基于NF-κB/IκBα信號通路探討“通經(jīng)利濁”針法對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠保護作用的機制研究

齊 偉李 麗張 岳穆雙雙胡 德王淑敏*王朝輝*

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)針推學(xué)院，長春 130117；2.深圳市寶安純中醫(yī)治療醫(yī)院骨傷科，深圳 518101；3.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長春 130117)

痛風(fēng)是炎癥性關(guān)節(jié)炎的一種形式，是由于單鈉尿酸鹽(monosodium urate，MSU)晶體在人體組織和體液中的沉積所致。由于飲食和生活習(xí)慣的改變，在工業(yè)化國家中至少有4%的成年人受到痛風(fēng)的困擾[1－2]。痛風(fēng)的治療通常需要聯(lián)合使用抗炎藥物和降尿酸藥物，如非甾體抗炎藥/環(huán)氧化酶抑制劑、秋水仙堿、糖皮質(zhì)激素、丙磺舒和別嘌醇[3]。盡管短期藥物治療對痛風(fēng)有益，但痛風(fēng)極易反復(fù)發(fā)作，同時長期藥物治療則會產(chǎn)生副作用[4]。綜上，臨床上迫切需要療效更好、安全性更高的抗痛風(fēng)藥物及療法。

近期的研究多集中在尋找治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎而無明顯不良反應(yīng)的替代療法上。針灸是替代醫(yī)學(xué)的一種形式，因為它的不良反應(yīng)發(fā)生率非常低，幾乎無副作用，并且在治療疼痛相關(guān)疾病中療效確切[5－6]，因此針灸在患者中很受歡迎。同時，探索針灸發(fā)揮療效的生化機制越來越受到重視。研究認(rèn)為針刺刺激可以激活位于特定穴位深處的神經(jīng)纖維和受體。皮膚和深部組織損傷可能伴隨著局部炎癥反應(yīng)[7]。

針灸參與調(diào)節(jié)炎癥性疼痛已有文獻(xiàn)報道[8－10]。在弗氏佐劑誘導(dǎo)的炎癥模型中，電針可減輕炎癥劑引起的疼痛反應(yīng)和脊髓中谷氨酸受體的表達(dá)[9]。在角叉菜膠誘發(fā)的炎癥模型中，針刺聯(lián)合亞有效劑量的N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑可延長抗痛覺反應(yīng)的時間，且無明顯副作用[10]。另有研究表明，電針可抑制大鼠的脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞活性，并減少了炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1和TNF-α的釋放[11]。此外，針刺可明顯抑制關(guān)節(jié)炎模型中IL-1β的上調(diào)[12]。鞘內(nèi)注射IL-1受體拮抗劑可顯著緩解癌癥引起的痛覺反應(yīng)，這表明針刺是通過抑制IL-1β的表達(dá)來緩解骨癌引起的疼痛[13]。

臨床觀察發(fā)現(xiàn)針刺對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎顯示出良好的治療效果[14]，針刺對MSU誘導(dǎo)的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎同樣有效[15]。針刺“通經(jīng)利濁”針法是治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的有效臨床方法[16]。通經(jīng)利濁針法取足陽明之足三里與足太陰之陰陵泉，均屬合穴，此兩穴相配有健脾、化濕通絡(luò)之功。再選取三陰交以活血化瘀、宣壅通絡(luò)、利尿通淋，促進濕濁邪氣從小便排出。此三穴共用，共奏清熱利濕，宣壅通絡(luò)之效。

但是，“通經(jīng)利濁”針法針刺對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的保護作用機制尚不清楚。本研究的目的是探討“通經(jīng)利濁”針法針刺治療保護MSU誘導(dǎo)的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

從遼寧長生生物技術(shù)有限公司[SCXK(遼)2020-0001]購買了無特定病原級(specefic pathogen free，SPF)雄性SD大鼠40只，6周齡，體重(220±20)g。大鼠自由獲取食物和水，常規(guī)飼養(yǎng)1周。本研究經(jīng)過長春中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(IACUC-20190169)，在長春中醫(yī)藥大學(xué)動物中心喂養(yǎng)[SYXK(吉)2018-0014]，嚴(yán)格按照中國實驗動物管理法規(guī)處理動物，遵守3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

秋水仙堿片(C22H25NO6，分子量:399.44)購自昆明制藥；單鈉尿酸鹽(C5H3N4O3Na，分子量:190.09)購自Sigma；IL-1β、IL-6和TNF-α試劑盒均購自南京建成；抗-p-NF-κBp65、抗-NF-κBp65、抗-p-IαBα、抗-IκBα等所有抗體均購自Cell Signaling Technology；小型動物麻醉機(VMR型)購自MATRX(美國)；電針儀(SDZ-V型)購自華佗。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型建立及分組

將動物分為4組(每組n＝10):(1)空白組；(2)模型組；(3)“通經(jīng)利濁”針法組；(4)秋水仙堿組。秋水仙堿組大鼠口服秋水仙堿(1 mg/kg)7 d，而空白組和模型組則給予相同量的生理鹽水灌胃。針刺治療根據(jù)參考文獻(xiàn)[17]中的定位方法選擇“后三里”、“陰陵泉”、“三陰交”。使用小型動物麻醉機麻醉后，針刺“后三里”，直刺5 mm；“陰陵泉”，直刺5 mm；“三陰交”，直刺3 mm。針刺后用電針儀，以一側(cè)的后三里-三陰交為連續(xù)電針連接對穴，取連續(xù)波(2 Hz，0.6 mA，0.45 ms)行電針刺激，以大鼠的大腿輕輕抖動，不影響麻醉效果為度。每日針刺1次，每次10 min，7次為1療程，共干預(yù)1療程。針刺組和秋水仙堿組在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型建立前7 d接受治療。

1.3.2 急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型

參照Shiels等[18]研究方法制備得到了MSU晶體，洗滌并風(fēng)干。將250 mg MSU晶體溶于10 mL溶液(生理鹽水:聚山梨酯-80＝9∶1)中制得濃度為25 mg/mL的MSU溶液。第7天將此溶液注入右膝關(guān)節(jié)腔誘發(fā)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型后，即從雙眼眶后神經(jīng)叢收集血液樣品1 mL，2500 r/min下離心15 min，將血清儲存在－20℃下保存直至使用。大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MSU晶體后關(guān)節(jié)炎迅速出現(xiàn)，關(guān)節(jié)炎發(fā)生率100%[19]。具體表現(xiàn)為大鼠活動明顯減少，關(guān)節(jié)周圍局部出現(xiàn)紅斑、腫脹伴功能障礙，如行走遲緩、肢體不愿著力負(fù)重。顯微鏡下可見明顯的關(guān)節(jié)炎病理改變，確認(rèn)造模成功[20]。

1.3.3 促炎癥細(xì)胞因子檢測

酶聯(lián)免疫吸附試驗測定IL-1β、IL-6、TNF-α水平:分離血清1 d后，根據(jù)生產(chǎn)商說明書進行操作，檢測血清中的促炎癥細(xì)胞因子水平。

1.3.4 組織病理學(xué)檢查

處死大鼠后，將膝蓋樣品在關(guān)節(jié)線上方和下方分別切開0.5 cm。然后將組織固定在10%中性福爾馬林緩沖液中，石蠟浸潤，包埋并制成5μm厚切片。用蘇木精和伊紅(HE)染色法將切片脫蠟并染色。在顯微鏡下以200倍的放大倍率觀察切片。

1.3.5 Western blot分析

將膝蓋樣品切成小塊后在RIPA裂解緩沖液中混合，在冰浴下勻漿。靜置30 min，將樣品在4℃下12000 r/min離心20 min。收集上清液，使用BCA試劑盒，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品測定蛋白質(zhì)濃度。將上清液加載到12%蛋白凝膠上，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離(120 V，200 mA，60 W，5 h)，蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(300 V，200 mA，60 W，2 h)。用5%脫脂奶封閉2 h。將膜與單獨的一抗、抗-p-NF-κBp65、抗-NF-κBp65、抗-p-IαBα、抗-IκBα和抗GAPDH共同在4℃下孵育過夜，用TBST緩沖液洗滌后，將膜與二抗在室溫下孵育2 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒對免疫反應(yīng)性條帶成像，使用Image Lab 4.1(Bio-Rad)進行信號收集和光密度圖像分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 “通經(jīng)利濁”針法針刺對促炎癥細(xì)胞因子的影響

與空白組相比，模型組的IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高(P<0.01)。通過“通經(jīng)利濁”針法針刺治療可以顯著逆轉(zhuǎn)由MSU晶體引起的促炎癥細(xì)胞因子升高。秋水仙堿組與針法組的療效類似(圖1)。

圖1 “通經(jīng)利濁”針法對促炎癥細(xì)胞因子的影響Figure 1 Effects of SMCTD acupuncture on serum proinflammatory cytokines.

2.2 “通經(jīng)利濁”針法針刺對膝關(guān)節(jié)組織學(xué)變化的影響

在空白組動物的右膝關(guān)節(jié)病理切片中可觀察到正常的關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)和骨關(guān)節(jié)(圖2A)。MSU晶體誘發(fā)的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠(模型組)表現(xiàn)出輕度滑膜水腫，關(guān)節(jié)間隙變小，關(guān)節(jié)侵蝕明顯(圖2B)。與之相反，秋水仙堿組(圖2C)和“通經(jīng)利濁”針法組(圖2 D)抑制MSU晶體誘發(fā)的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)侵蝕，關(guān)節(jié)間隙增加。

圖2 “通經(jīng)利濁”針法對踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)檢查的影響Figure 2 Effects of SMCTD acupuncture on myocardial histopathological examination

2.3 “通經(jīng)利濁”針法針刺對NF-κB信號通路的影響

本研究檢測“通經(jīng)利濁”針法針刺或秋水仙堿預(yù)治療是否會影響NF-κB通路的活化。結(jié)果表明，通過MSU晶體處理可增加NF-κBp65含量，而通過“通經(jīng)利濁”針法針刺或秋水仙堿預(yù)處理可有效降低其含量(P<0.01，P<0.01)(圖3A)。此外，MSU晶體激發(fā)導(dǎo)致了IκBα磷酸化和隨后的降解(圖3B)。然而，通過“通經(jīng)利濁”針法針刺或秋水仙堿預(yù)處理，MSU晶體誘導(dǎo)的IκBα磷酸化降低(P<0.01)(圖3C)。上述結(jié)果均表明，“通經(jīng)利濁”針法針刺的治療通過抑制NF-κB/IκBα信號通路的活化而發(fā)揮作用。

圖3 “通經(jīng)利濁”針法對NF-кB信號通路的影響Figure 3 Effects of SMCTD acupuncture on NF-кB pathway

3 討論

尿酸單鈉晶體誘導(dǎo)的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型是由晶體沉積或急性結(jié)晶引起的。多項研究表明，MSU模型引起的癥狀與臨床觀察到的癥狀類似[21]，如水腫、紅斑以及跛行。MSU引起短暫的炎癥反應(yīng)，其特征為在關(guān)節(jié)中的晶體沉積，同時伴有大量多形核中性粒細(xì)胞吞噬、炎癥性水腫和嚴(yán)重疼痛[22]。從本研究的組織病理學(xué)檢查結(jié)果來看，MSU可導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)腫脹、跛行和傷害行為?！巴ń?jīng)利濁”針法或秋水仙堿的預(yù)治療可顯著緩解MSU引起的機械性異常性疼痛，并減少嗜中性粒細(xì)胞向關(guān)節(jié)間隙的強烈浸潤。

炎癥是誘發(fā)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵因素。在實驗研究中，炎癥過程是由MSU晶體在周圍組織中沉積引起的。MSU晶體與骨髓中的T淋巴細(xì)胞相互作用，活化炎癥小體，從而促進IL-6和IL-18產(chǎn)生[23]。活化的炎性細(xì)胞因子促進炎性介質(zhì)的表達(dá)，這些介質(zhì)負(fù)責(zé)T細(xì)胞的生長分化，是急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的主要病理特征[24]。此外，當(dāng)前研究表明，活化的炎癥小體可觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)并將幼稚T細(xì)胞極化為促炎性Th亞群，進而增強炎癥反應(yīng)[25]。本研究中，炎癥應(yīng)激與MSU引起的IL-1β、TNF-α和IL-6顯著升高相關(guān)?！巴ń?jīng)利濁”針法針刺或秋水仙堿治療可明顯降低血清中IL-1β、TNF-α和IL-6的水平，這表明兩者的治療效果可能與抗炎特性有關(guān)。

促炎癥細(xì)胞因子的分泌和成熟受到NF-κB信號傳導(dǎo)的嚴(yán)格調(diào)節(jié)。研究表明疾病發(fā)生后組織周圍的吞噬細(xì)胞會被激活，分泌大量的促炎因子(如TNF-α、IL-1β和IL-6等)直接對周圍組織造成傷害，在細(xì)胞中，NF-κB通過與細(xì)胞質(zhì)中的IκB家族相互作用而失活。具體過程如下:促炎癥因子激活NF-κB抑制蛋白(IkB)激酶復(fù)合體，使其磷酸化，經(jīng)蛋白酶小體水解后，與NF-κB發(fā)生解離，解除其對NF-κB的抑制作用，進而暴露NF-κB的p50亞基，使其移位細(xì)胞核與靶基因啟動區(qū)或增強子的NF-κB位點結(jié)合，啟動促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6等基因的表達(dá)，使得TNF-α、IL-1β和IL-6等合成和分泌增加，進一步加劇損傷；反過來，上述促炎因子又可以加速活化NF-κB在組織間不斷擴散及NF-κB核移位，形成惡性循環(huán)[26－27]。當(dāng)用MSU晶體刺激時，IκBα被IκB激酶復(fù)合物激活和降解，這使得NF-κB易位進入細(xì)胞核并與靶基因結(jié)合[28]?；罨腘FκB增加了促炎癥細(xì)胞因子、趨化因子等的基因表達(dá)，最終導(dǎo)致了嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[29]。本實驗結(jié)果表明，“通經(jīng)利濁”針法針刺或秋水仙堿能抑制IκBα磷酸化和降解。此外，“通經(jīng)利濁”針法針刺或秋水仙堿給藥，能減弱MSU晶體誘導(dǎo)引起的NF-κBp65核易位。

針灸是治療與痛風(fēng)相關(guān)疾病(包括痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎)的主流替代療法。其副作用小，很容易被患者接受。“通經(jīng)利濁”針法是中醫(yī)治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的一種康復(fù)方法[30]。在臨床患者和實驗動物中，將穴位足三里、陰陵泉和三陰交聯(lián)合使用可有效治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[31－32]。在本研究中，經(jīng)“通經(jīng)利濁”針法針刺治療后顯著減輕了MSU引起的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，這為“通經(jīng)利濁”針法治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎提供了進一步的實驗支持。

綜上，本研究表明“通經(jīng)利濁”針法針刺對MSU晶體誘發(fā)的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型具有良好的療效，其作用機制可能是通過介導(dǎo)NF-κB/IκBα信號通路抑制促炎癥細(xì)胞因子。但仍存在不足，與T細(xì)胞亞群的關(guān)系仍需要進一步研究，相關(guān)實驗正在進行中。