免疫親和柱-高效液相色譜法測定餅干中赭曲霉毒素A的含量

孫小杰，宗凌麗，應(yīng) 月，楊軍麗

（南京市食品藥品監(jiān)督檢驗院，江蘇南京 211198）

赭曲霉毒素是一組結(jié)構(gòu)類似的真菌毒素，有A、B、C、D 4種化合物，主要危及人和動物腎臟，其中毒性最大、與人類健康關(guān)系最密切、產(chǎn)毒量最高、對農(nóng)作物的污染最重及分布最廣的是赭曲霉毒素A[1]。赭曲霉毒素A致癌、致畸、破壞免疫系統(tǒng)，對肝、腎臟造成損害，還可以導致神經(jīng)中毒[2]。為了保障人民的身體健康，《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）規(guī)定了谷物及其制品（不包括焙烤食品）中赭曲霉毒素A的限量為5.0 μg/kg[3]。

2021年4月，瑞典通過歐盟食品和飼料快速預(yù)警系統(tǒng)通報出口至我國的薄脆餅干中赭曲霉毒素A含量不合格，目前文獻報道的赭曲霉毒素A的方法主要涉及糧食及其制品、咖啡、酒[4-6]，針對餅干中赭曲霉毒素A測定技術(shù)的研究較少。因此有必要建立餅干中赭曲霉毒素A的檢測方法，為開展餅干中赭曲霉毒素A的風險監(jiān)測提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀：島津LC-20AD型，配有熒光檢測器，日本島津公司；電子天平：XS205型，瑞士 Metler—Toledo公司；固相萃取裝置：Wat200609，美國Waters公司；免疫親和柱：3mL，青島普瑞邦生物工程有限公司；氮吹儀：N-EVAP，美國Organomation公司；離心機：ROTINA 35，德國Hettich公司；

甲醇、乙腈，色譜純，美國ROE公司；冰乙酸、氯化鈉、碳酸氫鈉、磷酸氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、吐溫20，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；赭曲霉毒素標準物質(zhì)，上海安譜實驗科技股份有限公司；實驗室用水為經(jīng)Mili-Q凈化系統(tǒng)（0.22 μm過濾膜）過濾的超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

（1）赭曲霉毒素A標準儲備液。稱取赭曲霉毒素A標準品1.0 mg，用乙腈-甲醇溶液（50∶50）溶解并定容至100 mL，配成10 μg/mL的標準儲備液，-20 ℃保存。赭曲霉毒素A標準工作液：準確移取赭曲霉毒素A標準儲備液5 μL、10 μL、50 μL、100 μL和200 μL至100 mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，分別配成0.5 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL的標準工作液，4 ℃保存。

（2）真菌毒素清洗緩沖液。①先將12.5 g氯化鈉、2.5 g碳酸氫鈉溶于約250 mL水中，加入0.05 mL吐溫20，用水定容至500 mL。②磷酸鹽緩沖液。將4.0 g氯化鈉、0.6 g磷酸氫鈉、0.1 g磷酸二氫鉀、0.1 g氯化鉀溶于約490 mL水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0，用水定容至500 mL。

1.2.2 樣品提取

稱取粉碎均勻的試樣25.0 g，加入100 mL甲醇-水溶液（80∶20），高速均質(zhì)5 min后用定量濾紙過濾，準確移取4 mL濾液于離心管中，加入26 mL磷酸鹽緩沖液后混勻，混合液備用。

1.2.3 樣品凈化

將免疫親和柱連接于20 mL玻璃注射器下，將混合液分兩次注入玻璃注射器中。調(diào)節(jié)流速約1滴/s，直至空氣進入親和柱中，依次用真菌毒素清洗緩沖液10 mL、水10 mL連續(xù)淋洗親和柱，調(diào)節(jié)流速1～2滴/s，棄去全部流出液，抽干親和柱。加入1.5 mL甲醇，調(diào)節(jié)流速約為1滴/s，用試管收集全部洗脫液，在45 ℃下水浴氮氣吹干，用500 μL流動相溶解，供檢測用。

1.2.4 提取溶劑的選擇

甲醇-水溶液（80∶20）與乙腈-水溶液（60∶40）作為提取溶劑，回收率能達到90%以上，但考慮到乙腈的毒性，選擇甲醇-水溶液（80∶20）作為提取溶劑。

1.2.5 液相色譜條件

色譜柱：Eclipse plus-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm，美國agilent公司）；柱溫35 ℃；熒光檢測器激發(fā)波長333 nm,發(fā)射波長460 nm；流動相：乙腈-水-冰乙酸（48∶51∶1），等度洗脫；流速：1.0 mL/mL；進樣量：50 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性方程與定量限

赭曲霉毒素A在0.5～20.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)，標準溶液的質(zhì)量濃度x與色譜峰面積y呈良好的線性關(guān)系（r≥0.999 1），線性方程為y=9 915.48x+1 391.31，以信噪比為S/N≥10時確定定量限為1.0 μg/kg，歐盟規(guī)定餅干中赭曲霉毒素A限量值為3.0 μg/kg，方法定量限滿足檢測的需求。

2.2 方法回收率與精密度試驗

通過向陰性樣品中添加1.0 μg/kg、3.0 μg/kg、10.0 μg/kg 3個濃度水平的赭曲霉毒素A標準溶液，進行方法回收率和精密度試驗，測定結(jié)果見表1。

表1 方法回收率和精密度實驗結(jié)果

由表1可見，赭曲霉毒素A的回收率在80.33%～97.20%，相對標準偏差為3.44%～7.22%，符合GB/T 27404—2008中檢測方法確認的要求。

3 結(jié)論

對餅干進行前處理，然后采用高效液相色譜法對赭曲霉毒素A進行測定，從而建立了餅干中赭曲霉毒素A測定的檢測方法。本方法簡便準確，實用性強，可為餅干中赭曲霉毒素A風險監(jiān)測提供可靠的技術(shù)支持。