不同產(chǎn)地苦蕎麥中黃酮類成分的含量測(cè)定與分析

（勁牌生物醫(yī)藥有限公司，中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北大冶435100）

苦蕎麥為蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬植物苦蕎麥（Fagopyrum tataricum L.Gaertn）的干燥成熟種子，又名野蕎麥、韃靼蕎、萬年蕎、野南蕎[1]?！侗静菥V目》中記載：苦蕎麥味苦、性平寒，有益氣力、續(xù)精神、利耳目、降氣、寬腸健胃的作用。苦蕎麥營(yíng)養(yǎng)豐富，含有黃酮類化合物（如蘆丁、槲皮素、山萘酚等，其中蘆丁含量較多）、多種氨基酸、肌醇衍生物、多糖、不飽和脂肪酸及多種微量元素等成分[2-7]?，F(xiàn)代藥理研究表明，苦蕎麥具有抗氧化、抗腫瘤、抗敏、抗菌、抗病毒、降血脂、降血壓等作用[8-11]。苦蕎麥主要集中種植在我國(guó)西南地區(qū)的四川、云南、陜西、甘肅、山西、貴州等省的高海拔山區(qū)、高原和高寒地區(qū)[12]，四川涼山和云南昭通地區(qū)為主要產(chǎn)地。試驗(yàn)建立苦蕎麥中蘆丁、槲皮素、山奈酚、山奈酚-3-o-蕓香糖苷4種黃酮類成分的含量測(cè)定方法，選用四川、云南重點(diǎn)產(chǎn)區(qū)及貴州、陜西產(chǎn)地的苦蕎麥樣品，分別對(duì)其中的4種黃酮類成分進(jìn)行含量測(cè)定與對(duì)比，為苦蕎麥原料的采購(gòu)提供技術(shù)依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 儀器與設(shè)備

1200型高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技公司；AB135-S型電子天平：梅特勒-托利多公司；W3-100SP型恒溫水浴鍋：上海申生公司。

1.2 材料與試劑

苦蕎麥樣品（采自不同產(chǎn)地）：直接在產(chǎn)地收集；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：100080-201610，純度：91.9%）、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：100081-200907，純度 96.5%）、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：100861-201310，純度 93.2%）、山奈酚-3-o-蕓香糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：100083-201509）：中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈（色譜純）：Fisher Chemical；磷酸（色譜純）：Honeywell；無水乙醇（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

液相色譜條件：紫外檢測(cè)器，Sepex C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相；按照表1條件進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm，流速 1.0 mL/min，進(jìn)樣體積：10 μL，柱溫：30 ℃，上述色譜條件下，蘆丁、山奈酚-3-o-蕓香糖苷、槲皮素、山奈酚對(duì)照品高效液相色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫表Table 1 Gradient elution table

圖1 蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山奈酚混合對(duì)照品高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of a mixture of rutin，quercetin，kaempferol and kaempferol-3-o-rutinoside

2.2 供試品溶液制備

取苦蕎麥樣品粉碎，過四號(hào)篩，精密稱取粉末3 g，精密加入60%乙醇50 mL，稱定重量，90℃水浴回流2 h，取出，冷卻，稱重，并用60%乙醇補(bǔ)足減失的重量，用0.45 μm微孔濾膜過濾后取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 對(duì)照品溶液制備

分別精密稱取蘆丁對(duì)照品47.24 mg于10 mL容量瓶中、山奈酚-3-o-蕓香糖苷對(duì)照品20.89 mg于50 mL容量瓶中、槲皮素對(duì)照品14.51 mg于50 mL容量瓶中、山奈酚對(duì)照9.31 mg于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液，蘆丁、山奈酚-3-o-蕓香糖苷、槲皮素、山奈酚的濃度分別為4 341.356、417.8、280.043、173.538 4 mg/L。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性范圍試驗(yàn)

分別精密吸取2.3項(xiàng)下蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液9 mL、山奈酚-3-o-蕓香糖苷對(duì)照品儲(chǔ)備液8 mL、槲皮素對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL、山奈酚對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，得到混合對(duì)照品使用溶液，其中蘆丁、山奈酚-3-o-蕓香糖苷、槲皮素、山奈酚濃度分別為1 562.888 16、133.696、22.403 44、34.707 68mg/L。分別吸取上述混合對(duì)照品使用溶液0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、5.0、10.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，甲醇稀釋并定容至刻度，用0.45 μm微孔濾膜過濾后作為對(duì)照品溶液。按照2.1色譜條件進(jìn)行色譜分析，經(jīng)色譜分析分別得到各濃度蘆丁、山奈酚-3-o-蕓香糖苷、槲皮素、山奈酚對(duì)照品色譜峰的峰面積，分別以對(duì)照品溶液濃度（x）為橫坐標(biāo)，以對(duì)照品溶液峰面積（Y）為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=9.543 206 76x+82.471 516，R2=0.999 56；山奈酚-3-o-蕓香糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=7.999 238 67x+3.329 378，R2=0.999 84；槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=21.907 088 9x+0.188 849 5，R2=0.999 95；山奈酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=23.426 031 9x+1.950 813 3，R2=0.999 85；結(jié)果表明，蘆丁濃度在15.028 88 mg/L～1 562.888 16 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，山奈酚-3-o-蕓香糖苷在1.336 96 mg/L～133.696 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，槲皮素在0.224 03 mg/L～22.403 44 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，山奈酚的濃度在0.347 08 mg/L～34.707 86 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn)

精密稱取苦蕎麥樣品3.086 7 g，按照2.2方法制備供試品溶液，在2.1色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各成分的色譜峰面積，結(jié)果蘆丁、山奈酚-3-o-蕓香糖苷、槲皮素、山奈酚峰面積的RSD值分別為0.32%、0.31%、0.39%、1.79%，表明儀器的精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取2.4.2供試品溶液，分別在2.1色譜條件下于0、1、2、4、8、12 小時(shí)進(jìn)樣，記錄各成分的色譜峰面積，結(jié)果蘆丁、山奈酚-3-o-蕓香糖苷、槲皮素、山奈酚峰面積的RSD值分別為0.47%、0.45%、0.40%、1.73%，表明供試品溶液在12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取苦蕎麥樣品6份，每份3 g，按照2.2方法制備供試品溶液，在2.1色譜條件下進(jìn)行色譜分析，利用建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算各供試品溶液中各成分的含量。結(jié)果樣品中蘆丁、山奈酚-3-o-蕓香糖苷、槲皮素、山奈酚的平均含量分別為1.884%、0.133%、0.012 7%、0.000 73%，重復(fù)性試驗(yàn)的RSD值分別為1.38%、1.41%、1.61%、2.57%，表明檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性良好。

2.4.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密稱取苦蕎麥樣品6份，每份0.75 g，分別加入相當(dāng)于樣品中蘆丁、山奈酚-3-o-蕓香糖苷、槲皮素、山奈酚含量的80%、100%、120%3個(gè)梯度的對(duì)照溶液各2份，按照2.2方法制備供試品溶液，在2.1色譜條件下進(jìn)行色譜分析，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蘆丁、山奈酚-3-o-蕓香糖苷、槲皮素、山奈酚的含量及回收率。計(jì)算所得蘆丁、山奈酚-3-o-蕓香糖苷、槲皮素、山奈酚的平均回收率分別為98.80%、105.88%、96.08%、107.04%，加標(biāo)回收試驗(yàn)的RSD值分別為3.54%、2.61%、3.47%、3.32%，表明檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度良好。具體數(shù)據(jù)見表2～表5。

表2 蘆丁加標(biāo)回收試驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 2 Data of rutin plus standard recovery test

表3 山奈酚-3-o-蕓香糖苷加標(biāo)回收試驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 3 Data of kaempferol-3-o-rutinoside plus standard recovery test

表4 槲皮素加標(biāo)回收試驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 4 Data of quercetin plus standard recovery test

表5 山奈酚加標(biāo)回收試驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 5 Data of kaempferol plus standard recovery test

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 樣品測(cè)定

按試驗(yàn)方法測(cè)定采自不同產(chǎn)地的苦蕎麥樣品中4種黃酮類成分的含量，樣品產(chǎn)地來源及測(cè)定結(jié)果見表6。

3.2 成分比較

對(duì)各產(chǎn)地苦蕎麥樣品中的有效成分蘆丁、槲皮素、山奈酚、山奈酚-3-o-蕓香糖苷含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)各產(chǎn)地成分含量的最小值、最大值、極差和均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，同時(shí)對(duì)所有樣品的成分含量進(jìn)行趨勢(shì)圖分析。

3.2.1 蘆丁成分

蘆丁含量：主產(chǎn)地比較四川省比云南省略高，其他產(chǎn)地以貴州省略高，整體趨勢(shì)分析各產(chǎn)地的蘆丁含量差別不大，具體數(shù)據(jù)見表7和圖2。

表6 不同產(chǎn)地苦蕎麥黃酮含量測(cè)定結(jié)果Table 6 Results of flavonoids content determination in buckwheat from different areas

表7 蘆丁含量統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)Table 7 Statistics of rutin content

圖2 蘆丁含量分析Fig.2 Analysis of rutin content

3.2.2 槲皮素成分

槲皮素含量：主產(chǎn)地比較四川省比云南省低，整體趨勢(shì)分析云南省槲皮素含量明顯高于其他產(chǎn)地，其他產(chǎn)地的槲皮素含量差別不大，具體數(shù)據(jù)見表8和圖3。

3.2.3 山奈酚成分

山奈酚含量：主產(chǎn)地比較四川省比云南省低，整體趨勢(shì)分析云南省山奈酚含量明顯高于其他產(chǎn)地，其他產(chǎn)地的山奈酚含量差別不大，具體數(shù)據(jù)見表9和圖4。

表8 槲皮素含量統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)Table 8 Statistics of quercetin content

圖3 槲皮素含量分析Fig.3 Analysis of quercetin content

表9 山奈酚含量統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)Table 9 Statistics of kaempferol content

3.2.4 山奈酚-3-o-蕓香糖苷成分

山奈酚-3-o-蕓香糖苷含量：主產(chǎn)地比較四川省和云南省基本一致，其他產(chǎn)地以陜西省略高，整體趨勢(shì)分析各產(chǎn)地的含量差別不大，具體數(shù)據(jù)見表10和圖5。

表10 山奈酚-3-o-蕓香糖苷含量統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)Table 10 Statistics of kaempferol-3-o-rutinoside content

圖4 山奈酚含量分析Fig.4 Analysis of kaempferol content

圖5 山奈酚-3-o-蕓香糖苷含量分析Fig.5 Analysis of kaempferol-3-o-rutinoside content

4 結(jié)論

試驗(yàn)建立苦蕎麥中黃酮類成分蘆丁、槲皮素、山奈酚、山奈酚-3-o-蕓香糖苷含量檢測(cè)方法，并對(duì)該方法進(jìn)行核實(shí)，包括線性范圍試驗(yàn)、精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)及加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果表明該方法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于苦蕎麥中黃酮類成分的含量測(cè)定。同時(shí)通過該方法的建立，改變了目前苦蕎麥只控制蘆丁及總黃酮成分含量的現(xiàn)狀，能夠更加客觀地反映苦蕎麥原料的內(nèi)在質(zhì)量。

通過對(duì)苦蕎麥主產(chǎn)地四川、云南、貴州、陜西產(chǎn)地樣品中4種黃酮類成分的含量測(cè)定與分析比較，發(fā)現(xiàn)各產(chǎn)地樣品中成分存在一定的差異，其中云南產(chǎn)苦蕎麥中槲皮素、山奈酚含量明顯高于其他產(chǎn)地，蘆丁、山奈酚-3-o-蕓香糖苷含量相差不大，為苦蕎麥原料的采購(gòu)及應(yīng)用提供了技術(shù)依據(jù)。