基于ROS/NLRP3/Caspase-1通路的鹿芪方對慢性心力衰竭小鼠心肌細(xì)胞焦亡的影響

張曉青，瞿惠燕，趙丹丹，楊曉利，蘭真真，楊濤，周華

基于ROS/NLRP3/Caspase-1通路的鹿芪方對慢性心力衰竭小鼠心肌細(xì)胞焦亡的影響

張曉青，瞿惠燕，趙丹丹，楊曉利，蘭真真，楊濤，周華

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院心血管研究所，上海 201203

觀察鹿芪方對慢性心力衰竭小鼠心肌細(xì)胞焦亡的影響，從ROS/NLRP3/Caspase-1通路探討其作用機(jī)制。60只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、鹿芪方組、培哚普利組，采用冠狀動脈前降支結(jié)扎法制備慢性心力衰竭小鼠模型。鹿芪方組和培哚普利組分別予相應(yīng)藥液灌胃，假手術(shù)組和模型組予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)6周。超聲檢測小鼠心功能，HE染色、Masson染色檢測小鼠心肌組織病理變化和膠原纖維沉積，DHE熒光探針檢測心肌組織活性氧（ROS）含量，Western blot檢測心肌組織NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)，免疫組化檢測白細(xì)胞介素（IL）-1β表達(dá)，透射電鏡觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)。與假手術(shù)組比較，模型組小鼠左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左室收縮分?jǐn)?shù)（LVFS）降低，左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）與左室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）升高；心肌細(xì)胞明顯增大，排列不規(guī)則，有較多炎性細(xì)胞聚集及膠原纖維沉積；心肌組織ROS含量增加，NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白及IL-1β表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）。與模型組比較，鹿芪方組與培哚普利組小鼠LVEF和LVFS升高，LVIDd和LVIDs降低；心肌細(xì)胞損傷改善，膠原纖維沉積明顯減少，心肌纖維化明顯減輕；心肌組織ROS含量減少，NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白及IL-1β表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）。鹿芪方能有效減輕慢性心力衰竭小鼠心肌細(xì)胞焦亡，其機(jī)制可能與抑制ROS/NLRP3/Caspase-1通路活化，減輕心肌炎癥反應(yīng)相關(guān)。

鹿芪方；活性氧；NLRP3；炎性小體；心力衰竭；小鼠

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）因其較高的發(fā)病率和死亡率，始終是心血管疾病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)與難點(diǎn)[1-2]。細(xì)胞焦亡是由Caspase-1介導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡，不同于細(xì)胞凋亡、壞死，細(xì)胞焦亡時細(xì)胞內(nèi)容物釋放，引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，因此又稱細(xì)胞炎性壞死[3]。心肌梗死后，早期的炎癥反應(yīng)對清除壞死的細(xì)胞和組織碎片至關(guān)重要，但過度的炎癥反應(yīng)會加劇心肌梗死后的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，不利于瘢痕組織愈合，最終導(dǎo)致心力衰竭[4]。研究表明，在心力衰竭患者心肌組織中，NLRP3、Caspase-1等焦亡關(guān)鍵蛋白表達(dá)升高[5-6]。Han等[7]通過缺氧心肌細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA H19過表達(dá)可抑制NLRP3、Caspase-1表達(dá)，減輕心肌細(xì)胞焦亡。因此，抑制ROS/NLRP3/Caspase-1通路活化，減少心肌細(xì)胞焦亡可能是治療心力衰竭的有效方法之一。

鹿芪方為周華教授治療CHF的經(jīng)驗方，具有益氣溫陽、活血利水功效。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鹿芪方可促進(jìn)心肌細(xì)胞自噬，改善心肌能量代謝，增強(qiáng)心肌細(xì)胞抗凋亡能力[8-9]?；诖耍緦嶒灮赗OS/ NLRP3/Caspase-1信號通路觀察鹿芪方對CHF小鼠心肌細(xì)胞焦亡的影響。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性C57BL/6J小鼠60只，8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，動物許可證號SYXK（滬）2020-0009，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級動物房，自由攝食飲水。實驗方案經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗研究倫理委員會批準(zhǔn)（PZSHUTCM200807012）。動物飼養(yǎng)及處理過程嚴(yán)格按照《實驗動物管理和使用指南》[10]進(jìn)行。

1.2 藥物及制備

鹿芪方（鹿角片9 g，紅花9 g，黃芪30 g，黨參30 g，桂枝9 g，葶藶子20 g），飲片由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院中藥房提供，并制成中藥免煎顆粒，使用時配制成68 mg/mL混懸液。培哚普利片，施維雅（天津）制藥有限公司，批號2017106，配制成濃度為60.7 μg/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

HE染色試劑盒（上游碧云天科技有限公司，貨號C0105S），Masson染色試劑盒（安徽雷根生物，貨號DC0032），異氟烷（上海玉研科學(xué)儀器有限公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（賽默飛生物，貨號P0012），兔抗小鼠NLRP3抗體（美國CST，貨號15101S），ASC抗體（美國CST，貨號67824S），Caspase-1抗體（英國Abcam，貨號ab179515），白細(xì)胞介素（IL）-1β抗體（美國Santa Cruz，貨號sc-12742），GAPDH抗體（美國Bioworld，貨號AP0066），HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（美國CST，貨號7074），ECL發(fā)光液（上海天能，貨號180-501）。彩色多普勒超聲診斷系統(tǒng)（美國GE，VIVID5），多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek，Cytation 3），倒置顯微鏡（日本Nikon，Eclipse Ts2R），垂直式蛋白電泳槽（美國Bio-Rad，165-8004），濕轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad，170-3930），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能，4600SF），電泳及轉(zhuǎn)膜電源儀（美國Bio-Rad，Universal）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及給藥

60只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、鹿芪方組和培哚普利組，每組15只。除假手術(shù)組外，其余各組小鼠行冠狀動脈前降支（LAD）結(jié)扎術(shù)。小鼠氣體麻醉機(jī)下麻醉，脫毛劑去除頸前及左胸部毛發(fā)，暴露手術(shù)區(qū)，酒精消毒，于第3、4肋間打開胸腔充分暴露心臟，用直鑷夾起少量心包并于左心耳下撕開少許心包，迅速擠壓出心臟，用7-0帶線縫合針于左心耳下緣2 mm處進(jìn)針，穿過LAD，以完全阻斷LAD血流。結(jié)扎后迅速將心臟復(fù)位，并用5-0帶線縫合針縫皮，心電圖ST段抬高表明造模成功。假手術(shù)組僅開胸、穿線不結(jié)扎。按人與小鼠體表面積換算等效劑量，鹿芪方組和培哚普利組分別予予鹿芪方0.68 g/kg、培哚普利0.607 mg/kg灌胃，假手術(shù)組和模型組予等體積生理鹽水灌胃。給藥體積0.2 mL，連續(xù)6周。

2.2 心功能檢測

小鼠麻醉后，行超聲觀察，計算心臟左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室收縮分?jǐn)?shù)（LVFS）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）。

2.3 心肌組織病理觀察

取小鼠心肌組織，石蠟包埋后切片（5 μm），梯度乙醇脫蠟，行HE染色，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察。另取心肌組織石蠟切片，梯度乙醇脫蠟，Weigert鐵蘇木素染色10 min；乙酸分化液分化水洗，Masson藍(lán)化液返藍(lán)，水洗；麗春紅酸性品紅染色液染5 min，弱酸工作液洗1 min；磷鉬酸溶液洗2 min，弱酸工作液洗1 min；苯胺藍(lán)染液復(fù)染2 min，弱酸工作液復(fù)洗1 min，脫水后中性樹膠封片。光鏡下觀察并拍照，采用圖像分析軟件Image J 1.41進(jìn)行測定，計算心肌纖維化面積。心肌纖維化面積（%）＝膠原纖維沉積面積÷視野總面積×100%。

2.4 心肌組織活性氧檢測

心肌組織OCT包埋后行冰凍切片（5 μm），4%多聚甲醛室溫固定5 min，純水洗滌3次，每次30 s；DHE工作液室溫染色5～20 min，純水洗滌3次，每次1 min，甘油封片。熒光顯微鏡下觀察并拍照。采用Image J 1.41分析熒光強(qiáng)度。ROS陽性率（%）＝紅色熒光細(xì)胞數(shù)目÷細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.5 Western blot檢測小鼠心肌組織NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)

取20 mg小鼠心肌組織，加入200 μL RIPA裂解液，勻漿機(jī)研磨90 s，BCA法測定蛋白濃度，95 ℃煮10 min使蛋白變性；SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h；按1∶1 000加入NLRP3、ASC、Caspase-1一抗，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次10 min；加入HRP標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；滴加ECL發(fā)光液（A液、B液按1∶1混勻），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光，以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達(dá)量。

2.6 免疫組化檢測心肌組織白細(xì)胞介素-1β表達(dá)

取心肌組織石蠟切片，梯度乙醇脫蠟，檸檬酸鈉抗原修復(fù)，去除內(nèi)源性過氧化物酶；10%BSA室溫封閉1 h，滴加IL-1β（1∶100）一抗，4 ℃孵育過夜；二抗室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木素染色30 s，流水沖洗5 min，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。使用Image J 1.41軟件分析IL-1β表達(dá)的平均光密度。

2.7 透射電鏡觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)

心肌組織置于2.5%戊二醛中固定2 h，緩沖液清洗3次，每次10 min；1%鋨酸固定，緩沖液清洗；梯度乙醇脫水，丙酮浸透；包埋液浸透1.5 h，37 ℃包埋12 h，60 ℃包埋48 h；行超薄切片，使用醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染法染色，透射電子顯微鏡觀察。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 鹿芪方對模型小鼠心功能的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠LVEF和LVFS顯著降低，LVIDd和LVIDs顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠LVEF和LVFS顯著升高，LVIDd和LVIDs顯著降低（＜0.01）。結(jié)果見圖1。

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

4.2 鹿芪方對模型小鼠心肌組織病理形態(tài)的影響

假手術(shù)組小鼠心肌纖維束排列整齊，無膠原纖維沉積；與假手術(shù)組比較，模型組小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)明顯增大，排列不規(guī)則，有較多炎性細(xì)胞聚集及膠原纖維沉積；與模型組比較，鹿芪方組及培哚普利組小鼠心肌損傷明顯改善，膠原纖維沉積明顯減少，心肌纖維化明顯減輕。結(jié)果見圖2、圖3。

圖2 各組小鼠心肌組織形態(tài)（×200）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

4.3 鹿芪方對模型小鼠心肌組織活性氧含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠心肌組織ROS含量明顯增加（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠心肌組織ROS含量明顯減少（＜0.01）。結(jié)果見圖4、圖5。

圖4 各組小鼠心肌組織ROS表達(dá)（DHE熒光探針，×200）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

4.4 鹿芪方對模型小鼠心肌組織NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠心肌組織NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠心肌組織NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.01）。結(jié)果見圖6。

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

4.5 鹿芪方對模型小鼠心肌組織白細(xì)胞介素-1β表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠心肌組織IL-1β表達(dá)顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠心肌組織IL-1β表達(dá)明顯降低（＜0.01）。見圖7。

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

4.6 鹿芪方對模型小鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)的影響

假手術(shù)組小鼠心肌組織肌節(jié)排列整齊，心肌細(xì)胞正常，閏盤正常；模型組小鼠心肌閏盤排列紊亂，細(xì)胞器腫脹溶解，呈空泡化改變；鹿芪方組小鼠心肌細(xì)胞基本正常，閏盤連接略不規(guī)則，線粒體明顯增多。見圖8。

圖8 各組小鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)

5 討論

CHF屬中醫(yī)學(xué)“心水”“喘證”等范疇，為本虛標(biāo)實、虛實夾雜之證。鹿芪方中鹿角溫腎助陽，配伍紅花，共奏溫通心脈之功；黃芪與黨參配伍，共達(dá)益氣溫陽通脈之功；桂枝配伍葶藶子，以達(dá)瀉肺利水、降氣平喘之功。藥理研究表明，紅花主要成分紅花黃色素能提高心肌缺血再灌注大鼠乳酸脫氫酶含量，減少脂質(zhì)過氧化物生成，提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性，通過抑制氧化應(yīng)激減輕心肌超微結(jié)構(gòu)損傷[11]。黃芪主要成分黃芪總黃酮能減少缺血心肌乳酸脫氫酶產(chǎn)生，增強(qiáng)心肌抗缺氧能力[12]。黨參堿和桂枝能增加冠狀動脈血流，提高心排血量[13-14]。本研究結(jié)果表明，鹿芪方對CHF小鼠心功能具有良好的保護(hù)作用。

細(xì)胞焦亡表現(xiàn)為細(xì)胞膜破裂，NLRP3、Caspase-1等焦亡關(guān)鍵蛋白表達(dá)升高及IL-1β和IL-18等炎癥因子釋放。Caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡為經(jīng)典的細(xì)胞焦亡途徑，而Caspase-1的激活又依賴于NLRP3炎性小體的形成[15]。NLRP3炎性小體由NLRP3（NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3）、ASC（凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白）及pro-Caspase-1構(gòu)成。近年研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎性小體與心臟無菌性炎癥反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)[16]。心肌缺血時，死細(xì)胞、細(xì)胞碎片和細(xì)胞溶解后釋放的細(xì)胞內(nèi)容物作為損傷相關(guān)分子模式，導(dǎo)致線粒體內(nèi)ROS產(chǎn)生過多，激活NLRP3炎性小體，觸發(fā)先天性免疫應(yīng)答[17]，活化的NLRP3炎性小體發(fā)揮蛋白水解作用，促使Caspase-1前體剪切，活性Caspase-1進(jìn)一步剪切促炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-18并促使其向細(xì)胞外釋放[18]，擴(kuò)大心肌梗死后的炎癥反應(yīng)，加劇心力衰竭的發(fā)生發(fā)展[19]。因此，特異性抑制ROS及NLRP3/Caspase-1信號通路是治療心力衰竭的關(guān)鍵[20]。

本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠心肌組織ROS含量增加，NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白及IL-1β表達(dá)顯著升高，表明心力衰竭小鼠存在心肌細(xì)胞焦亡；與模型組比較，鹿芪方可抑制小鼠心肌組織ROS生成，降低NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)，減少IL-1β釋放，表明鹿芪方可能通過抑制ROS/NLRP3/Caspase-1信號通路的激活，減輕CHF小鼠心肌細(xì)胞焦亡，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。Bracey等[21]發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)性心肌病心力衰竭小鼠心肌組織NLRP3、Caspase-1含量較野生型小鼠升高，NLRP3-/-心力衰竭小鼠心肌炎癥反應(yīng)及心肌收縮功能改善。Zhang等[22]發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可通過抑制AMPK/NLRP3信號通路減輕心肌細(xì)胞焦亡，改善心功能。

綜上所述，鹿芪方能有效減輕CHF小鼠心肌細(xì)胞焦亡，改善CHF小鼠心功能，其機(jī)制可能與抑制ROS/NLRP3/Caspase-1通路活化相關(guān)。

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Effects ofPrescription on Myocardial Cell Pyrolysis in Mice with Chronic Heart Failure Based on ROS/NLRP3/Caspase-1 Pathway

ZHANG Xiaoqing, QU Huiyan, ZHAO Dandan, YANG Xiaoli, LAN Zhenzhen, YANG Tao, ZHOU Hua

To investigate the effects ofPrescription on myocardial cell pyrolysis in mice with chronic heart failure; To discuss its mechanism of action from the ROS/NLRP3/Caspase-1 pathway.Totally 60 C57BL/6J mice were randomly divided into sham-operation group, model group,Prescription group and perindopril group. Chronic heart failure model was made by ligation of anterior descending coronary artery. ThePrescription group and the perindopril group were given respective medicine for garage, while the sham-operation group and the model group were given the same amount of sodium chloride solution for garage. After 6 weeks of continuous administration, the cardiac function of mice was detected by ultrasound; the cardiac morphological changes and collagen fiber deposition were detected by HE and Masson staining; DHE fluorescent probe was used to detect ROS content in myocardial tissue; Western blot was used to detect the expressions of NLRP3, ASC and Caspase-1 protein in myocardial tissue; the expression of IL-1β was detected by immunohistochemistry; the ultrastructural changes of myocardial tissue were observed by projection electron microscopy.Compared with sham-operation group, left ventricular ejection fraction (LVEF) and left ventricular fractional shortening (LVFS) in model group decreased; left ventricular end-diastolic diameter (LVIDd) and left ventricular end-systolic diameter (LVIDs) increased; myocardial cells were obviously enlarged and arranged irregularly; there were more inflammatory cell aggregation and collagen fiber deposition; the content of ROS in myocardial tissue increased; expressions of NLRP3, ASC, Caspase-1 protein and IL-1β increased, with statistical significance (<0.01). Compared with model group, the LVEF and LVFS of the mice inPrescription group and perindopril group increased; the LVIDd and LVIDs decreased; the myocardial cell damage was improved; collagen fiber deposition, myocardial fibrosis, the content of ROS in myocardial tissue reduced, and the expression of NLRP3, ASC, Caspase-1 protein and IL-1β were decreased, with statistical significance (<0.01).Prescription can effectively reduce myocardial pyrolysis in chronic heart failure mice, and the mechanism may be related to the inhibition of ROS/NLRP3/Caspase-1 pathway activation and the reduction of myocardial inflammatory response.

Prescription; reactive oxygen species; NLRP3; inflammasome; heart failure; mice

R285.5

A

1005-5304(2021)10-0093-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202102230

國家自然科學(xué)基金（81673753）；上海市申康醫(yī)學(xué)發(fā)展中心三年行動計劃（SHDC2020CR1053B）；上海市科學(xué)技術(shù)委員會科技支撐項目（18401932800）；上海市申康醫(yī)學(xué)發(fā)展中心新興前沿技術(shù)聯(lián)合攻關(guān)項目（SHDC12018125）；上海中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新能力項目（Y2020014）

周華，E-mail：zhouhua@shutcm.edu.cn

（收稿日期：2021-02-19）

（修回日期：2021-03-30；編輯：鄭宏）