血清IL-6和CXCR5的水平降低。兩者的治療作用機制不同。

表3 各組小鼠血清中IL-6、IL-21和CXCR5水平對比

表3 各組小鼠血清中IL-6、IL-21和CXCR5水平對比

組 別IL-6IL-21CXCR5空白對照組57.33±12.03 13.73±2.055.84±2.73 模型對照組106.15±23.7812.71±2.7810.76±3.65順鉑組81.87±22.85??19.81±3.82???6.17±2.85???疏肝化積湯組143.23±42.15???###△△△39.43±12.23???###△△△14.33±4.15?###△△△

注：與模型對照組對比，* P>0.05，**P<0.05，***P<0.01；與順鉑組對比，# P>0.05，## P<0.05，### P<0.01；與空白對照組對比，△△△ P<0.01。

2.4 各組小鼠脾淋巴細胞中CD4+CXCR5+ T細胞亞群數(shù)量對比

與模型對照組、順鉑組和空白對照組對比，疏肝化積湯組CD4+CXCR5+T細胞亞群的數(shù)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型對照組對比，順鉑組CD4+CXCR5+T細胞亞群的數(shù)量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表4。結(jié)果表明： H22肝癌移植瘤的形成引起小鼠免疫反應(yīng)，CD4+CXCR5+T細胞的數(shù)量升高；疏肝化積湯可提高小鼠的免疫功能，表現(xiàn)為脾臟CD4+CXCR5+T細胞亞群數(shù)量的顯著增加；而順鉑可導(dǎo)致其數(shù)量下降。

表4 各組小鼠脾淋巴細胞中CD4+CXCR5+ T細胞亞群數(shù)量對比

2.5 各組小鼠移植瘤中IL-6、IL-21和CXCR5基因表達對比

與模型對照組對比，疏肝化積湯組IL-6、IL-21和CXCR5的基因表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與順鉑組對比，疏肝化積湯組IL-6、IL-21和CXCR5的基因表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表5。結(jié)果表明：經(jīng)過疏肝化積湯治療，H22肝癌移植瘤中IL-6、IL-21和CXCR5的表達升高，而順鉑治療后腫瘤微環(huán)境中IL-6、IL-21和CXCR5的表達降低。兩者治療作用機制不同。

表5 各組小鼠移植瘤中IL-6、IL-21和CXCR5基因表達對比

3 討 論

中醫(yī)藥可延緩惡性腫瘤的進展，延長生存時間，提高生活質(zhì)量。本實驗結(jié)果顯示，疏肝化積湯可保持小鼠毛發(fā)光亮，維持正常體質(zhì)量、食欲和良好的活動度，可抑制H22肝癌移植瘤生長，治療效果與順鉑相似。

目前，中醫(yī)藥治療肝癌的作用機制研究主要在誘導(dǎo)細胞凋亡和提高免疫功能等方面，如:白藜蘆醇可誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡[8]，熊果酸、芍藥醇、藤黃酸可抑制人肝癌細胞生長并誘導(dǎo)凋亡[9-11]，復(fù)方制劑能夠提高免疫抑制小鼠的體液免疫和細胞免疫反應(yīng)[12]。在本項研究中，H22肝癌移植瘤形成時，小鼠脾臟CD4+CXCR5+T細胞亞群的數(shù)量升高，血清IL-6和CXCR5的水平升高，屬于免疫反應(yīng)；而IL-21出現(xiàn)下降，提示CD4+CXCR5+T細胞的功能受到抑制；疏肝化積湯可以提高小鼠脾臟CD4+CXCR5+T 細胞亞群的數(shù)量，血清IL-6、IL-21和CXCR5的水平也顯著升高；而使用順鉑化療后，肝癌移植瘤小鼠的免疫功能受抑，CD4+CXCR5+T 細胞亞群的數(shù)量下降，血清IL-6和CXCR5的水平降低。表明順鉑和疏肝化積湯的治療作用機制不同，疏肝化積湯以提高免疫功能為主。

在肝癌移植瘤微環(huán)境中，疏肝化積湯可提高IL-6、IL-21和CXCR5的基因表達。CD4+CXCR5+T細胞表達CXCR5和Bcl-6，主要分泌IL-21[13]。CD4+CXCR5+T細胞是抗原特異性B細胞反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，B細胞趨化劑CXCL13與CD4+CXCR5+T細胞在腫瘤微環(huán)境中浸潤，可提高癌癥生存率[14]。Tfh細胞參與抗腫瘤免疫反應(yīng)，甲狀腺癌遠處轉(zhuǎn)移患者血清中的IL-10、IL-21和CXCL13的表達明顯低于健康對照人群和局部疾病患者，遠處轉(zhuǎn)移者血液循環(huán)中的Tfh細胞對B細胞生長和IgM分泌的支持能力較差。CD4+CXCR5+T細胞亞群功能缺陷，惡性腫瘤易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[15]。研究表明，白術(shù)、黃芪、黨參、柴胡等可提高機體免疫力，黃芪甲苷可顯著抑制HBV抗原的分泌，對HBsAg、HBeAg均有明顯的抑制作用[16]。本實驗中結(jié)果表明：疏肝化積湯可以提高肝癌移植瘤中IL-21、IL-6、CXCR5的基因表達，使CD4+CXCR5+T細胞在肝癌免疫微環(huán)境中浸潤，改善腫瘤的免疫微環(huán)境，起到抗腫瘤作用；而順鉑則起到抑制作用，使CD4+CXCR5+T細胞在腫瘤免疫微環(huán)境中減少。

綜上所述，疏肝化積湯可提高CD4+CXCR5+T細胞亞群的數(shù)量和功能，改善腫瘤免疫微環(huán)境，從而起到抗腫瘤作用。