菌肽寶在食用酒精中的應用研究

李永恒 魯佰成 崔春生 賴銘雪 李 濤 邵召 王瑀 何太波 周娜娜

【關(guān)鍵詞】菌肽寶;食用酒精;抑菌劑;發(fā)酵

【中圖分類號】TS262 【文獻標識碼】A 【文章編號】1674-0688（2021）09-0042-04

酒精發(fā)酵是一個復雜的微生物反應過程[1-2]，淀粉質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)食用酒精在發(fā)酵過程中雜菌的污染是酒精產(chǎn)率和品質(zhì)下降的主要原因之一[3-4]。為了提高酒精產(chǎn)率，使用無抗食品級生物抑菌劑是抑制、減少雜菌或者殺滅雜菌在酒精發(fā)酵過程中急需解決的重大問題[5]。酒精發(fā)酵過程中常見且危害較大的雜菌主要有醋酸桿菌、丁酸菌、枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌、野生酵母菌等[5-6]。而且，部分雜菌會代謝產(chǎn)出乙酸和乳酸降低發(fā)酵過程中醪液的pH，抑制部分輔料活力，降低酒精的產(chǎn)率[7-8]。傳統(tǒng)酒精企業(yè)一般發(fā)酵時添加漂白粉、青霉素、安菌泰和克菌靈等含有抗藥性的殺菌劑[9-13]，通過發(fā)酵副產(chǎn)物DDGS飼料作為動物營養(yǎng)的重要蛋白質(zhì)來源，對酒精企業(yè)的經(jīng)濟效益做出重要貢獻。但是，過量的使用以抗生素為主的殺菌劑，會使雜菌產(chǎn)生抗藥性[14-15]，抑菌或殺菌不起作用，嚴重影響酒精發(fā)酵效果[16]。

食品級生物殺菌劑菌肽寶是從巴西引進的新一代綠色生物制劑產(chǎn)品，它具有廣譜高效殺菌作用，對酒精發(fā)酵中出現(xiàn)的雜菌有較好的抑制作用，解決了食用酒精生產(chǎn)輔料添加合規(guī)性問題，它屬于混合型天然抑菌劑，其成分主要是抑制細菌細胞壁合成破壞細菌、野生酵母菌和霉菌的細胞壁，使細胞壁中的糖苷鍵和肽鍵斷裂，最后導致細菌死亡，對革蘭氏陽性菌和棒桿菌極其敏感，抑制力強，效果好。因此，菌肽寶對酒精發(fā)酵的有害細菌和乳酸菌、醋菌、丁酸菌有明顯的抑制作用，是目前為止比較有前景的酒精發(fā)酵專用抑制劑，并且符合《食品添加劑使用標準》（GB 2760 —2014標準）。

2019年，廣西中糧生物質(zhì)能源有限公司開展無抗殺菌劑的篩選，歷時半年，將生產(chǎn)上使用的安菌泰與菌肽寶AK200、乳酸鏈球菌素、安菌寧和抑菌康4種無抗產(chǎn)品通過小試和大生產(chǎn)試驗，成功篩選到一種菌肽寶AK200無抗食品級生物殺菌劑。該無抗殺菌劑成功篩選，踐行了中糧集團質(zhì)量安全管理紅線，解決食用酒精生產(chǎn)中輔料添加合規(guī)性問題。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

生產(chǎn)車間陳化水稻液化醪、安菌寧、抑菌康、菌肽寶AK200（山東安茂康生物科技有限公司生產(chǎn)）、乳酸鏈球菌素（浙江新銀象生物工程有限公司生產(chǎn)）、杰能科淀粉酶（杰能科中國生物工程有限公司生產(chǎn)）、隆科特糖化酶（山東隆科特酶制劑有限公司生產(chǎn)）、酸性蛋白酶（廣西樂酵生物科技有限公司生產(chǎn)），發(fā)利酒用高活性干酵母（英聯(lián)馬利（北京）食品銷售有限公司生產(chǎn)），安菌泰（柳州龍?zhí)┛萍加邢薰旧a(chǎn)），氨水（含氮17%）、0.25%葡萄糖、0.5%次甲基藍指示劑、斐林試劑、20%氫氧化鈉、20%鹽酸、65%硫酸，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

電子天平（梅特勒-托利多公司生產(chǎn)，型號：AL204）、工業(yè)天平（湘儀天平儀器設備有限公司生產(chǎn)，型號：TP-20 KF）、數(shù)字式黏度計（上海精天電子儀器有限公司生產(chǎn)，型號：NDJ-5S）、快速水分滴定儀（廣州市艾安得有限公司生產(chǎn)，型號AND MF-50）、恒溫水浴鍋（江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司生產(chǎn)，型號：XMTD-204）、攪拌器（天津華興偉業(yè)實驗儀器有限公司生產(chǎn)，型號：D-8401型-WT）、精密型臺式pH/電導率測量儀（梅特勒-托利多公司生產(chǎn)，型號：S40）、恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智誠分析儀器制造有限公司生產(chǎn)，型號：ZHWY-2102）、容量瓶、電子萬用爐（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司生產(chǎn)，型號：一聯(lián)電壓，220 V ，功率為1 kW）、三角瓶等。

1.3 試驗方法

1.3.1 食用酒精液化發(fā)酵工藝路線簡述

食用酒精液化發(fā)酵工藝路線如下：水稻原料→粉碎→拌料→高溫液化→同步糖化發(fā)酵→蒸餾→過濾→濾渣烘干→酒糙蛋白飼料→食用酒精[17]。

水稻原料預處理：將一定量的水稻通過預粉碎、分級篩除掉沙石、鐵等其他雜物，再用篩網(wǎng)孔徑為2.0 mm的粉碎機進行粉碎，在粉漿罐中添加工藝水、清液和中水，調(diào)配成一定干物濃度的粉漿后輸送至液化工段。

液糖化及發(fā)酵：通過管線輸送到粉漿罐內(nèi)，按一半比例加入耐高溫淀粉酶，物料攪拌混合均勻后進行噴射液化。閃冷后輸送到液化罐，加入另一半淀粉酶，保溫90 min至碘試檢測液化合格。采用同步糖化發(fā)酵，即液化醪分別輸入發(fā)酵罐和酒母罐，分批添加糖化酶。在活化罐內(nèi)將活化好的酵母與液化醪連續(xù)輸入酒母罐培養(yǎng)一段時間得到酒母醪，成熟的酒母醪與降溫后的液化醪同時流入發(fā)酵罐，發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，發(fā)酵70 h成熟后由泵輸送到蒸餾工段。

蒸餾工藝：蒸餾采用五塔差壓精餾流程。粗鎦塔是將原料液進行初步分離，廢醪輸出離心;精塔是對粗塔塔頂收集的酒精進行提濃，排除廢水，用于拌料;脫醛塔和脫甲醇塔主要分離甲醇和醛類物質(zhì)，得到優(yōu)質(zhì)的食用酒精;其他工業(yè)酒精和雜醇油通過回收塔流出。精餾工藝采用的是差壓耦合精餾技術(shù)。

飼料工段：飼料車間收集粗塔蒸除的廢醪，添加板框過濾或臥螺離心機分離出清液和濕糟。部分清液回配，其余清液濃縮成糖漿，然后與濕糟進行均勻混配，通過管束干燥機干燥，出料水分小于12%，即為飼料（DDGS），再通過二級風送至飼料庫房，包裝。

1.3.2 不同殺菌劑小試發(fā)酵試驗

取生產(chǎn)車間液化醪，用65%硫酸調(diào)節(jié)pH至4.40左右，檢測液化醪固形物含量，分裝已滅菌500 mL的三角瓶（400 g/瓶），搖勻。使用發(fā)利酒用活性干酵母為菌種，接種含量為0.1%液化醪，加入糖化酶0.68 kg/t粉、酸性蛋白酶0.06 kg/t粉，以加入5 mg·L-1的安菌泰殺菌劑、乳酸鏈球菌素、菌肽寶AK200、抑菌康、安菌寧5個因素條件進行發(fā)酵對比實驗，以酒精度（%vol）、殘總糖（%）、揮發(fā)酸（g·L-1）為判定指標，確定適合抑制發(fā)酵生產(chǎn)使用的無抗生物殺菌劑。用紗布封口，稱重量，然后置于30 ℃、120 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)8 h后調(diào)節(jié)溫度至33 ℃，靜止發(fā)酵至70 h。發(fā)酵期間每天稱1次重量，記錄失重，發(fā)酵結(jié)束后檢測殘還原糖、殘總糖、酒精度、酵母數(shù)等指標，同時進行液相色譜分析檢測。

1.3.3 兩種殺菌劑大生產(chǎn)發(fā)酵試驗

在前期小試發(fā)酵試驗基礎上，將菌肽寶AK200作為發(fā)酵過程中添加的試驗組，生產(chǎn)上現(xiàn)有的安菌泰作為試驗對照組，2020年4月2～10日使用菌肽寶AK200進行生產(chǎn)試驗，與使用安菌泰的發(fā)酵成熟醪液的生產(chǎn)數(shù)據(jù)指標進行對比。入料4 h前，往發(fā)酵罐添加2 kg菌肽寶AK200，然后每2 h往酒母罐里添加1 kg菌肽寶;入料4 h前，往發(fā)酵罐添加2 kg安菌泰，然后每2 h往酒母罐里添加1 kg安菌泰。

1.4 分析檢測方法

醪液黏度檢測：使用黏度計NDJ-5S;酒母質(zhì)量檢測：血球計數(shù)版法;蒸餾酒分檢測：圓底燒杯蒸餾法;殘總糖、殘過濾總糖、殘還原糖檢測：斐林試劑法;揮發(fā)酸、酸度檢測：中和滴定法;發(fā)酵成熟醪各試驗組的測定采用高效液相色譜法，色譜條件：色譜柱，伯樂HPX-87H;流動相為0.005 mol /L H2SO4，泵流速為0.5 mL/L，柱溫為65 ℃，RID設置溫度為50 ℃，進樣量為10μL，運行時間為30 min[18-21]。

1.5 計算公式

殘淀粉（%）=（殘總糖-過濾總糖）×0.9[22]

殘糊精（%）=（過濾總糖-還原糖）×0.9[22]

2 結(jié)果與分析

2.1 不同殺菌劑小試化學檢測結(jié)果

通過使用車間液化醪共進行了3批次重復小試試驗研究，由表1中的檢測結(jié)果可以看出，從成熟醪發(fā)酵失重、蒸餾酒分及殘?zhí)沁M行對比分析，安菌泰與菌肽寶AK200酒分一致且略高于其他3種殺菌劑，添加抑菌康的酒分最低，由于抑菌康和安菌寧只能對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有抑制作用，因此不能起到有效的抑制其他細菌的作用。乳酸鏈球菌素[20]主要抑制枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌和部分的梭菌屬且pH越低效果越好，酒精發(fā)酵后pH會有所升高，但會降低抑菌殺菌效果。在產(chǎn)酸方面，抑菌康試驗小組的酸度高，發(fā)酵效果不好，抑菌效果不太明顯?？傮w來說，菌肽寶AK200殺菌劑的效果較好，相比其余3種殺菌劑，其發(fā)酵后的殘?zhí)瞧?、產(chǎn)酸偏低、酒分偏高。綜合發(fā)酵檢測結(jié)果，發(fā)酵效果依次是菌肽寶AK200>抑菌康>安菌泰>安菌泰>乳酸鏈球菌素。實踐證明，在淀粉質(zhì)原料酒精發(fā)酵中無抗殺菌劑菌肽寶AK200替代原有安菌泰是可行的。

2.2 不同殺菌劑液相色譜檢測結(jié)果

從表2可以看出，不同的5種殺菌劑的糖組分除DP4+含量相差較多外，其他還原性糖基本都被酵母利用，琥珀酸和乙酸含量都在可控范圍以內(nèi)。但是，乳酸鏈球菌素、抑菌康和安菌寧3種殺菌劑的乳酸含量對比其他2種的相差較大，說明發(fā)酵過程中可能出現(xiàn)染菌，抑菌殺菌效果不明顯。乙醇與甘油比值是反映酒精發(fā)酵水平的一個重要指標，但是食用酒精中雜醇油的含量越低對分離提取效果越好，乙醇相對于副產(chǎn)物甘油的比值越高，說明發(fā)酵水平越高[23-24]，必須控制在合理的范圍以內(nèi)，數(shù)據(jù)顯示添加菌肽寶Ak200發(fā)酵乙醇與甘油之比最高，說明發(fā)酵效果最好，副產(chǎn)物較低。

2.3 兩種不同殺菌劑大生產(chǎn)試驗

乙醇生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的揮發(fā)酸主要是由酵母菌、乳酸菌及醋酸菌代謝生成，衡量乙醇產(chǎn)率的多少主要是看揮發(fā)酸含量的多少[20]。因此，生產(chǎn)過程中應盡可能地控制乙醇中揮發(fā)酸的含量。由圖1可知，自4月2日4號發(fā)酵罐開始使用菌肽寶AK200后，24 h揮發(fā)酸逐漸下降，并穩(wěn)定在0.20 mg·L-1以下，在各項液化出料溫度、發(fā)酵溫度可控的前提下，相對前期使用安菌泰效果穩(wěn)定，未見異常波動。

從表3可以看出，在前段工序生產(chǎn)工藝一致的前提下，使用菌肽寶AK200后各項指標優(yōu)于安菌泰，升酸差，較安菌泰低0.72 mg·L-1，揮發(fā)酸低于0.07 mg·L-1，殘總糖、殘淀粉和殘糊精都有明顯的下降，同時死亡率有所升高。

3 結(jié)論與討論

本文使用廣西中糧生物質(zhì)能源有限公司生產(chǎn)線上陳化水稻粉進行小試和大生產(chǎn)多批次重復發(fā)酵試驗，經(jīng)過生產(chǎn)線上數(shù)據(jù)對比研究，菌肽寶復合型抑菌劑應用于酒精發(fā)酵抑菌控酸效果明顯，能夠及時地替代殺菌劑安菌泰，而且在現(xiàn)有生產(chǎn)工藝不變的情況下，對酵母的乙醇產(chǎn)率幾乎沒有影響，同時降低了殘?zhí)侵笜?，有利于清液干物濃度降低和廢液處理，節(jié)省企業(yè)生產(chǎn)成本。廣西北海夏季溫度較高，最高達40 ℃，而酒精發(fā)酵溫度是影響酵母繁殖代謝的主要原因之一，同時會產(chǎn)生一些其他物質(zhì)，溫度過高不易抑制雜菌，因此需要加大酵母和殺菌劑的比例，以提高發(fā)酵效率和減少損失。

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