腎衰Ⅱ號方對慢性腎衰竭大鼠有氧糖酵解及腎間質(zhì)纖維化的影響

楊柳易，王蒙，周圓，王琛

實驗研究

腎衰Ⅱ號方對慢性腎衰竭大鼠有氧糖酵解及腎間質(zhì)纖維化的影響

楊柳易，王蒙，周圓，王琛

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)腎病研究所，上海市中醫(yī)臨床重點實驗室，上海 201203

觀察腎衰Ⅱ號方對慢性腎衰竭大鼠有氧糖酵解及腎間質(zhì)纖維化的影響，探討其抗腎間質(zhì)纖維化的作用機制。體內(nèi)實驗以5/6（A/I）手術(shù)構(gòu)建慢性腎衰竭大鼠模型，隨機分為假手術(shù)組、模型組、中藥組、西藥組，進行相應(yīng)干預(yù)8周后，取腎組織行PAS染色觀察腎臟病理變化，Western blot檢測α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）蛋白表達，免疫組化檢測α-SMA、己糖激酶（HK）2蛋白定位，紫外法檢測腎組織HK活性，比色法檢測腎組織乳酸、丙酮酸濃度；體外實驗以白細胞介素（IL）-1β刺激大鼠腎成纖維細胞NRK-49F構(gòu)建NRK-49F增殖活化模型，細胞分為空白組、IL-1β組、IL-1β＋腎衰Ⅱ號方低劑量組（200 μg/mL）、IL-1β＋腎衰Ⅱ號方高劑量組（400 μg/mL）、IL-1β＋2-脫氧-D-葡萄糖組（10 mmol/L），Western blot檢測NRK-49F細胞α-SMA、增殖細胞核抗原（PCNA）、纖維連接蛋白（FN）、HK2蛋白表達，比色法檢測細胞培養(yǎng)基乳酸濃度，葡萄糖氧化酶法檢測細胞培養(yǎng)基葡萄糖濃度，免疫熒光檢測HK2蛋白表達。體內(nèi)實驗：與假手術(shù)組比較，模型組PAS染色提示腎間質(zhì)糖原含量增加，腎小球、腎小管形態(tài)異常；α-SMA蛋白表達明顯升高（＜0.01），腎組織乳酸濃度、乳酸/丙酮酸、HK活性、HK2蛋白表達均明顯升高（＜0.01）。與模型組比較，中藥組和西藥組腎組織病理變化改善，α-SMA蛋白表達、乳酸濃度、乳酸/丙酮酸、HK活性、HK2蛋白表達均明顯降低（＜0.05，＜0.01）。體外實驗：與空白組比較，IL-1β組NRK-49F細胞FN、α-SMA、PCNA、HK2蛋白表達明顯升高（＜0.05，＜0.01）；細胞培養(yǎng)基pH值、葡萄糖濃度明顯降低（＜0.05），乳酸濃度明顯升高（＜0.01）；與IL-1β組比較，各干預(yù)組NRK-49F細胞FN、α-SMA、PCNA、HK2蛋白表達明顯降低（＜0.05，＜0.01）；細胞培養(yǎng)基pH值、葡萄糖濃度升高（＜0.05，＜0.01），乳酸濃度明顯降低（＜0.01）。腎衰Ⅱ號方可通過抑制NRK-49F細胞有氧糖酵解反應(yīng)，從而阻止成纖維細胞增殖活化，實現(xiàn)其抗腎間質(zhì)纖維化的作用。

腎衰Ⅱ號方；腎間質(zhì)纖維化；有氧糖酵解；腎成纖維細胞；大鼠

腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是各種病因引起的慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）進展至終末期腎臟病（end-stage renal disease，ESRD）的共同病理表現(xiàn)，腎功能進行性惡化與腎間質(zhì)損害程度關(guān)系密切[1]。RIF的發(fā)生發(fā)展與細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）合成和降解失衡、腎成纖維細胞增殖活化、炎癥或非炎癥損傷導(dǎo)致ECM過度沉積直接相關(guān)[1-2]。腎成纖維細胞是組成腎間質(zhì)及合成和降解ECM的主要細胞，對維持腎間質(zhì)ECM平衡穩(wěn)態(tài)十分重要[3]。研究表明，抑制腎成纖維細胞的增殖和活化可有效改善多種CKD動物模型腎纖維化[4-6]。因此，尋求抑制腎成纖維細胞增殖和激活的多靶點藥物是減緩RIF進程的主要方向。腎衰Ⅱ號方由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院腎病科王琛教授研制，臨床用于治療早中期慢性腎衰竭20余年。前期研究表明，腎衰Ⅱ號方可有效改善CKD3～4期患者腎功能和微炎癥狀態(tài)[7-8]，并有效抑制5/6（ablation/infarction，A/I）慢性腎衰竭大鼠模型的RIF，其作用機制可能與抑制炎癥反應(yīng)、細胞凋亡、有氧糖酵解相關(guān)[9-13]，但其具體作用機制仍需進一步探討。本實驗以腎成纖維細胞中能量代謝異常為切入點，以5/6（A/I）慢性腎衰竭大鼠和白細胞介素-1β（IL-1β）誘導(dǎo)大鼠腎成纖維細胞NRK-49F作為實驗?zāi)Ｐ?，進一步探討腎衰Ⅱ號方抗RIF的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

雄性SPF級SD大鼠67只，8周齡，體質(zhì)量140～160 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（滬）2012-0002。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，溫度20～24 ℃，相對濕度53%～57%，12 h/12 h明暗交替，動物實驗通過上海中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審查批準(zhǔn)（SZY201604006）。

1.2 藥物

腎衰Ⅱ號方（黨參15 g，淫羊藿 15 g，丹參15 g，當(dāng)歸15 g，川芎15 g，桃仁15 g，制大黃15 g，黃連6 g，紫蘇葉15 g，蟲草菌絲5 g），所有飲片由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院提供，由該院藥劑科徐光臨藥師鑒定為正品，并委托該院藥劑科制成中藥復(fù)方凍干粉。氯沙坦鉀片，杭州默沙東制藥有限公司，貨號N035513；2-脫氧-D-葡萄糖（2-DG），美國Sigma Aldrich公司，貨號D8375。

1.3 細胞

大鼠腎成纖維細胞NRK-49F，購自中國科學(xué)院細胞庫。

1.4 主要試劑與儀器

纖維連接蛋白（FN）抗體（英國Abcam公司，貨號ab45688），增殖細胞核抗原（PCNA，英國Abcam公司，貨號ab92552），α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體（華安生物公司，貨號ET1607-53），己糖激酶2（HK2）抗體（英國Abcam公司，貨號ab209847），GAPDH抗體（美國Proteintech公司，貨號60004-1-Ig），β-actin（美國Proteintech公司，貨號66009-1-Ig），重組大鼠IL-1β細胞因子（美國PeproTech公司，貨號400-01B），DMEM高糖培養(yǎng)基（杭州吉諾公司，貨號C11995500BT），胎牛血清（FBS，美國Gibco公司，貨號10099141），青鏈霉素（美國Gibco公司，貨號15140-122），乳酸、丙酮酸、葡萄糖測定試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，貨號分別為A081-1-1、A081-1-1、F006-1-1）。Nikon80i熒光顯微鏡（日本Nikon公司），YZB/USA 0816-2014型恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），Centrifuge 5424R高速低溫離心機（德國Eppendorf公司），Cytation 3細胞成像多功能檢測系統(tǒng)（美國BioTek公司），電泳及轉(zhuǎn)膜電源儀（美國Bio-Rad公司）。

2 實驗方法

2.1 造模及分組

隨機選取55只SD大鼠應(yīng)用5/6（A/I）手術(shù)造模[14]，將造成模功的36只大鼠隨機分為模型組、中藥組、西藥組，另取12只大鼠為假手術(shù)組，分別給予中藥組腎衰Ⅱ號方（4 g/mL）3 mL、西藥組氯沙坦鉀（3.33 mg/mL）3 mL、假手術(shù)組和模型組生理鹽水3 mL灌胃，每日1次，干預(yù)8周。

2.2 NRK-49F細胞培養(yǎng)及分組

將NRK-49F細胞用含10%FBS和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞密度為80%時進行細胞傳代，每周傳代2～3次。取對數(shù)生長期細胞進行細胞鋪板，細胞貼壁后用含0.5%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基饑餓處理12 h，再進行相應(yīng)干預(yù)24 h。將細胞分為空白組、模型組（IL-1β 10 ng/mL，IL-1β組）、腎衰Ⅱ號方低劑量組（腎衰Ⅱ號方200 μg/mL＋IL-1β 10 ng/mL，IL-1β＋SSRL組）、腎衰Ⅱ號方高劑量組（腎衰Ⅱ號方400 μg/mL＋IL-1β 10 ng/mL，IL-1β＋SSRH組）及2-DG組（2-DG 10 mmol/L＋IL-1β 10 ng/mL，IL-1β＋2-DG組）。

2.3 Western blot檢測

使用RIPA裂解液冰上裂解大鼠腎組織蛋白和細胞蛋白30 min，15 000 r/min離心15 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度后進行蛋白樣品制備。所有一抗均按1∶1 000比例稀釋。Western blot檢測方法參照文獻[13]。

2.4 免疫組化染色

將大鼠腎組織置于4%多聚甲醛中固定24 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片（厚度3 μm），脫蠟后進行抗原修復(fù)，3%BSA封閉30 min，滴加相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過夜，二抗孵育后顯色，倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。

2.5 乳酸濃度測定

2.5.1 大鼠腎組織

稱取20 mg大鼠腎組織，加180 μL生理鹽水，勻漿，5 000 r/min離心10 min，取上清液進行后續(xù)檢測。BCA法測定組織蛋白濃度。乳酸濃度測定嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，于酶標(biāo)儀波長530 nm測定各孔吸光度（OD）。組織乳酸濃度（mmol/g）＝（樣品OD值－空白OD值）÷（標(biāo)準(zhǔn)OD值－空白OD值）×標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度÷樣品蛋白濃度。

2.5.2 細胞培養(yǎng)基

NRK-49F細胞干預(yù)結(jié)束后，取6孔板中細胞培養(yǎng)基于2 mL EP管，1 000 r/min離心5 min，取上清液進行乳酸濃度檢測，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，于酶標(biāo)儀波長530 nm處測定各孔OD值。細胞培養(yǎng)基乳酸濃度（mmol/L）＝（樣品OD值－空白OD值）÷（標(biāo)準(zhǔn)OD值－空白OD值）×標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度。

2.6 腎組織丙酮酸濃度測定

組織處理及蛋白濃度測定同“2.5.1”項下方法，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，于酶標(biāo)儀波長505 nm處測定各孔OD值。組織丙酮酸濃度（mmol/g）＝（樣品OD值－空白OD值）÷（標(biāo)準(zhǔn)OD值－空白OD值）×標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度÷樣品蛋白濃度。

2.7 腎組織己糖激酶活性測定

組織處理及蛋白濃度測定同“2.5.1”項下方法，按試劑盒說明書進行操作，于酶標(biāo)儀波長340 nm處測定各孔20 s初始吸光度（A1）和5 min 20 s時吸光度（A2）。組織HK活性[nmol/（min?mg）]＝（A2－A1）÷樣品蛋白濃度。

2.8 細胞免疫熒光檢測

將細胞懸液加至底部提前包被無菌蓋玻片24孔板，進行不同干預(yù)，1×PBS沖洗細胞，4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.5%Triton X-100室溫通透20 min，10%BSA室溫封閉30 min，滴加適量HK2抗體（1∶200），置于濕盒4 ℃孵育過夜，滴加熒光二抗，置于濕盒避光，室溫孵育1 h，加入DAPI工作液，置于濕盒避光，室溫孵育5 min，迅速于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 PAS染色結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎小管管腔擴張，損傷明顯，腎小球硬化，腎小球基底膜增厚，腎小球內(nèi)及腎小管間質(zhì)內(nèi)糖原呈紫紅色，ECM含量增加；與模型組比較，中藥組和西藥組腎小管損傷減輕，腎小球硬化及腎小球基底膜增厚減少，腎小球內(nèi)及腎小管間質(zhì)內(nèi)糖原含量減少。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織形態(tài)（PAS染色，標(biāo)尺＝100 μm）

4.2 腎衰Ⅱ號方對模型大鼠腎組織α-平滑肌肌動蛋白表達的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織α-SMA蛋白表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01），且α-SMA主要在腎間質(zhì)表達，并可見腎組織有大量炎性細胞浸潤；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠腎組織α-SMA蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05），且α-SMA在腎間質(zhì)表達減少。見表1、圖2、圖3。

4.3 腎衰Ⅱ號方對模型大鼠腎組織乳酸濃度、乳酸/丙酮酸的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織乳酸濃度和乳酸/丙酮酸明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠腎組織乳酸濃度和乳酸/丙酮酸明顯下降（＜0.05，＜0.01）。見表2。

表1 各組大鼠腎組織α-SMA蛋白表達比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**＜0.01；與模型組比較，#＜0.05

圖2 各組大鼠腎組織α-SMA蛋白免疫印跡圖

圖3 各組大鼠腎組織α-SMA蛋白陽性表達（免疫組化染色，標(biāo)尺＝100 μm）

表2 各組大鼠腎組織乳酸濃度、乳酸/丙酮酸比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**＜0.01；與模型組比較，#＜0.05，##＜0.01

4.4 腎衰Ⅱ號方對模型大鼠腎組織己糖激酶活性和己糖激酶2蛋白表達的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織HK活性明顯升高（＜0.05），HK2蛋白在腎間質(zhì)高表達；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠腎組織HK活性明顯降低（＜0.05，＜0.01），HK2蛋白在腎間質(zhì)表達明顯減少。見表3、圖4。

表3 各組大鼠腎組織HK活性比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**＜0.01；與模型組比較，#＜0.05，##＜0.01

圖4 各組大鼠腎組織HK2蛋白陽性表達（免疫組化染色，標(biāo)尺＝100 μm）

4.5 腎衰Ⅱ號方對NRK-49F細胞纖維連接蛋白、α-平滑肌肌動蛋白、增殖細胞核抗原蛋白表達的影響

與空白組比較，IL-1β組NRK-49F細胞FN、α-SMA、PCNA蛋白表達明顯升高（＜0.05，＜0.01）；與IL-1β組比較，IL-1β＋SSRL組、IL-1β＋SSRH組及IL-1β＋2-DG組NRK-49F細胞FN、α-SMA、PCNA蛋白表達降低，其中IL-1β＋SSRH組、IL-1β＋2-DG組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。見表4、圖5。

表4 各組NRK-49F細胞FN、α-SMA、PCNA蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05，**＜0.01；與IL-1β組比較，#＜0.05，##＜0.01

注：A.空白組；B. IL-1β組；C. IL-1β＋SSRL組；D. IL-1β＋SSRH組；E. IL-1β＋2-DG組

4.6 腎衰Ⅱ號方對NRK-49F細胞培養(yǎng)基pH值、乳酸濃度、葡萄糖濃度的影響

與空白組比較，IL-1β組NRK-49F細胞培養(yǎng)基pH值和葡萄糖濃度明顯下降（＜0.05），乳酸濃度明顯上升（＜0.01）；與IL-1β組比較，IL-1β＋SSRH組及IL-1β＋2-DG組NRK-49F細胞培養(yǎng)基pH值和葡萄糖濃度明顯升高（＜0.01，＜0.05），乳酸濃度明顯下降（＜0.01）。見表5。

表5 各組NRK-49F細胞培養(yǎng)基pH值、乳酸濃度和葡萄糖濃度比較（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05，**＜0.01；與IL-1β組比較，#＜0.05，##＜0.01

4.7 腎衰Ⅱ號方對NRK-49F細胞己糖激酶2蛋白表達的影響

與空白組比較，IL-1β組NRK-49F細胞HK2蛋白表達明顯升高（＜0.01），且HK2蛋白在胞漿中大量表達；與IL-1β組比較，IL-1β＋SSRL組、IL-1β＋SSRH組及IL-1β＋2-DG組NRK-49F細胞HK2蛋白表達明顯降低（＜0.05，＜0.01），且HK2蛋白在胞漿中表達明顯減少。見表6、圖6、圖7。

表6 各組NRK-49F細胞HK2蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，**＜0.01；與IL-1β組比較，#＜0.05，##＜0.01

注：A.空白組；B. IL-1β組；C. IL-1β＋SSRL組；D. IL-1β＋SSRH組；E. IL-1β＋2-DG組

圖7 各組NRK-49F細胞HK2蛋白陽性表達（免疫熒光染色，標(biāo)尺＝100 μm）

5 討論

由德國學(xué)者Warburg[15]在肝癌細胞中首次發(fā)現(xiàn)的有氧糖酵解是指不論氧氣充足與否，大部分葡萄糖會被分解產(chǎn)生乳酸，少部分葡萄糖經(jīng)過氧化磷酸化進行分解產(chǎn)生二氧化碳（CO2）和水（H2O），此過程中1 mol葡萄糖代謝可獲得4 mol ATP。有氧糖酵解早期被認(rèn)為是腫瘤細胞獨有的特征，但隨著研究進展發(fā)現(xiàn)，增殖細胞也可通過有氧糖酵解應(yīng)對不斷變化的環(huán)境條件[16]。目前，越來越多研究表明，在多種纖維化組織中出現(xiàn)能量代謝重編程，包括肺纖維化、肝纖維化、腎纖維化等[17-19]。高氧耗、高代謝、高耗能的生理特點使腎臟對能量代謝的變化極敏感，關(guān)于有氧糖酵解如何參與腎纖維化已經(jīng)成為研究熱點。有氧糖酵解參與胚胎細胞腎單位祖細胞（NPC）的自我更新過程，抑制糖酵解可刺激NPC的分化，促進腎間充質(zhì)向上皮的轉(zhuǎn)變和腎臟生成，在腎臟中可能存在糖代謝的開關(guān)來調(diào)控細胞增殖和修復(fù)[20]。多種腎纖維化動物模型證實，在RIF形成過程中，能量代謝方式的改變是肌成纖維細胞活化的主要特征，成纖維細胞從氧化磷酸化到有氧糖酵解的代謝轉(zhuǎn)變是其增殖和細胞外基質(zhì)合成的主要動力源泉，抑制成纖維細胞的糖酵解反應(yīng)是減少RIF的有效策略[21-24]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，腎衰Ⅱ號方可改善5/6（A/I）慢性腎衰竭大鼠腎功能，可能與抑制有氧糖酵解限速酶HK2、M2型丙酮酸激酶表達有關(guān)，但其具體作用機制還需進一步探討。

2-DG是HK2的競爭性抑制劑，是一種可口服的葡萄糖異構(gòu)體，可被磷酸化為6磷酸2-DG，6磷酸2-DG不能進一步參加葡萄糖代謝，同時2-DG還可與葡萄糖競爭多種催化酶，從而阻止葡萄糖代謝的進一步反應(yīng)。2-DG可減輕單側(cè)輸尿管結(jié)扎小鼠RIF，對TGF-β1刺激的成纖維細胞活化也具有抑制作用[24]。有研究指出，IL-1β是促進RIF的關(guān)鍵因素，主要作用機制是通過IL-1β/IRAK4/c-Myc信號通路促進腎臟有氧糖酵解反應(yīng)增強，進一步明確了炎癥、有氧糖酵解與RIF之間的關(guān)系[25]。本研究細胞實驗發(fā)現(xiàn)，與IL-1β組比較，2-DG抑制NRK-49F細胞有氧糖酵解反應(yīng)的同時下調(diào)纖維化相關(guān)因子表達，再次表明有氧糖酵解通過促進成纖維細胞增殖活化而加重RIF。

根據(jù)RIF臨床表現(xiàn)，將其歸屬中醫(yī)學(xué)“虛勞”“水腫”“癥積”等范疇。RIF病機之本為脾腎不足，標(biāo)見濕、熱、毒、瘀，隨著病情進展，本虛影響標(biāo)實，標(biāo)實加重本虛，虛實錯雜，邪正交爭。有氧糖酵解是一種消耗較多葡萄糖而產(chǎn)能過少的代謝方式，是由于邪氣盛而消耗人體大量正氣的過程，線粒體氧化磷酸化屬氣歸正化，有氧糖酵解屬氣失正化，是邪氣盛的表現(xiàn)。RIF患者脾腎虛損，出現(xiàn)物質(zhì)轉(zhuǎn)換和物質(zhì)轉(zhuǎn)為能量的功能減弱，這與有氧糖酵解代謝方式將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸而非徹底有氧氧化為CO2和H2O，并產(chǎn)能過少相吻合。此外，能量代謝障礙導(dǎo)致的細胞代謝產(chǎn)物積累，屬中醫(yī)濕熱瘀毒范疇，進而造成線粒體功能障礙，促進有氧糖酵解，形成惡性循環(huán)。因此，慢性腎功能衰竭RIF“脾腎虛損，濕熱瘀毒”的中醫(yī)病機與能量代謝障礙的病理特征相合。腎衰Ⅱ號方重用黨參、淫羊藿以同補先后天，加用當(dāng)歸、丹參、川芎、桃仁以養(yǎng)血活血，佐以紫蘇葉、大黃、黃連清熱泄?jié)峤舛竞拖x草菌絲壯命火、益精髓，共奏益氣補腎、養(yǎng)血活血、化瘀降濁解毒功效，契合有氧糖酵解所致慢性腎衰竭RIF的發(fā)病機制。

本研究首先利用5/6（A/I）慢性腎衰竭大鼠模型進行初步探索，體內(nèi)實驗通過檢測有氧糖酵解的終產(chǎn)物乳酸、中間產(chǎn)物丙酮酸濃度和限速酶HK活性及HK2蛋白表達定位，發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組比較，模型大鼠腎組織存在有氧糖酵解反應(yīng)增強，而且可能集中在腎間質(zhì)細胞中。進一步對腎間質(zhì)主要組成細胞成纖維細胞進行研究，利用IL-1β誘導(dǎo)NRK-49F細胞活化模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-1β組NRK-49F細胞增殖活化的同時有氧糖酵解反應(yīng)明顯增強。而腎衰Ⅱ號方可抑制慢性腎衰竭大鼠腎間質(zhì)中肌成纖維細胞標(biāo)志蛋白α-SMA表達，減輕慢性腎衰竭大鼠病理變化。體外實驗顯示，腎衰Ⅱ號方干預(yù)后的NRK-49F細胞增殖活化相關(guān)蛋白表達下降，有氧糖酵解代謝狀態(tài)接近空白組，提示腎衰Ⅱ號方可通過抑制NRK-49F細胞有氧糖酵解影響RIF的進程。

綜上，有氧糖酵解反應(yīng)增強是RIF形成和進展的重要影響因素。腎衰Ⅱ號方抗RIF作用與減弱成纖維細胞的有氧糖酵解反應(yīng)，進而抑制成纖維細胞增殖活化、減少ECM蛋白沉積有關(guān)。本研究進一步闡釋了腎衰Ⅱ號方抗RIF的作用機制，本方抑制有氧糖酵解的具體機制有待進一步研究。

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Effect ofⅡ Recipe on Aerobic Glycolysis and Renal Interstitial Fibrosis in Rats with Chronic Renal Failure

YANG Liuyi, WANG Meng, ZHOU Yuan, WANG Chen

To observe the effects ofⅡ Prescription on aerobic glycolysis and renal interstitial fibrosisin rats with chronic renal failure; To explore its anti-renal fibrosis mechanism.In vivo experiment, the rat model of chronic renal failure was established by 5/6 (A/I) operation. The rats were divided into sham-operation group, model group, TCM group and Western medicine group. After 8 weeks of intervention, renal tissue was taken for PAS staining to observe the pathological changes of kidney; Western blot was used to detect the expression of α-smooth muscle actin (α-SMA) protein; immunohistochemistry was used to detect the protein localization of α-SMA and hexokinase (HK) 2; the activity of HK in renal tissue was detected by UV; the concentration of lactic acid and pyruvate in renal tissue was measured by colorimetry. In vitro experiment, the proliferation and activation model of NRK-49F was established by stimulating rat renal fibroblasts NRK-49F with interleukin (IL) -1β. The cells were divided into blank group, IL-1β group, IL-1β + low dosage ofⅡ Recipe group (200 μg/mL) and IL-1β + high dosage ofⅡ Recipe group (400 μg/mL), IL-1β + 2-deoxy-D-glucose group (10 mmol/L). The protein expression of α-SMA, proliferating cell nuclear antigen (PCNA), fibronectin (FN) and HK2 in NRK-49F cells were detected by Western blot; the concentration of lactic acid in cell medium was detected by colorimetry; the glucose concentration in cell medium was detected by glucose oxidase method; the expression of HK2 protein was detected by immunocytofluorescence.Vivo experiment showed that, compared with the sham-operation group, the PAS staining in the model group indicated that the interstitial glycogen content increased, the morphology of glomerulus and renal tubule was abnormal, the expression of α-SMA protein increased (<0.01), and the concentration of lactic acid, lactic acid/pyruvate, HK activity and HK2 protein expression in renal tissue increased (<0.01). Compared with the model group, the pathological changes of renal tissue in the TCM group and the Western medicine group were improved, and the expressions of α-SMA protein, lactic acid concentration, lactic acid/pyruvate, HK activity and HK2 protein expressions decreased in the TCM group and Western medicine group (<0.05,<0.01). Vitro experiment showed that, compared with the blank group, the protein expressions of FN, α-SMA, PCNA and HK2 in NRK-49F cells of the IL-1β group increased (<0.05,<0.01), the pH value of culture medium and the concentration of glucose decreased (<0.05), and the concentration of lactic acid increased (<0.01). Compared with the model group, the protein expressions of FN, α-SMA, PCNA and HK2 in each intervention group decreased (<0.05,<0.01), the pH value of culture medium and the concentration of glucose increased (<0.05,<0.01), and the concentration of lactic acid decreased (<0.01).Ⅱ Prescription may inhibit the aerobic glycolysis of NRK-49F cells to prevent the proliferation and activation of fibroblasts and achieve its anti-renal fibrosis effect.

Ⅱ Recipe; renal interstitial fibrosis; aerobic glycolysis; renal fibroblasts; rats

R285.5

A

1005-5304(2021)10-0057-07

10.19879/j.cnki.1005-5304.202103451

國家自然科學(xué)基金（81973770）；上海市進一步加快中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展三年行動計劃（ZY-(2018-2020)-FWTX-7005）；上海中醫(yī)藥大學(xué)“研究生創(chuàng)新培養(yǎng)專項”（Y2020006）

王琛，E-mail：chenwang42@163.com

（收稿日期：2021-03-23）

（修回日期：2021-04-14；編輯：華強）