基于類salen配體的二苯基錫配合物的合成、抗腫瘤活性及其與DNA相互作用

譚宇星 張續(xù)箭 陳 樂 毛芳芳 蔣伍玖

(衡陽師范學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，功能金屬有機(jī)材料湖南省普通高等學(xué)校重點實驗室，功能金屬有機(jī)化合物湖南省重點實驗室，湘江上游重金屬污染監(jiān)測與治理湖南省工程研究中心，衡陽 421008)

0 引 言

自從1965年Rosenberg[1]發(fā)現(xiàn)了第一個有效的抗癌金屬藥物——順鉑以來，具有抗癌活性的金屬配合物便吸引了更多的科研人員從事相關(guān)研究。有機(jī)錫是一類Sn和C原子直接結(jié)合所形成的金屬有機(jī)化合物，由于它具有一定的細(xì)胞毒性作用，并且與DNA結(jié)合能力較強(qiáng)，能夠抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等，因此，該類化合物在癌癥化學(xué)療法的相關(guān)報道中占有重要地位[2-5]。雖已有許多關(guān)于不同有機(jī)錫化合物的生物活性和結(jié)構(gòu)的報道[6-8]，但科研人員仍很難事先根據(jù)藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確預(yù)測藥物的生物活性。因此，合成大量具有潛在的生物活性的分子并且探索其構(gòu)效關(guān)系，有助于開發(fā)新的有機(jī)金屬抗癌藥物。

類salen型酰腙配體對配合物的性質(zhì)表現(xiàn)出較好的調(diào)控作用，其中Ay等[9]報道的二苯乙二酮苯甲酰腙鎳配合物具有較好的抗肺癌活性；Srivastava等[10]報道的二苯乙二酮苯甲酰腙釩配合物具有較好的氧化還原活性。眾所周知，有機(jī)錫配合物中的配體在其幾何結(jié)構(gòu)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，并影響其生物活性[11-15]。二苯基二氯化錫由于其脂溶性過高，成藥性低，所以我們試圖通過類salen型酰腙配體來調(diào)控二苯基錫配合物的脂水分配系數(shù)，從而提高此類有機(jī)錫配合物的成藥性。同時，本文報道合成的配合物的體外抗癌活性，研究了配合物與DNA的相互作用，為開發(fā)新型金屬抗腫瘤藥物提供了重要的理論基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

IR用日本島津Prestige-21紅外光譜儀(4 000～400 cm-1，KBr壓片)測定。1H、13C和119Sn NMR 用Bruker AVANCE-500核磁共振儀測定。元素分析用PE-2400Ⅱ元素分析儀測定。晶體結(jié)構(gòu)用Bruker SMART APEX Ⅱ CCD單晶衍射儀測定。紫外可見光譜用日本島津公司UV-2550型紫外可見光譜儀測定。HRMS用Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL(ESI源)測定。熒光光譜用日本日立F-7000熒光光譜儀測定。熱重(TG)和微分熱重(DTG)曲線用德國NETZSCH TG 209 F3熱重分析儀測定：空氣氣氛、加熱速度 20 ℃·min-1、氣體流速為 20 mL·min-1、40～800℃。熔點用北京泰克X-4雙目體視顯微熔點測定儀測定(溫度計未經(jīng)校正)。

配體參考文獻(xiàn)方法[16]合成。溴化乙錠(EB)、小牛胸腺DNA、三羥甲基氨基甲烷(Tris)為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。其它試劑均為分析純，水為超純水。Tris-HCl(0.01mol·L-1)緩沖溶液通過稱取一定量Tris用0.1mol·L-1的鹽酸溶液調(diào)至pH值為7.40，使用前配制。小牛胸腺DNA的純度通過比較260和280 nm處的吸光度來確定(A260/A280=1.8～1.9)，用所需pH值條件下的緩沖溶液配制，濃度通過測定260 nm 處的吸光度計算而得(ε260=6 600 L·mol-1·cm-1)，其儲備液置于4℃保存。溴化乙錠溶液通過稱取適量溴化乙錠固體，用pH=7.40的Tris-HCl(0.01mol·L-1)緩沖溶液配制。

1.2 配合物的合成

配合物的合成路線如圖1所示。于50mL圓底燒瓶中，加入1mmol二苯乙二酮苯甲酰腙或二苯乙二酮水楊酰腙、1mmol二苯基二氯化錫、20mL甲醇，攪拌回流3 h。冷卻，過濾，通過控制溶劑揮發(fā)法分別得到2種配合物的淡黃色晶體。

圖1 配合物的合成Fig.1 Synthesis of the complexes

[(C6H5(O)C=N—N=C(Ph)—(Ph)C=N—N=C(O)—C6H5)2SnPh2(CH3OH)]·3CH3OH(1)：產(chǎn)率 71%。m.p.40～42 ℃(dec)。元素分析(C44H46N4O6Sn)實測值(計算值，% )：C，62.53(62.35)；H，5.50(5.48)；N，6.63(6.64)。IR(KBr，cm-1)：3 055,1 587,1 512,1 479,1 431，1 358,1 323,1 290，1 260，1 173，1 152，1 092，1 069，1 024，999，914，880，733，714，691，627，602，451。1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ8.20(d，J=7.2 Hz，4H)，7.74～7.76(m，4H)，7.47(d，J=7.5 Hz，2H)，7.36(t，J=7.2 Hz，4H)，7.34～7.35(m，4H)，7.28～7.32(m，12H)。13C NMR(125 MHz,CDCl3)：δ173.95,148.73,143.54,136.13,134.40,131.92,131.59,130.86,129.60，129.51，128.88，128.78,128.15，127.39，50.86。119Sn NMR(Me4Sn，187MHz,CDCl3):δ-434.56。HRMS(ESI)m/z:C40H30N4O2Sn+[M-4CH3OH+H]+計算值719.146 35，實測值719.146 00。

[(o-OH—C6H4(O)C=N—N=C(Ph)—(Ph)C=N—N=C(O)—(o-OH—C6H4))2SnPh2(CH3OH)]·CH3OH(2)：產(chǎn)率73%。m.p.84～86℃。元素分析(C42H38N4O6Sn)實測值(計算值，% )：C，62.05(61.93)；H，4.73(4.72)；N，6.92(6.94)。 IR(KBr，cm-1)：3 597，3 179,3 049，2 990，2 895，2 791，1 622，1 584，1 524，1 508,1 481，1 443，1 431，1 360，1 319，1 298，1 279，1 248,1 229,1 188,1 163,1 113,1 098,1 072，1 026.13，1 001，949，916，891，835，806，756，737，708，694，671，619，604，538，496，455，428。1H NMR(500MHz，CDCl3)：δ11.77(s，2H)，8.15(d，J=7.6 Hz，2H)，7.74(d，J=6.7 Hz，4H)，7.36～7.38(m，14H)，7.23(d，J=7.3 Hz，4H)，6.88～6.94(s，4H)。13C NMR(125 MHz，CDCl3)：δ174.37,160.61,148.89,142.06,136.03，135.08，134.28，131.40,130.52,130.27,129.26,129.22，128.50，119.08，117.40，116.57，50.91。119Sn NMR(Me4Sn，187 MHz，CDCl3)：δ-451.08。 HRMS(ESI)m/z：C40H30N4O4Sn+[M-2CH3OH+H]+計算值751.136 18，實測值751.136 11。

1.3 晶體結(jié)構(gòu)測定

采用經(jīng)石墨單色化的MoKα射線(λ=0.071 073 nm)，以φ～ω掃描方式收集衍射數(shù)據(jù)。全部數(shù)據(jù)經(jīng)Lp因子和多重掃描吸收校正。晶體結(jié)構(gòu)由直接法解出，全部非氫原子坐標(biāo)在差值Fourier合成中陸續(xù)確定，由理論加氫法給出氫原子在晶胞中的位置坐標(biāo)。對氫原子和非氫原子分別采用各向同性和各向異性熱參數(shù)進(jìn)行全矩陣最小二乘法修正，全部結(jié)構(gòu)分析計算工作采用SHELX-97程序完成[17]。

CCDC：2082589，1；2082590，2。

表1 配合物1和2的晶體學(xué)數(shù)據(jù)Table 1 Crystallographic data of Complexes1 and 2

續(xù)表1

1.4 MTT法檢測配合物對細(xì)胞的毒性作用

將待測藥物溶于少量DMSO，用水稀釋至所需濃度，保持最終DMSO濃度小于0.1%。NCI-H460、HepG2、MCF7細(xì)胞株取自美國組織培養(yǎng)庫(ATCC)，NCI-H460、HepG2、MCF7細(xì)胞株用含10% 胎牛血清的RPMI 1640(GIBICO公司)培養(yǎng)基，在體積分?jǐn)?shù)5% 的CO2、37℃和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行體外培養(yǎng)。體外抗癌藥敏試驗是通過MTT法測定。數(shù)據(jù)處理使用Graph Pad Prism version 7.0程序，化合物的IC50通過程序中具有S形劑量響應(yīng)的非線性回歸模型進(jìn)行擬合得到。

1.5 紫外可見光譜研究

將配合物用DMSO配制成1mmol·L-1儲備液。在5mL容量瓶中分別加入配合物溶液(50μmol·L-1)及不同濃度的ct-DNA(0～100 μmol·L-1)，用Tris-HCl緩沖溶液定容，混勻，25℃下放置3.0 h，以不同濃度的ct-DNA溶液為參比，分別掃描230～800 nm范圍內(nèi)的紫外可見吸收光譜。

1.6 熒光猝滅作用

將配合物用DMSO配制成1mmol·L-1儲備液。在5mL容量瓶中分別加入ct-DNA、EB及不同濃度的配合物溶液，用Tris-HCl緩沖溶液定容，混勻，25℃下放置3.5 h，分別掃描熒光光譜，激發(fā)波長為258 nm，測定540～700 nm波長范圍內(nèi)的熒光光譜，激發(fā)和發(fā)射光譜掃描狹縫寬度均為5.0 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 譜學(xué)研究

在配合物1、2的紅外譜圖中，2個配合物在1 587、1 583 cm-1處的吸收峰歸屬為酰腙(C=N—N=C)鍵的特征吸收[16,18-19]。此外，1、2配位鍵的特征峰ν(Sn—O)、ν(Sn—N)和ν(Sn—C)與文獻(xiàn)[20-23]報道的類似化合物的出峰位置一致，由此表明2個目標(biāo)配合物的生成。

在1H NMR譜中，配合物各組峰的積分面積之比與預(yù)期結(jié)構(gòu)的各組質(zhì)子數(shù)相對吻合[24-25]。從譜圖中可以看到，配合物1和2中芳環(huán)上氫分別在δ=7.25～8.21和δ=6.88～8.16呈現(xiàn)出多組峰。不同的是，在配合物2中，二苯乙二酮水楊酰腙配體上羥基氫在δ=11.77處呈現(xiàn)一個單峰。對比2個配合物的1H NMR譜圖，2個配合物的氫峰基本保持一致，說明2個配合物具有相似的最簡結(jié)構(gòu)單元。

在13CNMR譜中，配合物各組峰與理論推測結(jié)構(gòu)碳原子數(shù)相吻合[24-25]，配合物1和2的特征峰為酰胺鍵上的碳原子分別在δ=173.95和174.37處的峰，其他碳原子的出峰位置與X射線單晶衍射所得結(jié)構(gòu)均一一對應(yīng)。

在119Sn NMR譜中，1和2分別在δ=-434.56和-451.08處呈現(xiàn)一個單峰，表明2個配合物中均僅存在一種Sn。

2.2 晶體結(jié)構(gòu)

配合物1、2的主要鍵長和鍵角數(shù)據(jù)列于表2，分子結(jié)構(gòu)見圖2、3。配合物1和2具有類似結(jié)構(gòu)的不對稱單元，現(xiàn)以配合物1為例詳細(xì)描述結(jié)構(gòu)。在配合物1中，結(jié)構(gòu)單元由1個配位的雙酰腙配體、2個苯基以及1個配位的甲醇分子組成。配位原子的2個N來自雙酰腙配體的N2和N4，2個O也是來自雙酰腙配體的O1和O2，另外2個C分別來自2個苯環(huán)上的C29和C35，還有1個甲醇分子的O3參與配位，使得錫原子構(gòu)成七配位的五角雙錐構(gòu)型，與文獻(xiàn)[26]報道類似配合物的幾何構(gòu)型相似。O1、O2、O3、N2、N4占據(jù)了赤道平面的5個位置，C29和C35則占據(jù)了該平面兩側(cè)的軸向位置，軸向C29—Sn1—C35鍵角為171.61(6)°，相比180°偏離了8.39°，且赤道平面的5個原子與中心錫原子的鍵長不等，鍵角也不相等，因此，該配合物中心錫原子為七配位畸變五角雙錐構(gòu)型。

表2 配合物1和2的部分鍵長和鍵角Table 2 Selected bond lengths(nm)and bond angles(°)of Complexes1 and 2

圖2 配合物1的橢球率30% 分子結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Molecular structure of complex 1 with 30% probability ellipsoids

圖3 配合物2的橢球率30% 分子結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Molecular structure of complex 2with 30% probability ellipsoids

雙酰腙配體上相鄰的原子與Sn形成了3個五元螯合環(huán) Sn1—O1—C7—N1—N2、Sn1—N2—C8—C9—N4和Sn1—N4—N3—C10—O2，以錫原子為中心的夾角均不相等，鍵長也略有差異。結(jié)合晶體學(xué)數(shù)據(jù)分析可以看出，該分子中雙酰腙配體與Sn配位部分不完全對稱，所形成的3個五元螯合環(huán)中左右2個環(huán)上鍵參數(shù)與中間五元環(huán)略有差異。配合物2與配合物1的配位模式類似，中心錫原子也為七配位畸變五角雙錐構(gòu)型。

2.3 熱穩(wěn)定性研究

如圖4、5所示，隨著溫度的升高，配合物1、2均發(fā)生了明顯的失重過程。配合物1從40℃開始就出現(xiàn)失重現(xiàn)象，配合物2也是在100℃之前出現(xiàn)了失重。分析其原因，是2個配合物中存在游離的甲醇分子，導(dǎo)致配合物分子不穩(wěn)定，容易發(fā)生失重，這與X射線單晶衍射測得的結(jié)構(gòu)一致。失去甲醇分子后，配合物1仍持續(xù)失重，而配合物2在120～300℃之間沒有失重，說明配合物2的分子骨架相對穩(wěn)定；2個配合物的重量最終穩(wěn)定在約17.82% (1)和18.53% (2)，期間所失去的重量對應(yīng)的是配合物失去雙酰腙配體以及2個苯基，殘余物與SnO2的計算含量17.74% (1)及18.44% (2)吻合。上述熱分析結(jié)果表明配合物2的骨架結(jié)構(gòu)比配合物1穩(wěn)定。

圖4 配合物1的TG和DTG曲線Fig.4 TG and DTG curves of complex 1

圖5 配合物2的TG和DTG曲線Fig.5 TG and DTG curves of complex 2

2.4 體外抗癌活性研究

以臨床上應(yīng)用的抗癌藥物卡鉑為對照品，測定了配合物1、2對NCI-H460(人肺癌細(xì)胞)、HepG2(人肝癌細(xì)胞)和MCF7(人乳腺癌細(xì)胞)的體外抗腫瘤活性。實驗結(jié)果見表3。從表中數(shù)據(jù)可知，配合物1、2對NCI-H460、HepG2和MCF7三種癌細(xì)胞均有一定的抑制活性，但是配合物2對3種癌細(xì)胞相對更為敏感，其IC50值均比配合物1的要小，并且配合物2對HepG2和MCF7兩種癌細(xì)胞的IC50值分別為(6.71±0.19)μmol·L-1和(6.71±0.19)μmol·L-1，均小于卡鉑對該細(xì)胞的IC50值，不過從IC50數(shù)值上也可以看出，配合物2對HepG2和MCF7兩種癌細(xì)胞的抑制效果也僅是略優(yōu)于卡鉑。

表3 配合物1、2和卡鉑對癌細(xì)胞的體外抑制活性Table 3 Inhibition activity of Complexes 1,2 and carboplatin to cancer cellin vitro

對比1和2的分子結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其差異僅在于配體中苯環(huán)上的取代基不同。基于該觀察結(jié)果，推測可能的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系如下：當(dāng)與錫原子相連接的烴基R相同時，配體上的取代基對配合物的抗癌活性影響較?。涣硪环矫?，類salen配體的二苯基錫配合物具有一定的抗癌活性。因此，可以考慮將該類配合物進(jìn)一步化學(xué)優(yōu)化作為抗癌藥物的候選化合物。為此，我們接下來以配合物2為例研究其與DNA的相互作用。

2.5 配合物與DNA作用的紫外可見光譜研究

為了準(zhǔn)確表達(dá)配合物與DNA相互作用的強(qiáng)度，可以根據(jù)下列公式求出兩者間的結(jié)合常數(shù)Kb[27]：cDNA/(εA-εF)=cDNA/(εB-εF)+1/[Kb(εB-εF)]，其中εA、εF、εB分別為任意濃度下DNA溶液的摩爾消光系數(shù)、自由配合物的摩爾消光系數(shù)、配合物被DNA完全鍵合時的摩爾消光系數(shù)。根據(jù)方程式線性擬合(圖6插圖)，通過斜率和截距計算出配合物2的結(jié)合常數(shù)Kb為1.7×103L·mol-1；并且該結(jié)合常數(shù)值與文獻(xiàn)[28-29]報道的類似配合物與DNA作用的結(jié)合常數(shù)大小相近，因此，配合物2與DNA存在結(jié)合作用。

圖6 配合物2在加入ct-DNA后的紫外可見光譜圖Fig.6 UV-Vis spectra of2 upon addition of ct-DNA

從圖6中可以看出，當(dāng)配合物2與DNA發(fā)生作用時，它們的紫外可見光譜吸收峰表現(xiàn)出了減色和紅移現(xiàn)象，減色率為26.7%，紅移4 nm，減色越明顯表明配合物與DNA相互作用越強(qiáng)[24]。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是配合物通過嵌入作用與DNA結(jié)合后與堿基對發(fā)生π-π堆積，配體的π*空軌道與DNA堿基對的π軌道發(fā)生耦合導(dǎo)致能級下降，耦合后的π*軌道部分填充電子，使其π-π*躍遷幾率減小，從而產(chǎn)生減色效應(yīng)。上述結(jié)果表明配合物2可能通過嵌入作用與雙鏈ct-DNA結(jié)合。

2.6 配合物與DNA-EB作用的熒光光譜研究

圖7為不同濃度的配合物2對DNA-EB復(fù)合體系熒光光譜的影響。從圖上可以看出，隨著配合物2濃度的增加，DNA-EB復(fù)合物體系的熒光逐漸猝滅，說明配合物2與DNA作用后，同EB競爭DNA的結(jié)合位點使EB從DNA分子中游離出來，由此可進(jìn)一步說明它與DNA發(fā)生了嵌入作用，該結(jié)論與紫外可見光譜的測試結(jié)果一致。

圖7 配合物2對DNA-EB體系熒光光譜的影響Fig.7 Effect of complex 2 on fluorescent spectra of DNA-EB system

為了定量地研究配合物與DNA的結(jié)合能力，對于熒光強(qiáng)度I和配合物濃度，采用經(jīng)典Stern-Volmer方程[30]：I0/I=1+KSVccomplex，由曲線擬合推斷其作用屬于靜態(tài)猝滅，計算出配合物2與DNA作用的猝滅常數(shù)KSV為1.0×105L·mol-1，比文獻(xiàn)[28,31]報道的結(jié)合常數(shù)大。KSV的大小定量地反映出配合物與DNA嵌入作用的能力，因此，配合物2與DNA存在較強(qiáng)的嵌入作用。

3 結(jié) 論

合成了2個類salen配體的二苯基錫配合物，2個配合物中配體上相鄰的原子與Sn形成了3個五元螯合環(huán)，中心錫原子均為七配位畸變五角雙錐構(gòu)型。熱分析結(jié)果表明配合物2的骨架結(jié)構(gòu)比配合物1穩(wěn)定。體外抗癌活性結(jié)果顯示，配合物2對癌細(xì)胞NCI-H460、HepG2、MCF7表現(xiàn)出略優(yōu)的抑制活性。利用紫外可見吸收光譜法和熒光光譜法研究配合物2與DNA的相互作用，結(jié)果說明配合物2和DNA采用經(jīng)典的嵌入結(jié)合模型。

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