白藜蘆醇介導Nrf2/ARE信號通路對大鼠草酸鈣腎結(jié)石模型的抗氧化損傷作用

阿不都賽買提·艾力，辛瑞平，阿斯木江·阿不拉，郭明月，關(guān)永志，陳慶虎，木拉提·馬合木提

(1.伊犁哈薩克自治州新華醫(yī)院泌尿外科，新疆伊寧 835000；2.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科，新疆烏魯木齊 830054；3.新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院泌尿外科，新疆烏魯木齊 830063)

腎結(jié)石是一種常見病，手術(shù)費用較高又容易復發(fā)，故如何預防腎結(jié)石及其復發(fā)成為現(xiàn)代泌尿外科面臨的最大挑戰(zhàn)之一[1]。有資料顯示，腎組織中草酸和草酸鈣晶體對腎小管上皮細胞的損傷是結(jié)石形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[2]。當細胞因各種原因受損時，細胞內(nèi)大量產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)在促進氧化損傷過程中起著重要作用[3]。腎小管上皮細胞含內(nèi)源性細胞防御系統(tǒng)能夠?qū)寡趸瘧し磻?，核因子E2相關(guān)因子 2(nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2)是該系統(tǒng)的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[4-5]。Nrf2在肝、腎、肺等組織細胞中普遍表達，并且在細胞應激增加時轉(zhuǎn)移到細胞核中，與抗氧化原件(antioxidant response elements，ARE)結(jié)合，啟動氧化還原相關(guān)的靶基因蛋白質(zhì)的表達，阻止ROS的升高，從而保持細胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡[6]。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種具有抗氧化、抗衰老功能的天然多酚類化合物，能減少或清除ROS的產(chǎn)生[7-9]，但Res能抑制草酸引起的腎小管上皮細胞損傷，減輕或抑制草酸鈣腎結(jié)石形成的研究報道尚少見。鑒于此，本研究主要探討Res在大鼠草酸鈣腎結(jié)石模型中與Nrf2抗氧化作用的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級健康雄性SD大鼠24只，7～8周齡，體質(zhì)量180～220 g，由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供。

1.2 實驗材料及儀器乙二醇、氯化銨購自美國Sigma公司；Res(批號 H20181208，產(chǎn)地：西安，純度：99.4%)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、丙二醛(malondialdehde，MDA)檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。-80 ℃超低溫冰箱(型號DW-86L388J，山東海爾)，化學發(fā)光成像儀系統(tǒng)(型號Chemiscope 3000，上海勤翔科學儀器有限公司)，光學顯微鏡(型號BX41，Olympus)，大鼠代謝籠(蘇州馮氏籠具廠)，飼料(江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司)。

1.3 動物分組、造模將24只SD大鼠適應性喂養(yǎng)7 d，12∶12 h明暗晝夜循環(huán)，標準實驗鼠糧，自由供食水。采用隨機數(shù)字表，將大鼠隨機分為正常對照組、結(jié)石模型組、結(jié)石模型+Res干預組，每組8只。根據(jù)文獻[10]報道的方法，正常對照組自由飲食水；結(jié)石模型組自由飲水并用乙二醇+氯化銨混合液灌胃，2 mL/d；結(jié)石模型+Res干預組在結(jié)石模型組的基礎(chǔ)上加用Res灌胃，每日200 mg/kg[11]，與結(jié)石模型組藥物間隔8 h。3組其他飼養(yǎng)條件均一致，連續(xù)28 d，末次給藥24 h后，水合氯醛(3 mg/kg)腹腔注射麻醉后剖腹并取腎，一側(cè)腎臟立刻放入液氮中待做腎組織勻漿，另一側(cè)腎臟浸泡在多聚甲醛液中用于病理分析,最后頸椎脫臼處死大鼠。

1.4 腎組織病理學檢查石蠟組織切片制作：各組大鼠腎組織制作石蠟切片后行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色，光鏡觀察并拍照。結(jié)晶評分標準：0級為無結(jié)石、結(jié)晶形成；1級為少量結(jié)石、結(jié)晶形成，每個視野3個以下；2級為較多的結(jié)石、結(jié)晶形成，每個視野3～5個；3級為較多結(jié)石、結(jié)晶形成，每個視野6～10個；4級為大量結(jié)石、結(jié)晶形成，每個視野10個以上，甚至結(jié)石、結(jié)晶成團，堵塞腎小管。將0-4級分別記為1、2、3、4、5分[12]。

1.5 實時熒光定量聚合酶連鎖反應(real-time quantitativepolymerase chain reaction，RT-qPCR)測定腎組織Nrf2的mRNA表達取大鼠腎組織樣本，采用Trizol 法提取總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA的含量及純度后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa 公司，日本)說明合成cDNA。PCR擴增所用Nrf2的上游引物序列為5′-TTCCTCTGCTGCCATTAGTCAGTC-3′，下游引物引物序列為 5′-GCTCTTCCATTT′CCGAGTCACTG-3′；β-actin的上游引物序列為 5′-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3′，下游引物序列為 5′-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′。93 ℃預變性5 min，61 ℃退火1 min，71 ℃延伸50 s，共35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。采用2-△△Ct法計算相對表達量。

1.6 Western blot測定腎組織Nrf2的蛋白水平液氮研磨后取100 mg腎組織，加入500 μL RIPA裂解液(已加入蛋白酶抑制劑)，充分混勻。4 ℃放置60 min后冰上勻漿，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，收集上清，BCA法測定蛋白濃度。取總蛋白30 μg，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)模和封閉后，加入抗Nrf2(1∶500)和抗β-actin(1∶2 500)抗體4 ℃孵育過夜，加入Ⅱ抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h，在ChemiScope 化學發(fā)光成像儀系統(tǒng)中檢測、拍照，用ImageJ軟件測量條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參照，進行定量分析。

1.7 腎組織氧化應激指標的檢測取1 g腎皮質(zhì)，剪碎并加入適量冷裂解液后進行研磨勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液100 μL，嚴格按說明書步驟檢測MDA、SOD、CAT、GSH含量。

2 結(jié) 果

2.1 各組腎組織病理損傷及結(jié)晶評分的比較光學顯微鏡下觀察腎組織，HE病理切片顯示(圖1)：正常對照組大鼠腎皮質(zhì)、髓質(zhì)無結(jié)晶形成，無鈣化點，細胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰；結(jié)石模型組大鼠皮質(zhì)腎小管區(qū)可見管腔顯著擴張、萎縮改變及大量透明的草酸鈣結(jié)石晶體；結(jié)石模型+Res干預組：大鼠腎小管區(qū)擴張伴炎癥反應，未見明顯結(jié)石晶體沉積，可見極少量結(jié)石晶體沉積和炎癥細胞浸潤，圖1。

結(jié)石模型組大鼠的結(jié)晶評分(8.6±3.1)明顯高于正常對照組(1.0±0.0)和結(jié)石模型+Res干預組(1.3±0.7)，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 腎組織Nrf2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平RT-qPCR結(jié)果顯示，與正常對照組相比，結(jié)石模型組大鼠腎組織中Nrf2 的mRNA表達量明顯降低(P<0.05)；與結(jié)石模型組相比，結(jié)石模型+Res干預組能夠顯著提高Nrf2的mRNA的表達量(P<0.05，圖2)。

*與對照組比較，P<0.05；#與結(jié)石組比較，P<0.05。

2.3 腎組織Nrf2蛋白半定量分析結(jié)果Western blot方法檢測結(jié)果顯示，與正常對照組相比，結(jié)石模型組大鼠腎組織中Nrf2蛋白的表達量明顯降低(P<0.05)；與結(jié)石模型組相比，結(jié)石模型+Res干預組能夠顯著提高Nrf2蛋白的表達量(P<0.05，圖3)。

A：正常對照組，B：結(jié)石模型組，C：結(jié)石模型+Res干預組。*與對照組比較,P<0.05；#與結(jié)石組比較，P<0.05。

2.4 腎組織MDA、GSH、SOD、CAT含量的測定結(jié)果與正常對照組相比，結(jié)石模型組大鼠腎組織中MDA的含量明顯升高(P<0.05)，而CAT活力、SOD及GSH含量顯著降低(P<0.05)；與結(jié)石模型組相比，結(jié)石模型+Res干預組大鼠腎組織MDA的含量明顯降低(P<0.05)，而CAT活力、SOD及GSH含量顯著升高(P<0.05，見圖4)。

A:丙二醛(MDA);B:超氧化物歧化酶(SOD);C:過氧化氫酶(CAT);D:谷胱甘肽(GSH);*與對照組比較,P<0.05；#與結(jié)石組比較，P<0.05。

3 討 論

近年流行病學調(diào)查研究顯示，世界各地腎結(jié)石病的發(fā)病率正在逐年增高[13]。雖然發(fā)展迅速的微創(chuàng)手術(shù)拓展了腎結(jié)石切除術(shù)的治療范圍、提高了結(jié)石清石率，但腎結(jié)石高發(fā)病率與高復發(fā)率仍是泌尿外科醫(yī)師面臨的問題。國外研究者對2 200余例泌尿系結(jié)石患者進行了回顧性隊列研究，結(jié)果顯示：初次發(fā)病者，結(jié)石處理后2、5、10、15年的復發(fā)率分別為11%、20%、31%、39%[14]，故怎樣預防高復發(fā)率已成為熱點問題之一。目前關(guān)于草酸鈣腎結(jié)石形成的確切機制尚未清楚，但腎小管上皮細胞氧化損傷和尿液中抑制成石物質(zhì)的減少致結(jié)石晶體粘附、聚集的理論依據(jù)已不斷被證實[15]。此外，高草酸尿和晶體沉積與脂質(zhì)氧化和腎小管上皮細胞損傷之間有著密切聯(lián)系[16-17]。故本研究在前期實驗的基礎(chǔ)上，用乙二醇促進大鼠尿中草酸和草酸鈣的形成，氯化銨促進腎小管上皮細胞的損傷，最終成功建立SD大鼠草酸鈣腎結(jié)石模型[18]。KHAN等[19]研究發(fā)現(xiàn)，ROS是腎臟氧化應激過程中的重要介體，在高草酸尿癥或草酸鈣腎結(jié)石形成過程中可能參與各種信號通路。因此，許多研究者在建立草酸鈣腎結(jié)石大鼠模型的同時，通過使用抗氧化劑來減少或干預ROS的產(chǎn)生，進而改善由草酸引起的氧化損傷，防止草酸鈣晶體粘附成石[20-21]。

Res又名 3,4′,5-三羥基芪，是一種多酚類化合物[22]，廣泛存在于自然界多種植物中，如葡萄(尤其是葡萄皮)、藍莓、花生和紅葡萄酒中，其具有抗癌、抗炎、抗氧化等作用[23]。本研究發(fā)現(xiàn)：結(jié)石模型大鼠腎組織切片HE染色后光鏡下可見腎小管內(nèi)大量呈透明、片狀草酸鈣晶體形成，而結(jié)石模型+Res干預組中腎小管擴張不明顯、周圍炎細胞浸潤以及管腔內(nèi)草酸鈣晶體明顯減少，提示Res通過其抗氧化作用可以有效干預結(jié)石晶體粘附、聚集和生長。腎結(jié)石形成過程的主要環(huán)節(jié)離不開腎小管上皮細胞的氧化損傷，而Res正是以其具有的抗氧化作用來降低草酸所誘導的ROS和MDA形成以及促進SOD的活性，抑制結(jié)石的形成[24]。

在氧化應激存在時，大量形成的ROS可以損害細胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA，此時可以測定脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，如MDA可以間接了解機體的氧化損傷程度[25]。研究還發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)有一些抗氧化酶，對抗ROS及清除自由基來保護細胞的完整性，如SOD、GSH、CAT[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)石模型組腎組織勻漿中MDA含量增加，表明大鼠體內(nèi)發(fā)生氧化損傷反應，而SOD、GSH、CAT含量降低，提示機體抗氧化能力減弱。而結(jié)石模型+Res干預組中MDA含量明顯降低，SOD、GSH、CAT含量明顯升高，說明Res通過上調(diào)該抗氧化酶的表達起到抗氧化應激作用。

Res的抗氧化損傷作用在多種疾病中都與 Nrf2/ARE 信號通路有關(guān)[27]。Nrf2/ARE 通路是氧化應激反應中的關(guān)鍵通路，其中Nrf2為機體降低ROS、減輕氧化應激的重要轉(zhuǎn)錄因子，Keap1是調(diào)節(jié)Nrf2活性細胞抗氧化途徑的調(diào)節(jié)蛋白[28]。正常情況下Nrf2在胞質(zhì)中與抑制因子Keap1結(jié)合，處于失活狀態(tài)，無法進入細胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性，當受到ROS刺激時，Keap1構(gòu)象改變后與Nrf2解離[29]。激活的 Nrf2 進入細胞核，識別并結(jié)合DNA上的ARE結(jié)合，由此促進下游靶基因的表達，介導一系列下游抗氧化應激酶的產(chǎn)生，提高機體抗氧化能力[30-31]。本研究采用RT-qPCR和Western blot法對各組大鼠腎組織Nrf2的mRNA和蛋白表達水平進行半定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)石模型組Nrf2的mRNA和Nrf2蛋白的表達較正常對照組明顯下降，考慮其原因可能是因乙二醇與氯化銨引起的氧化損傷過程中Nrf2蛋白消耗增加所致，而給予Res后則激活Nrf2轉(zhuǎn)為入核，上調(diào)下游抗氧化酶SOD、GSH、CAT的表達，清除或減少由草酸誘導產(chǎn)生的ROS，減輕氧化損傷，提高腎小管上皮細胞的抗氧化損傷能力。說明Res可能通過調(diào)控Nrf2信號通路抑制草酸鈣成石作用，其具體機制仍需進一步深入探討。

綜上所述，本研究證實Res可以顯著干擾乙二醇和氯化銨所引起的大鼠腎臟草酸鈣結(jié)石的形成，并初步揭示了其作用機制可能與Nrf2/ARE信號通路有關(guān)，但氧化應激所涉及的其他信號通路也很多，如Wnt信號通路、PI3K/AKT信號通路、AMPK信號通路，且每一個信號通路之間相互關(guān)聯(lián)，具體機制仍需要進一步研究探討。