基于生物信息學(xué)分析的激素性股骨頭壞死相關(guān)核心基因和通路識(shí)別

王 寬，茆 軍，張 立，邢潤(rùn)麟，梅 偉，丁 亮，張農(nóng)山，王培民

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210029；2.江蘇省中醫(yī)院骨科，江蘇 南京 210029）

激素性股骨頭壞死（steroid-induced osteonecrosis of the femoral head，SONFH）是指高劑量激素導(dǎo)致股骨頭活性成分死亡的病理過(guò)程。SONFH 是非侵襲性壞死最常見(jiàn)的原因之一[1]，在沒(méi)有有效治療的情況下，80%的患者會(huì)在1～3 年內(nèi)出現(xiàn)股骨頭塌陷，且難以逆轉(zhuǎn)[2]，大多數(shù)患者需要人工關(guān)節(jié)置換術(shù)。SONFH 主要發(fā)病人群為中青年，但人工關(guān)節(jié)置換術(shù)的長(zhǎng)期效果仍難以預(yù)測(cè)[3]。因此，SONFH 早期階段的檢測(cè)、尋找有效的方法就顯得尤為重要。然而現(xiàn)有的SONFH 生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)價(jià)值有限，迫切需要進(jìn)一步深入研究SONFH 發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)SONFH的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，以提高治療效果，改善患者預(yù)后。基因芯片是基于堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，利用化學(xué)的合成等技術(shù)，出現(xiàn)的高通量測(cè)序方法[4]。研究顯示[5]，疾病的發(fā)生是受特異基因表達(dá)量的變化影響，這些基因變化的表達(dá)水平與人類正常的表達(dá)水平有明顯的不同。本研究基于生物信息學(xué)提取差異基因，研究其所在通路及參與的生理病理過(guò)程，從而發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵性的致病基因，旨在為SONFH的早期發(fā)現(xiàn)和診斷提供方向，預(yù)測(cè)潛在的SONFH 治療藥物，為SONFH的分子發(fā)生機(jī)制、臨床診斷和藥物治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)的篩選 截止至2020 年11 月，以“steroid-induced osteonecrosis of the femoral head，homo sapiens”為關(guān)鍵詞從公共基因表達(dá)總表（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）搜索目標(biāo)基因芯片，經(jīng)過(guò)篩選，最終選取GSE123568 作為本次研究的目標(biāo)數(shù)據(jù)基因芯片。GSE123568 共有40 個(gè)樣本，由30例SONFH 患者樣本和10例健康樣本組成。

1.2 SONFH 差異表達(dá)基因篩選 GEO2R（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/GEO2R/）是一個(gè)基于R 語(yǔ)言的差異表達(dá)基因（DGEs）篩選工具，比較之間的差異。得到差異分析結(jié)果。在此結(jié)果中篩選差異表達(dá)基因，需同時(shí)滿足以下2 個(gè)條件：①adj.P＜0.01；②|log2FC|＞5，即差異倍數(shù)（Foldchange）FC＞32 或FC＜-32。

1.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心基因的篩選 將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/cgi/input.pl）獲取蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI），使用CytoscapeV3.7.0可視化，并完成拓?fù)浞治?。運(yùn)用cytoHubba 插件，獲取排名前10 位的核心基因。

1.4 SONFH 差異表達(dá)基因富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）將篩選出的差異表達(dá)基因上傳至Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://metascape.org/），進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。GO分析包括生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞成分、分子功能3 方面內(nèi)容，主要對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞成分、分子生物學(xué)功能進(jìn)行分析;KEEG 主要針對(duì)差異表達(dá)基因的信號(hào)通路進(jìn)行富集分析。

1.5 核心基因生物進(jìn)程可視化與GSEA 分析 核心基因的選擇以不低于10 度進(jìn)行。Cytoscape的生物網(wǎng)絡(luò)基因腫瘤學(xué)工具（Bingo）插件幫助可視化了核心基因的生物分析過(guò)程。同時(shí)應(yīng)用MSigDB v7.0 進(jìn)行GSEA 分析。

1.6 SONFH 潛在治療藥物篩選 藥物-基因相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)（DGIdb，https://dgidb.org/）是一個(gè)整合了來(lái)自組織和展示論文、數(shù)據(jù)庫(kù)和網(wǎng)絡(luò)資源的藥物-基因相互作用和基因可藥性信息的數(shù)據(jù)庫(kù)。將核心基因列表上傳到DGIdb 數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)得分篩選潛在治療藥物。

2 結(jié)果

2.1 SONFH 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果 按照篩選條件，得到GSE123568 共有的160 個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因34 個(gè)，下調(diào)基因126 個(gè)，見(jiàn)圖1。

圖1 差異基因火山圖

2.2 SONFH 差異表達(dá)基因富集分析 GO 功能富集分析主要分為BP、CC 和MF，見(jiàn)圖2。BP 主要包括紅細(xì)胞發(fā)育、輔因子代謝過(guò)程、含卟啉化合物的生物合成過(guò)程、陽(yáng)離子穩(wěn)態(tài)等生物學(xué)過(guò)程。CC 主要有光譜蛋白相關(guān)細(xì)胞骨架、基底外側(cè)質(zhì)膜、線粒體基質(zhì)、真空裂解等細(xì)胞成分。MF 主要集中于細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)組成、2 鐵-2 硫簇合、驅(qū)動(dòng)蛋白結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚活性等分子功能。KEGG 通路分析結(jié)果見(jiàn)圖3，有助于找出針對(duì)差異基因的最明顯豐富的途徑。特異性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要表現(xiàn)為脂肪酸延長(zhǎng)、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、醛固酮調(diào)節(jié)的鈉重吸收、卟啉與葉綠素代謝等。

圖2 GO 富集分析

圖3 KEGG 富集分析

2.3 SONFH 差異表達(dá)基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和核心基因篩選結(jié)果 將差異基因提交至String 平臺(tái)，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)過(guò)Cytoscape的cytoHubba 插件篩選得到12 個(gè)核心基因見(jiàn)表1，PPI 網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖4。

圖4 差異基因PPI 圖

表1 核心基因

2.4 生物進(jìn)程可視化與GSEA 分析 核心差異基因的分析共有10 個(gè)基因，并且度值不低于10。分析其潛在價(jià)值的生物學(xué)分析過(guò)程見(jiàn)圖5，可見(jiàn)紅細(xì)胞發(fā)育在細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程中的重要性。GSEA 結(jié)果表明，核心差異基因的異常調(diào)節(jié)與一些重要的生物學(xué)過(guò)程有關(guān)，包括JAK-STAT 通路、toll 受體通路、溶酶體、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，見(jiàn)圖6。

圖5 核心基因的生物分析過(guò)程

圖6 GSEA 基因集濃縮圖譜

2.5 SONFH 潛在治療藥物預(yù)測(cè)篩選結(jié)果 根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出的10 個(gè)核心基因，分別為SLC4A1、EPB42、ALAS2、AHSP、GYPB、EPB41、KLF1、RHAG、FECH、SPTA1。在DGIdb 數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找相關(guān)潛在藥物，最后搜索發(fā)現(xiàn)共4 個(gè)基因具有相關(guān)藥物。由基因SLC4A1 預(yù)測(cè)到的潛在治療藥物有美托洛爾、阿替洛爾；由ALAS2 預(yù)測(cè)到的潛在治療藥物有甘氨酸、磷酸吡哆醛；由AHSP 預(yù)測(cè)到的潛在治療藥物有富馬酸亞鐵、硫酸亞鐵甘氨酸；排名前3的藥物甘氨酸、富馬酸亞鐵、硫酸甘氨酸亞鐵作為候選治療藥物。

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中的SONFH 進(jìn)行生物信息學(xué)分析獲得差異表達(dá)基因，并分析了有關(guān)這些基因富集的生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞成分、分子功能和信號(hào)通路，為SONFH的機(jī)制研究提供了理論依據(jù)與研究方向參考。分析可見(jiàn)，SLC4A1、EPB42、ALAS2、AHSP、EPB41、KLF1 等核心差異基因多為紅細(xì)胞發(fā)育相關(guān)膜蛋白，其異常表達(dá)常常會(huì)引起紅細(xì)胞周期停滯、溶血性貧血等可能[6]。異常形態(tài)紅細(xì)胞可使血液黏滯性增加，血流緩慢，加之變形性差，易堵塞毛細(xì)血管引起局部缺氧和炎癥反應(yīng)。股骨頭的微循環(huán)作為循環(huán)系統(tǒng)的終末分支，關(guān)節(jié)軟骨下負(fù)重側(cè)微血管的分布均較非負(fù)重側(cè)密集股骨頭相對(duì)較差，局部的微循環(huán)阻塞，繼而引起骨內(nèi)壓增加，導(dǎo)致股骨頭缺血性壞死[7]。

在骨壞死的發(fā)病機(jī)制中，類固醇對(duì)凝血功能的影響可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用。既往研究表明[8]，類固醇還會(huì)影響內(nèi)皮細(xì)胞功能，干預(yù)血管修復(fù)和新血管生成，導(dǎo)致凝血酶和其他血管活性物質(zhì)的產(chǎn)生，影響血漿纖溶酶原激活物抑制和組織纖溶酶原激活之間的平衡。最后結(jié)局就是血栓形成。另外，類固醇同時(shí)干預(yù)脂質(zhì)的代謝和動(dòng)態(tài)平衡[9]，兩者都會(huì)加劇高凝狀態(tài)，減少流向股骨頭等敏感部位的血流。此外臨床研究表明[10]，低肝CYP3A 活性和幾種基因多態(tài)性與類固醇誘導(dǎo)的ONFH的風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。核心差異基因的異常表達(dá)人群，可能具有更強(qiáng)的遺傳易感性。對(duì)于類固醇對(duì)機(jī)體影響，耐受性更差，導(dǎo)致了SONFH的高發(fā)生率。

GSEA 分析結(jié)果可見(jiàn)多通路在SONFH 發(fā)病機(jī)制中扮演角色。JAK-STAT 通路少數(shù)多效級(jí)聯(lián)反應(yīng)之一，與體內(nèi)發(fā)育和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的多種信號(hào)相關(guān)。介導(dǎo)細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的主要信號(hào)傳導(dǎo)。可能在SONFH的發(fā)生發(fā)展中起著中介作用。Toll 受體通路可通過(guò)誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和共刺激分子的上調(diào)來(lái)激發(fā)先天免疫的快速激活，主要激活NFκB 和MAPK 產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子。研究表明[11]，類固醇通過(guò)作用于NF-κB（RANK）和RANK-配體的受體激活（RANK-L）來(lái)刺激骨丟失，而RANK-L 是激活破骨細(xì)胞和輔助T細(xì)胞免疫的關(guān)鍵系統(tǒng)。溶媒體是動(dòng)物細(xì)胞中膜定界的細(xì)胞器，是細(xì)胞的主要消化腔室，進(jìn)行各種大分子的降解，是細(xì)胞自噬的最終結(jié)局。實(shí)驗(yàn)研究表明[12]，自噬參與了SONFH的病理過(guò)程，并與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，自噬與骨細(xì)胞的相互作用與激素的劑量有關(guān)，還影響SONFH 中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的相互作用。自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作為先天免疫系統(tǒng)，其所含的效應(yīng)蛋白穿透細(xì)胞膜并誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡。

避免手術(shù)、藥物控制是多數(shù)SONFH 患者的期待治療，尋找有效、敏感的治療SONFH 藥物有助于改善患者的預(yù)后。本研究預(yù)測(cè)了甘氨酸、富馬酸亞鐵、硫酸甘氨酸亞鐵3 種藥物。甘氨酸為內(nèi)源性抗氧化劑還原性谷胱甘肽的組成氨基酸，在神經(jīng)信號(hào)的傳遞以及參與各種生理和病理反應(yīng)中起著的重要基礎(chǔ)作用，發(fā)揮著抗炎、免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞保護(hù)作用[13]。在缺血再灌注損傷中，因缺血而破壞的組織細(xì)胞，再灌注又加重這種破壞。巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的激活、氧自由基和毒性因子的生成、降解酶如蛋白酶的活化導(dǎo)致炎癥反應(yīng)、組織破壞和功能衰竭。甘氨酸可以通過(guò)上述機(jī)制抑制這些反應(yīng),保護(hù)細(xì)胞免受缺血再灌注損傷，也可以通過(guò)保護(hù)線粒體功能，促進(jìn)缺血部位的血管再生以延緩股骨頭壞死的進(jìn)展[14]。富馬酸亞鐵、硫酸甘氨酸亞鐵主要是治療缺鐵性貧血的藥物，補(bǔ)充鐵劑，促進(jìn)血紅蛋白的形成[15]。與SONFH 相關(guān)的研究，目前暫缺。有待醫(yī)學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展。

綜上所述，目前的研究首次確定了SONFH 患者的10 個(gè)核心基因。在其發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中起著重要作用。此外，JAK-STAT 通路、Toll 受體通路、溶媒體、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性在其中扮演主要角色。預(yù)測(cè)了甘氨酸、富馬酸亞鐵、硫酸甘氨酸亞鐵作為治療SONFH的潛在藥物。進(jìn)一步闡明SONFH的發(fā)病機(jī)制和生物學(xué)進(jìn)程，有待于臨床試驗(yàn)和基礎(chǔ)研究的開(kāi)展。