箭葉淫羊藿中具有HDAC抑制活性的化學(xué)成分研究

胡陽(yáng)亮，黎 歡,3，姬貴梅，沈小玲，魏孝義，符林春，胡英杰*

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心，廣州 510405；2中國(guó)科學(xué)院華南植物園，廣州 510650；廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心，廣州 510405

在真核細(xì)胞內(nèi)，組蛋白去乙?；?HDACs)通過(guò)移除核心組蛋白賴氨酸殘基上的乙?；菇M蛋白恢復(fù)正電性，從而與帶負(fù)電荷的DNA緊密結(jié)合形成結(jié)構(gòu)致密的染色質(zhì)，抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄。HDACs異?；罨湍[瘤發(fā)生、組織發(fā)育異常等疾病密切相關(guān)。已有開(kāi)發(fā)的組蛋白去乙?；敢种苿?HDACi)應(yīng)用于臨床。例如，伏立諾他(SAHA)和Romidpesin已成為皮膚和外周淋巴細(xì)胞瘤治療藥物[1-3]。HDAC抑制劑結(jié)構(gòu)各異，既有短鏈脂肪酸類的丁酸、曲古菌素A(trichostatin A)，環(huán)肽類的romidepsin，也包括黃酮類的染料木素、山奈酚，是新藥發(fā)現(xiàn)的一個(gè)熱點(diǎn)[4,5]。淫羊藿是一種補(bǔ)腎健骨中藥，有強(qiáng)肌健骨、抗風(fēng)濕、增進(jìn)肝腎等功效[6]；藥理研究揭示了淫羊藿藥材在增強(qiáng)性功能、調(diào)節(jié)激素、調(diào)節(jié)免疫、防治骨質(zhì)疏松癥等方面的作用[7,8]。淫羊藿藥材含有140余種不同類型的黃酮類成分[9-11]，但罕有基于HDAC抑制機(jī)制研究淫羊藿抗骨質(zhì)疏松活性成分的研究報(bào)道[4,9]。本文報(bào)道我們?cè)诨钚允聚欀笇?dǎo)下對(duì)箭葉淫羊藿HDAC抑制活性成分篩選和鑒定的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

中藥對(duì)照品：淫羊藿苷(批號(hào)110737-200415)和山奈酚(批號(hào)110861-200405)(中國(guó)藥品生物制品鑒定所)。植物樣品：采于四川省綿陽(yáng)，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)胡英杰研究員鑒定為箭葉淫羊藿(Epimediumsagittatum(Sieb.Et Zucc.)Maxim，標(biāo)本存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心中藥新藥發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室，編號(hào)YYH No.15)。色譜材料：GF254薄層(10～40 μm)硅膠預(yù)制板、柱層析硅膠(200～300目)(青島海洋化工廠)；D101大孔吸附樹(shù)脂(河北滄州樹(shù)脂廠)；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(50 μm)(美國(guó)GE Healthcare公司)；色譜純?nèi)軇?美國(guó)默克公司)；分析純?nèi)軇?國(guó)產(chǎn))。TLC顯色劑：6%香草醛乙醇溶液與12%高氯酸水溶液等體積混勻后噴霧、加熱。生物活性分析材料：HDAC抑制劑篩選試劑盒(貨號(hào)K340-100)、HDAC1、HDAC2和HDAC11一抗(美國(guó)Biovision公司)；RIPA裂解緩沖液和BCA蛋白分析試劑盒(上海碧云天)；CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(日本同仁化學(xué))，RPMI 1640培養(yǎng)基(以色列BI公司)。南美來(lái)源小牛血清(美國(guó)Gibco公司)；HDAC3～10、辣根過(guò)氧化物酶-綴合二抗(羊抗兔或鼠IgG H&L)(美國(guó)Abcam公司)；GAPDH和β-actin的一抗(北京中山金橋生物科技公司)。

1.2 主要儀器

DRX-400核磁共振儀(德國(guó)布魯克公司)，C506-Triple TOF 5600 System質(zhì)譜儀(美國(guó)AB SCIEX公司)，LC6000制備HPLC儀(北京創(chuàng)新通恒科技公司)和配置DAD檢測(cè)器與Phenomenex ODS柱(Luna，250 mm × 4.6 mm，5 μm)的1260HPLC儀(美國(guó)安捷倫公司)，C-DiGit化學(xué)發(fā)光成像儀和BioTek的Synergy HT多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Li-Cor公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 提取與成分分離

箭葉淫羊藿葉干燥粗粉(2.0 kg)用70%乙醇回流提取3次，提取液減壓蒸除溶劑得醇提物稠膏。將稠膏加水懸浮，依次用石油醚(PE)、二氯甲烷(CH2Cl2)、乙酸乙酯(EtOAc)和正丁醇(n-BuOH)充分萃取，萃取液減壓蒸干得各溶劑部位：14.8 g(PE)、21.6 g(CH2Cl2)、25.4 g(EtOAc)和76.4 g(n-BuOH)。取EtOAc部位(17.4 g)經(jīng)D101大孔吸附樹(shù)脂柱吸附，以含乙醇0、20%、40%、60%、80%和95%(V/V)的水溶液依次洗脫，得水洗脫部位1.16 g，20%、40%、60%、80%和95%乙醇洗脫部位1.75、5.57、4.68、0.94和1.11 g。取60%乙醇洗脫部位4.6 g進(jìn)行柱層析分離純化：依次經(jīng)過(guò)200～300 目硅膠柱層析、氯仿-甲醇(95∶5→7∶3)洗脫；C-18烷化硅膠反相層析、甲醇-水(5∶5→8∶2)洗脫；制備高效液相色譜柱層析、乙腈-水-甲酸(20∶80∶0.1→30∶70∶0.1)洗脫；以及Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱層析、甲醇洗脫，獲得化合物1(9.8 mg)、3(4.0 mg)、4(5.1 mg)、5(40.6 mg)、6(6.4 mg)、7(5.1 mg)、8(5.2 mg)、9(8.2 mg)和10(4.3 mg)。40%乙醇洗脫物5.5 g依次進(jìn)行C-18烷化硅膠反相層析、甲醇-水(3∶7→7∶3)洗脫，以及Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱層析、甲醇洗脫，獲得化合物11(5 mg)和2(6.1 mg)。

1.3.2 HDAC酶抑制活性的篩選評(píng)價(jià)

將待測(cè)試樣品溶于DMSO制成儲(chǔ)備液(儲(chǔ)備液濃度：提取物，20 mg/mL；化合物，20 mM)，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。PE和CH2Cl2部位不溶于DMSO，未進(jìn)行HDAC活性實(shí)驗(yàn)?；钚詼y(cè)定時(shí)，取儲(chǔ)備液加超純水稀釋至設(shè)定濃度，用HDAC抑制劑藥物篩選試劑盒按手冊(cè)說(shuō)明操作進(jìn)行測(cè)定[12]?；驹恚涸噭┖兴琀DAC底物有一條乙?；嚢彼醾?cè)鏈，當(dāng)其被HDAC去乙酰后，賴氨酸側(cè)鏈與賴氨酸顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生熒光團(tuán)而被檢測(cè)到；用檢測(cè)的熒光強(qiáng)度反映HDAC的酶活性，而HDACi可抑制去乙?；磻?yīng)產(chǎn)生的熒光。實(shí)驗(yàn)以試劑盒提供的曲古霉素A為HDACi陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)測(cè)試藥物濃度設(shè)置兩個(gè)復(fù)孔。70%乙醇提取物設(shè)定工作濃度為1.0、0.5和0.25 mg/mL；EtOAc或n-BuOH部位設(shè)定工作濃度為400、200和100 μg/mL。分別檢測(cè)對(duì)HDAC活性的抑制率。

1.3.3 活性部位分離得到的化合物對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞活力的影響

1.3.4 活性部位分離得到的化合物對(duì)HeLa細(xì)胞表達(dá)HDAC的影響

將10 mL密度為5 × 104細(xì)胞/mL的HeLa細(xì)胞懸液置于10 cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)24 h，使貼壁。更換培養(yǎng)液為含有不同濃度測(cè)試樣品的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，加入RIPA 裂解緩沖液使細(xì)胞裂解，提取總蛋白，并用BCA蛋白定量試劑盒定量。取30 μg蛋白樣品進(jìn)行10% SDS-PAGE 凝膠電泳，100V下移至PVDF膜。PVDF膜用5%脫脂奶粉封膜后，加5%脫脂奶粉-TBST稀釋的一抗(稀釋倍數(shù)見(jiàn)表1)，4 ℃搖床孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，加3%脫脂奶 TBST稀釋的二抗(稀釋倍數(shù)見(jiàn)表1)，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗膜3次，C-DiGit化學(xué)發(fā)光成像儀記錄圖像。

表1 抗體稀釋倍數(shù)Table 1 Dilution ratios for the antibody

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 箭葉淫羊藿70%乙醇提取物及其溶劑部位的HDAC抑制活性

用HDAC抑制劑篩選試劑盒測(cè)試了箭葉淫羊藿70%乙醇提取物對(duì)HDAC活性的抑制效果，發(fā)現(xiàn)其在0.25～1.0 mg/mL工作濃度時(shí)對(duì)HDAC活性的抑制率為36.0%～73.9%，抑制作用具有劑量依賴性(見(jiàn)表2)。為了進(jìn)一步富集其活性成分，將70%乙醇提取物分成了不同的溶劑提取部位。其中，EtOAC部位和n-BuOH部位的水溶性相對(duì)較好，可采用HDAC 抑制劑篩選試劑盒進(jìn)行HDAC抑制活性評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，EtOAc部位在100～400 μg/mL工作濃度下對(duì)HDAC活性的抑制率是24.3%～58.9%，抑制效果強(qiáng)于相同濃度的n-BuOH部位(抑制率18.5%～42.0%)(見(jiàn)圖1A)，因此選擇EtOAc部位做進(jìn)一步活性成分富集。EtOAc部位經(jīng)D101大孔樹(shù)脂柱處理得到不同濃度的乙醇洗脫物。測(cè)試了這些洗脫物對(duì)HDAC活性的抑制率，結(jié)果見(jiàn)圖1B。在50～200 μg/mL濃度下，40%和60%乙醇洗脫物的HDAC抑制率為15%～34%，高于80%和20%乙醇洗脫物的抑制率(15%～22%)；水和95%EtOH洗脫物對(duì)HDAC無(wú)活性。因此，選取大孔樹(shù)脂40%和60%乙醇洗脫物作為富含HDAC抑制活性成分的有效部位并進(jìn)行活性成分鑒定和評(píng)價(jià)。

表2 箭葉淫羊藿70%乙醇提取物(EE-70)對(duì)HDAC活性的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of the 70% ethanol extract of E.sagittatum (EE-70) on HDAC activity

圖1 箭葉淫羊藿提取物不同溶劑萃取部位(A)、EtOAc萃取部位的D101柱不同洗脫物(B)對(duì)HDAC活性的抑制作用Fig.1 HDAC Inhibitory effects of different solvent fractions of 70% ethanol extract of E.sagittatum (A) and the solvent eluates from D101 column of the EtOAc fraction (B)

2.2 從HDAC-抑制活性部位分離到的單體成分的鑒定

化合物1～10皆為黃色粉末，鹽酸-鎂粉反應(yīng)均呈陽(yáng)性，推測(cè)為黃酮類化合物。將它們的NMR和MS數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析，分別鑒定為：槲皮素(1)、牡荊苷(2)、山奈酚-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(3)、山奈酚-3-O-β-D-木吡喃糖苷(4)、山奈酚-3-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(5)、山奈酚-3-O-(6″-O-乙酰)-β-D-葡萄吡喃糖苷(6)、山奈酚-3-O-(6″-O-(E)-對(duì)-香豆?；?-β-D-葡萄吡喃糖苷(7)、山奈酚-3-O-(2″，4″-雙-O-(E)-對(duì)-香豆?；?-β-D-葡萄吡喃糖苷(8)、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(9)和異鼠李素-3-O-β-D-木吡喃糖苷(10)。

化合物1TLC斑點(diǎn)的顯色和Rf值與槲皮素對(duì)照品相一致；ESI-MS：m/z303.7 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.50(1H，s，5-OH)，7.67(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2′)，7.54(1H，dd，J= 8.6，2.0 Hz，H-6′)，6.88(1H，d，J= 8.6 Hz，H-5′)，6.40(1H，d，J= 2.0 Hz，H-8)，6.18(1H，d，J= 2.0 Hz，H-6)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：175.8(C-4)，163.9(C-7)，160.7(C-5)，156.1(C-9)，147.9(C-3′)，146.7(C-2)，145.0(C-4′)，135.7(C-3，-5′)，121.9(C-1′)，115.6(C-6′)，115.0(C-2′)，102.9(C-10)，98.2(C-6)，93.3(C-8)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致，故鑒定為槲皮素。

化合物2根據(jù)ESI-MS：m/z455.1 [M+Na]+、433.5 [M+H]+、431.2 [M-H]-，以及NMR數(shù)據(jù)推導(dǎo)出分子式為C21H20O10；結(jié)合不飽和度為12推測(cè)該化合物為黃酮苷；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：13.18 (1H，s，5-OH)，8.03(2H，d，J= 8.3 Hz，H-2′，6′)，6.89(2H，d，J= 8.3 Hz，H-3′，5′)，6.78 (1H，s，H-3)，6.27(1H，s，H-6)，4.68(1H，d，J= 9.0 Hz，H-1″)，3.84(1H，t，J= 9.0 Hz，H-2″)，3.70(2H，m，H-6″)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：181.9(C-4)，163.7(C-2)，162.7(C-7)，161.0(C-5)，160.2(C-4′)，155.8(C-9)，128.8(C-2′，6′)，121.4(C-1′)，115.6(C-3′，5′)，104.4(C-8)，103.7(C-10)，102.2(C-3)，98.0(C-6)，81.7(C-5″)，78.5(C-2″)，73.2(C-1″)，70.7(C-3″)，70.3(C-4″)，61.1(C-6″)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致，故鑒定為牡荊苷。

化合物3根據(jù)ESI-MS：m/z441.4 [M+Na]+、457.1 [M+K]+、859.3 [2M+Na]+、417.0 [M-H]-，以及NMR數(shù)據(jù)推導(dǎo)分子式為C20H18O10；結(jié)合不飽和度為12推測(cè)其為黃酮苷；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.55(1H，s，5-OH)，8.03(2H，d，J= 8.6 Hz，H-2′，6′)，6.87(2H，d，J= 8.6 Hz，H-3′，H-5′)，6.26(1H，br s，H-8)，6.04(1H，br s，H-6)，5.30(1H，d，J= 5.1 Hz，H-1″)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：176.8(C-4)，168.4(C-7)，161.2(C-5)，160.4(C-4′)，156.7(C-9)，155.3(C-2)，133.2(C-3)，130.7(C-2′，6′)，120.6(C-1′)，115.3(C-3′，5′)，102.4(C-10)，101.4(C-1″)，99.9(C-6)，93.9(C-8)，71.7(C-2″)，70.8(C-3″)，66.1(C-4″)，64.3(C-5″)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致，故鑒定為山奈酚-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷。

化合物4根據(jù)ESI-MS：m/z441.5 [M+Na]+、457.3 [M+K]+、859.3 [2M+Na]+、417.5 [M-H]-，以及NMR數(shù)據(jù)推導(dǎo)分子式為C20H18O10；結(jié)合不飽和度為12推測(cè)其為黃酮苷；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.59(1H，s，5-OH)，8.03(2H，d，J= 8.7 Hz，H-2′，6′)，6.90(2H，d，J= 8.7 Hz，H-3′，5′)，6.44(1H，br s，H-8)，6.20(1H，br s，H-6)，5.34(1H，d，J= 7.0 Hz，H-1″)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：177.3(C-4)，164.7(C-7)，161.2(C-5)，160.1(C-4′)，156.4(C-9)，156.1(C-2)，133.2(C-3)，130.8(C-2′，6′)，120.7(C-1′),115.3(C-3′，5′)，103.8(C-10)，101.7(C-1″)，98.8(C-6)，93.7(C-8)，75.8(C-3″)，73.7(C-2″)，69.4(C-4″)，65.9(C-5″)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[17]報(bào)道一致，故鑒定為山奈酚-3-O-β-D-木吡喃糖苷。

化合物5根據(jù)ESI-MS：m/z471.2 [M+Na]+、487.2 [M+K]+、447.1 [M-H]-，以及NMR數(shù)據(jù)推導(dǎo)分子式為C21H20O11；結(jié)合不飽和度為12推測(cè)其為黃酮苷；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.6(1H，s，5-OH)，8.02(2H，d，J= 9.0 Hz，H-2′，6′)，6.88(2H，d，J= 9.0 Hz，H-3′，5′)，6.43(1H，d，J= 2.0 Hz， H-8)，6.20(1H，d，J= 2.0 Hz，H-6)，5.47(1H，d，J= 7.0 Hz，H-1″)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：177.5(C-4)，164.6(C-7)，161.2(C-5)，160.0(C-4′)，156.4(C-2)，156.2(C-9)，133.1(C-3)，130.9(C-2′，6′)，120.9(C-1′)，115.2(C-3′，-5′)，103.9(C-10)，100.9(C-1″)，98.8(C-6)，93.7(C-8)，77.5(C-5″)，76.4(C-3″)，74.2(C-2″)，69.9(C-4″)，60.8(C-6″)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[18,19]報(bào)道一致，故鑒定為山奈酚-3-O-β-D-葡萄吡喃糖苷。

化合物6根據(jù)ESI-MS：m/z513.2 [M+Na]+、529.4 [M+K]+、489.5 [M-H]-，以及NMR數(shù)據(jù)推導(dǎo)出分子式為C23H22O12；結(jié)合不飽和度為13推測(cè)其為黃酮苷；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.59(1H，s，5-OH)，8.00(1H，d，J= 8.8 Hz，H-2′，6′)，6.87(1H，d，J= 8.8 Hz，H-3′，5′)，6.42(1H，br s，H-8)，6.19(1H，br s，H-6)，5.36(1H，d，J= 7.3 Hz，H-1″)，4.10(1H，d，J= 11.0 Hz，Ha-6″)，3.95(1H，dd，J= 11.0，5.9 Hz，Hb-6″)，2.09(3H，s，CH3CO)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：177.2(C-4)，169.8(CH3CO)，165.3(C-7)，161.1(C-5)，160.1(C-4′)，156.5(C-2，9)，133.0(C-3)，130.8(C-2′，6′)，120.7(C-1′)，115.1(C-3′，5′)，103.5(C-10)，101.2(C-1″)，99.0(C-6)，93.8(C-8)，76.1(C-3″)，74.1(C-2″)，73.9(C-5″)，69.8(C-4″)，62.8(C-6″)，20.1(CH3CO)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[18,20]報(bào)道一致，故鑒定為的山奈酚-3-O-(6″-O-乙酰)-β-D-葡萄吡喃糖苷。

化合物7根據(jù)ESI-MS：m/z593.6 [M-H]-以及NMR數(shù)據(jù)推導(dǎo)出分子式為 C30H26O13；結(jié)合不飽和度為18推測(cè)其為黃酮苷；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.57(1H，s，5-OH)，7.99(1H，d，J= 8.8 Hz，H-2′，6′)，7.37(1H，d，J= 8.3 Hz，H-2?，6?)，7.32(1H，d，J= 15.9 Hz，H-7?)，6.86(1H，d，J= 8.8 Hz，H-3′，5′)，6.79(1H，d，J= 8.3 Hz，H-3?，5?)，6.37(1H，br s，H-8)，6.12(1H，d，J= 15.9 Hz，H-8?)，6.10(1H，br s，H-6)，5.45(1H，d，J= 7.3 Hz，H-1″)，4.27(1H，d，J= 12.0 Hz，Ha-6″)，4.03(1H，dd，J= 12.0，6.3 Hz，Hb-6″)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：177.3(C-4)，166.2(C-9?)，164.8(C-7)，161.1(C-5)，160.0(C-4′)，159.9(C-4?)，156.4(C-2)，156.3(C-9)，144.6(C-7?)，133.0(C-3)，130.8(C-2′，6′)，130.2(C-2?，6?)，124.9(C-1?)，120.7(C-1′)，115.8(C-3?，5?)，115.1(C-3′，5′)，113.6(C-8?)，103.6(C-10)，101.0(C-1″)，99.0(C-6)，93.7(C-8)，76.2(C-3″)，74.2(C-2″)，74.1(C-5″)，69.9(C-4″)，63.0(C-6″)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[19]報(bào)道一致，故鑒定為山奈酚-3-O-(6″-O-(E)-對(duì)-香豆?；?-β-D-葡萄吡喃糖苷。

化合物8根據(jù)ESI-MS：m/z763.4 [M+Na]+、779.3 [M+K]+、739.5 [M-H]-，以及NMR數(shù)據(jù)推導(dǎo)出分子式為C39H32O15；結(jié)合不飽和度為24推測(cè)其為黃酮苷；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.58(1H，s，5-OH)，7.97(2H，d，J= 8.8 Hz，H-2′，6′)，7.62(1H，d，J= 16.0 Hz，H-7′′′′)，7.39(4H，d，J= 8.4 H，H-2?，6?，2′′′′，6′′′′)，7.36(1H，d，J= 16.0 Hz，H-7?)，6.86(2H，d，J= 8.8 Hz，H-3′，5′)，6.80(4H，d，J= 8.4 Hz，H-3?，5?，3′′′′，5′′′′)，6.44(1H，d，J= 16.0 Hz，H-8″″)，6.37(1H，d，J= 1.9 Hz，H-8)，6.15(1H，d，J= 16.0 Hz，H-8?)，6.13(1H，d，J= 1.9 Hz，H-6)，5.73(1H，d，J= 8.8 Hz，H-1″)，5.51(1H，t，J= 5.5 Hz，H-4″)，4.92(1H，t，J= 8.8 Hz，H-2″)，4.30(1H，d，J= 12.0 Hz，Ha-6″)，4.05(1H，dd，J= 12.0，6.2 Hz，Hb-6″)，3.57(1H，m，H-3″)，3.53(1H，m，H-5″)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：177.1(C-4)，166.1、165.8(C-9?，9′′′′)，164.1(C-7)，161.0(C-5)，160.0(C-4′)，159.8(C-4?，4′′′′)，156.4(C-2)，156.3(C-9)，145.1、144.7(C-7?，7′′′′)，132.5(C-3)，130.3、130.2(C-2′，6′，2?，6?，2′′′′，6′′′′)，125.1、124.9(C-1?，1′′′′)，120.6(C-1′)，115.7(C-3′，5′)，115.1(C-3?，5?，3′′′′，5′′′′)，114.2、113.6(C-8?，8′′′′)，103.8(C-10)，98.7(C-1″)，98.2(C-6)，93.6(C-8)，74.3(C-3″)，73.8(C-2″，4″)，70.1(C-5″)，62.7(C-6″)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[21]報(bào)道一致，故鑒定為山奈酚-3-O-(2″，4″-雙-O-(E)-對(duì)-香豆酰基)-β-D-葡萄吡喃糖苷。

化合物9根據(jù)ESI-MS：m/z501.2 [M+Na]+、517.2 [M+K]+、477.0 [M-H]-，以及NMR數(shù)據(jù)推導(dǎo)出分子式為C22H22O12；結(jié)合不飽和度為12推測(cè)其為黃酮苷；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.6(1H，s，5-OH)，7.95(1H，d，J= 1.5 Hz，H-2′)，7.48(1H，dd，J= 8.4，1.5 Hz，H-6′)，6.91(1H，d，J= 8.4 Hz，H-5′)，6.40(1H，br s，H-8)，6.18(1H，br s，H-6)，5.57(1H，d，J= 7.1 Hz，H-1″)，3.84(3H，s，3′-OCH3)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：177.3(C-4)，165.1(C-7)，161.2(C-5)，156.5(C-9)，156.1(C-2)，149.4(C-4′)，146.9(C-3′)，132.9(C-3)，122.0(C-6′)，121.1(C-1′)，115.2(C-5′)，113.5(C-2′)，103.7(C-10)，100.8(C-1″)，99.0(C-6)，93.9(C-8)，77.5(C-5″)，76.4(C-3″)，74.4(C-2″)，69.8(C-4″)，60.6(C-6″)，55.7(OCH3)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[18,20]報(bào)道一致，故鑒定為異鼠李素-3-O-β-D-葡萄吡喃糖苷。

化合物10根據(jù)ESI-MS：m/z471.2 [M+Na]+、487.5 [M+K]+、477.0 [M-H]-，以及NMR數(shù)據(jù)推導(dǎo)出分子式為C21H20O11；結(jié)合不飽和度為12推測(cè)其為黃酮苷；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.5(1H，s，5-OH)，7.86(1H，d，J= 1.8 Hz，H-2′)，7.54(1H，dd，J= 8.4，1.8 Hz，H-6′)，6.91(1H，d，J= 8.4 Hz，H-5′)，6.34(1H，br s，H-8)，6.11(1H，br s，H-6)，5.36(1H，d，J= 7.1 Hz，H-1″)，3.83(3H，s，3′-OCH3)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：177.2(C-4)，165.1(C-7)，161.1(C-5)，156.4(C-9)，156.0(C-2)，149.6(C-4′)，147.0(C-3′)，132.9(C-3)，122.2(C-6′)，120.9(C-1′)，115.3(C-5′)，113.1(C-2′)，103.6(C-10)，101.8(C-1″)，99.0(C-6)，93.9(C-8)，76.0(C-3″)，74.0(C-2″)，69.5(C-4″)，66.0(C-5″)，55.6(OCH3)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[22]報(bào)道一致，故鑒定為異鼠李素-3-O-β-D-木吡喃糖苷。

化合物11為白色粉末；根據(jù)ESI-MS：m/z515.3 [M+Na]+、531.3 [M+K]+和491.3 [M-H]-，以及NMR數(shù)據(jù)推測(cè)分子式為C25H32O10；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：1.69(1H，m，H-8′)，1.88(1H，m，H-8)，2.72(2H，m，H-7)，2.99(1H，m，H-7′)，3.71(6H，s，OCH3× 2)，3.91(1H，d，J= 8.0 Hz，Ha-9′)，4.02(1H，d，J= 8 Hz，H-1″)，6.07(1H，s，H-5)，6.47(1H，dd，J= 8.0，1.6 Hz，H-6′)，6.60(1H，s，H-2)，6.69(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5′)，6.80(1H，d，J= 1.6 Hz，H-2′)，4.42、4.99、4.99、5.25、8.76和8.45(各1H，br s，OH × 6)。13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：145.5(C-3)，147.1(C-3′)，144.1(C-4)，144.5(C-4′)，132.6(C-1)，136.9(C-1′)，121.1(C-6′)，127.0(C-6)，115.5(C-5′)，116.3(C-5)，111.8(C-2′)，113.9(C-2)，62.6(C-9)，69.6(C-9′)，45.6(C-7′)，44.1(C-8′)，32.6(C-7)，37.6(C-8)，104.6(C-1″)，73.4(C-2″)，76.6(C-3″)，67.3(C-4″)，65.7(C-5″)，55.5、55.6(OCH3× 2)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[23,24]報(bào)道一致，故鑒定為schizandriside。

2.3 活性部位所得成分對(duì)HDAC活性的抑制作用

我們檢測(cè)了上述11個(gè)化合物以及淫羊藿藥材指標(biāo)成分淫羊藿苷在工作濃度為200、100和50 μM時(shí)對(duì)HDAC活性的抑制率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在200 μM濃度下，十個(gè)黃酮類成分的HDAC抑制活性都高于淫羊藿苷(抑制率15.4%)，其中5個(gè)黃酮苷(化合物3～6和9)的HDAC抑制率為39.6%～54.5%，明顯高于其他5個(gè)黃酮成分(抑制率 < 30%)；木脂素schizandriside (11)無(wú)HDAC抑制活性(見(jiàn)表3)。

表3 化合物1～11對(duì)HDAC酶活性的抑制作用(n = 2)Table 3 Inhibitory effects of compounds 1-11 on HDAC activity (n = 2)

鑒于山奈酚-3-O-單糖苷(3～5)顯示了較好的HDAC抑制活性，且文獻(xiàn)報(bào)道其苷元山奈酚為HDAC抑制劑[7]，我們進(jìn)一步比較了這三個(gè)化合物和山奈酚在100、50、25 μM濃度時(shí)的HDAC抑制率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物3、4和5在100 μM時(shí)的HDAC抑制率分別為38.7%、31.3%和26.5%，均高于山奈酚(抑制率21.1%)(見(jiàn)表4)。

表4 化合物3～5和山奈酚對(duì)HDAC活性的抑制作用(n = 2)Table 4 Inhibitory rates of compounds 3-5 and kaempferol on HDAC activity (n = 2)

2.4 山奈酚-3-O-單糖苷(3～5)對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞內(nèi)HDAC蛋白表達(dá)的抑制作用

上述結(jié)果說(shuō)明測(cè)試樣品可直接作用于HDAC從而抑制其酶活性。對(duì)HDAC的抑制作用還可通過(guò)抑制HDAC蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)來(lái)完成。隨后我們以人宮頸癌細(xì)胞HeLa為模型測(cè)試山奈酚-3-O-單糖苷3～5對(duì)HDAC蛋白表達(dá)是否也具有抑制作用。首先測(cè)試了3～5在不同濃度下與HeLa細(xì)胞共孵育48 h時(shí)對(duì)細(xì)胞活力的影響，結(jié)果見(jiàn)表5?；衔?、4和5在100 μM時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率分別是28.0%、6.2%和10.5%，總體上對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響較弱。在此基礎(chǔ)上測(cè)試了100和50 μM濃度的3～5作用于HeLa細(xì)胞24 h，對(duì)細(xì)胞中HDAC1-11(I、II和IV類HDAC)表達(dá)的影響。如圖2所示，所有化合物對(duì)I類HDAC(HDAC1/2/3/8)表達(dá)無(wú)影響，但幾乎完全地抑制了II類HDAC中的HDAC6的表達(dá)；化合物5還能明顯抑制HDAC10(II類HDAC)的表達(dá)；化合物4則顯著抑制所有的II類HDAC(HDAC4～7、9、10)和IV類HDAC(HDAC11)的表達(dá)，且作用具有劑量依賴性。因此，化合物4和5可作為新發(fā)現(xiàn)的HDAC抑制劑進(jìn)行進(jìn)一步研究。

表5 山奈酚-3-O-單糖苷(3～5)對(duì)宮頸癌HeLa 細(xì)胞增殖活力的影響Table 5 Effects of kaempferol-3-O-monoglycosides (3-5) on the viability of HeLa cells = 3)

圖2 山奈酚-3-O-單糖苷(3～5)對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞 表達(dá)HDAC1～11的影響Fig.2 Effects of kaempferol-3-O-monoglycosides (3-5) on the expression of HDAC1-11 in HeLa cells

3 討論和結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)確定了箭葉淫羊藿70%乙醇提取物抑制HDAC活性較強(qiáng)的溶劑部位是乙酸乙酯部位，該部位用D101大孔吸附樹(shù)脂處理，40%和60%乙醇洗脫物為HDAC抑制活性部位(見(jiàn)圖1)；通過(guò)活性指導(dǎo)下的柱層析分離和波譜分析，從中鑒定了11個(gè)化合物。其中，非異戊烯取代的黃酮苷元(化合物1)和黃酮苷(化合物2～10)類成分全部顯示了比淫羊藿苷更強(qiáng)的HDAC抑制活性，說(shuō)明這一類成分是該植物抑制HDAC活性的主要活性成分。分離到的9種黃酮苷中有6種是山奈酚-3-O-單糖苷，包括得率較高的化合物5(山奈酚-3-O-β-D-葡萄吡喃糖苷)，說(shuō)明山奈酚-3-O-單糖苷擁有相對(duì)較強(qiáng)的HDAC抑制活性?；钚暂^低的化合物有7和8，由于糖基上一或兩個(gè)羥基被對(duì)-香豆酸酯化，7和8的HDAC抑制活性低于異鼠李素-3-O-單糖苷(9和10)，說(shuō)明山奈酚-3-O-單糖苷糖基被對(duì)-香豆酸酯化可減弱HDAC抑制活性(見(jiàn)表3)。但由于HDAC抑制劑篩選試劑盒提供的HDAC提取自HeLa的細(xì)胞核，是包含不同亞型HDAC的混合物，箭葉淫羊藿中分到的這些黃酮成分究竟抑制的是哪一種或哪幾種HDAC的活性(功能)還需進(jìn)一步研究方能得知。

如前所述，HDAC的抑制還可通過(guò)調(diào)節(jié)其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)達(dá)成。我們采用HeLa細(xì)胞進(jìn)行的研究顯示(見(jiàn)圖2)，山奈酚-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(3)、山奈酚-3-O-β-D-木吡喃糖苷(4)和山奈酚-3-O-β-D-葡萄吡喃糖(5)對(duì)I類HDAC表達(dá)無(wú)明顯影響，但能明顯抑制II型HDAC中的HDAC6(化合物3、4和5)和HDAC10(化合物4和5)的蛋白表達(dá)，是新發(fā)現(xiàn)的黃酮類HDAC蛋白表達(dá)抑制劑；其中4同時(shí)抑制其他II類(HDAC4～7)和IV類(HDAC9～11)HDAC的蛋白表達(dá)，其作用值得深入研究。

HDAC通過(guò)對(duì)核心組蛋白的去乙?；瘡亩鴫褐铺囟ɑ虻霓D(zhuǎn)錄，在細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期進(jìn)程和生長(zhǎng)發(fā)育活動(dòng)等不同階段中發(fā)揮重要作用。選擇性HDACi可作用于過(guò)度表達(dá)的HDAC，使被其壓制的基因得以正常表達(dá)，從而在治療腫瘤、關(guān)節(jié)炎、組織發(fā)育不良等疾病方面發(fā)揮作用。例如，HDAC1/2(I型)介導(dǎo)DNA損傷修復(fù)，在肺癌、胃癌等多種癌組織高表達(dá)。在對(duì)腫瘤進(jìn)行放射性治療時(shí)，同時(shí)使用HDAC1/2的抑制劑可阻止腫瘤細(xì)胞進(jìn)行DNA修復(fù)從而促使癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[25]。HDAC8(I型)和HDAC10(II型)的異常表達(dá)是神經(jīng)母細(xì)胞瘤的進(jìn)展和惡變的標(biāo)志，HDAC6/8/10抑制劑TH34可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、有絲分裂中斷和細(xì)胞周期阻滯，以此引起腫瘤細(xì)胞死亡；TH34與維甲酸聯(lián)用可產(chǎn)生協(xié)同效果[26]。HDAC4/6/7(II型)的表達(dá)上調(diào)會(huì)造成成骨細(xì)胞分化過(guò)程中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osterix表達(dá)下調(diào)，從而不利于成骨細(xì)胞的形成[27]；HDAC6基因和蛋白表達(dá)的上調(diào)也會(huì)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞原纖毛變形和縮短，纖毛細(xì)胞數(shù)量減少，從而抑制成骨細(xì)胞的ALP功能，有效阻止骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞成熟[28]。抑制HDAC6和HDAC4的表達(dá)或功能，將有利于成骨細(xì)胞分化和骨形成，保護(hù)骨密度。

本研究數(shù)據(jù)首次揭示，箭葉淫羊藿中的山奈酚-3-O-單糖苷(化合物3、4和5)具有明確的HDAC抑制劑樣作用，三者對(duì)HDAC6蛋白表達(dá)的抑制作用，為將其識(shí)別為淫羊藿藥材中潛在的具有山奈酚-3-O-單糖苷結(jié)構(gòu)特征的抗骨質(zhì)疏松癥抗腫瘤有效成分，提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。