梔子和淡豆豉不同比例配伍對梔子豉湯中黃酮類成分含量的影響

李函陽 邱智東 蘇文龍 曹文正 李昕曈 蔣常鵬 高紅梅

中圖分類號 R283;R284 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）09-1103-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.09.15

摘 要 目的：考察梔子與淡豆豉以不同比例配伍后對梔子豉湯中染料木素和總黃酮含量的影響，進一步探究梔子豉湯的配伍規(guī)律。方法：采用煎煮法分別制備梔子與淡豆豉不同配伍比例（2 ∶ 1、1 ∶ 1、1 ∶ 2、1 ∶ 4，質(zhì)量比，下同）的梔子豉湯以及相應比例梔子、淡豆豉的單煎液。采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法測定不同配伍比例梔子豉湯以及相應比例淡豆豉單煎液中染料木素的含量;采用紫外分光光度（UV）法測定不同配伍比例梔子豉湯以及相應比例梔子單煎液、淡豆豉單煎液中總黃酮的含量。結(jié)果：建立的含量測定方法的線性關(guān)系、精密度、重復性、穩(wěn)定性、準確度均良好。梔子與淡豆豉不同配伍比例（2 ∶ 1、1 ∶ 1、1 ∶ 2、1 ∶ 4）的梔子豉湯中染料木素含量較相應單煎液均有不同程度的降低，而總黃酮含量均有不同程度的升高。隨著淡豆豉用量的增加，梔子豉湯中染料木素含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當梔子與淡豆豉的配伍比例為1 ∶ 1、1 ∶ 2時，梔子豉湯中染料木素含量最高（均為0.071 ?g/mL）。隨著淡豆豉用量的增加，梔子豉湯中總黃酮含量變化無明顯規(guī)律，但在梔子與淡豆豉的配伍比例為1 ∶ 1時梔子豉湯中總黃酮含量最高（1.861 ?g/mL）。結(jié)論：當梔子與淡豆豉按1 ∶ 1的比例配伍時梔子豉湯中黃酮類成分的含量最高。

關(guān)鍵詞 梔子豉湯;淡豆豉;配伍規(guī)律;染料木素;總黃酮;含量測定

Effect of Different Compatibility Ratio of Gardenia jasminoides to Fermented Soybean on the Content of Flavonoids in Zhizichi Decoction

LI Hanyang，QIU Zhidong，SU Wenlong，CAO Wenzheng，LI Xintong，JIANG Changpeng，GAO Hongmei（College of Pharmacy， Changchun University of TCM， Changchun 130117， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the effects of different compatibility ratio of Gardenia jasminoides to fermented soybean on the content of genistein and total flavonoids， and to investigate the compatibility regularity of Zhizichi decoction. METHODS：The decoction method was used to prepare the mixed decoction with different compatibility ratio of G. jasminoides to fermented soybean （2 ∶ 1， 1 ∶ 1， 1 ∶ 2， 1 ∶ 4， m/m， the same hereinafter）. UPLC-MS/MS method was used to determine the content of genistein in Zhizichi decoction with different compatibility ratio and corresponding fermented soybean single decoction. UV method was used to determine the content of total flavonoids in Zhizichi decoction with different compatibility ratio and corresponding gardenia single decoction and fermented soybean single decoction. RESULTS： The established method had good linearity， precision， repeatability， stability and accuracy. Compared with single decoction， the content of genistein in the mixed decoction with different compatibility ratio of G. jasminoides to fermented soybean （2 ∶ 1， 1 ∶ 1， 1 ∶ 2， 1 ∶ 4） was decreased to different extents， while the content of total flavonoids was increased to different extents. With the increase of fermented soybean， the content of genistein in the decoction increased at first and then decreased. When the compatibility ratios of G. jasminoides to fermented soybean were 1 ∶ 1 and 1 ∶ 2， the content of genistein in the decoction was the highest （all 0.071 μg/mL）. With the increase of fermented soybean， the content of total flavonoids in the decoction did not change regularly; when the ratio of G. jasminoides to fermented soybean was 1 ∶ 1， the content of total flavonoids in the decoction was the highest （1.861 μg/mL）. CONCLUSIONS： When the compatibility ratio of G. jasminoides to fermented soybean was 1 ∶ 1， the content of flavonoids in the decoction is the highest.

KEYWORDS Zhizichi decoction; Fermented soybean; Compatibility regularity; Genistein; Total flavonoids; Content determination

梔子豉湯出自漢代醫(yī)圣張仲景之《傷寒論》中太陽、陽明篇，由梔子和淡豆豉兩味藥組成[1]。方中梔子性寒，味苦，歸心、肺、三焦經(jīng);淡豆豉性涼，味苦、辛，歸肺、胃經(jīng)[2]。梔子可清熱瀉火，與能宣散邪熱的淡豆豉配伍后，可作為治療熱擾胸膈證和陽明郁熱證的基礎方[3]?，F(xiàn)代臨床中，梔子豉湯及其加減方可用于治療不寐、焦慮、郁證、漏汗等疾病[4]，療效顯著。梔子中主要含有環(huán)烯醚萜類、黃酮類成分，其中環(huán)烯醚萜類成分具有抗抑郁作用[5];淡豆豉中主要含黃酮類成分，包括大豆素、黃豆素、染料木素、黃豆苷、染料木苷等[5]，具有抗癌、預防心血管疾病、抗骨質(zhì)疏松等藥理作用[6]。據(jù)文獻報道，黃酮類化合物（如黃豆苷元、染料木素等）也具有較好的抗抑郁活性[7-9]。

中藥配伍不但可產(chǎn)生促進、抵消或消弱療效的作用，而且可降低、消除和產(chǎn)生毒副作用[10-12]，故掌握中藥方劑的配伍規(guī)律對于臨床應用有重要意義。筆者前期在查閱歷代中藥度量衡演變考論及仲景方用藥劑量的考察文獻后，推算出了梔子豉湯中梔子和淡豆豉的配伍比例為1 ∶ 4[13]（質(zhì)量比，下同），但是在梔子豉湯抗抑郁的現(xiàn)代臨床和實驗研究中，應用到的梔子與淡豆豉的比例多為2 ∶ 1[5]、1 ∶ 1[14]和1 ∶ 2[4]，這說明古方記載與現(xiàn)代研究中所應用的梔子豉湯比例有一定的出入。在前期研究中，筆者結(jié)合古今梔子豉湯應用的比例，考察了梔子和淡豆豉分別以2 ∶ 1、1 ∶ 1、1 ∶ 2、1 ∶ 4配伍后對梔子中抗抑郁活性成分總環(huán)烯醚萜苷和梔子苷含量的影響，并發(fā)現(xiàn)當梔子與淡豆豉的比例為1 ∶ 4時梔子豉湯中上述兩種成分含量均最高[13]。在本研究中，筆者將通過考察梔子與淡豆豉在不同比例（2 ∶ 1、1 ∶ 1、1 ∶ 2、1 ∶ 4）配伍時對梔子豉湯中總黃酮和染料木素含量的影響，進一步探究梔子豉湯的配伍規(guī)律，為其臨床應用及后續(xù)研究中配伍比例的選擇提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Acquity型超高效液相色譜儀、XEVO TQ-S型三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國Waters公司）;XS105型分析天平（美國Mettler-Toledo公司）;TU-1810型紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）;TGL-16-aR型高速離心機（上海安亭科學儀器廠）;KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;TRW50211KT型超純水器（美國 Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 藥品與試劑

梔子飲片（批號：170101）、淡豆豉飲片（批號：161001）均購自酒泉市培豐中藥材生態(tài)種植加工有限公司，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學藥學院翁麗麗教授鑒定分別為茜草科植物梔子（Gardenia jasminoides Ellis.）的干燥成熟果實和豆科植物大豆[Glycine max （L.） Merr.]成熟種子的發(fā)酵加工品;染料木素對照品（批號：111704-201703，純度：99.5%）、蘆丁對照品（批號：100080-201610，純度：91.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院;甲醇、乙腈和甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 梔子豉湯中染料木素含量的測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 （50 mm×2.1 mm，1.7 μm）;流動相：0.01%甲酸乙腈溶液（A） -0.01%甲酸水溶液（B），梯度洗脫 （0～2.2 min，10%A→100% A;2.2～2.5 min，100% A;2.5～2.6 min，100%A→10% A;2.6～3.0 min，10% A）;柱溫：40 ℃;流速：0.4 mL/min;進樣量：8 ?L。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源 （ESI）;檢測模式：正離子電離;質(zhì)譜掃描方式：多反應監(jiān)測（MRM）;選擇離子對質(zhì)荷比 （m/z）：271.3→153.5[15];毛細管電壓：1.5 kV;離子源溫度：150 ℃;霧化氣溫度：450 ℃;霧化氣流速：150 L/h;碰撞氣流：0.20 mL/min。

2.1.3 對照品溶液的制備 取染料木素對照品20.89 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）溶解，甲醇定容，得到質(zhì)量濃度為2.09 mg/mL的染料木素對照品母液。精密吸取上述母液5 ?L，加甲醇定容至1 mL，得到質(zhì)量濃度為10.45 ?g/mL的染料木素對照品稀釋液。分別取該稀釋液0.5、1、3、10、50、100 ?L，加甲醇定容至1 mL，制成質(zhì)量濃度分別為5.23、10.46、31.37、104.55、522.75、1 045.50 ng/mL的系列染料木素對照品溶液。

2.1.4 供試品溶液的制備 （1）梔子豉湯供試品溶液的制備：分別按比例（2 ∶ 1、1 ∶ 1、1 ∶ 2、1 ∶ 4，梔子和淡豆豉質(zhì)量比，下同）取梔子和淡豆豉共15.00 g[13]。先將梔子剪碎，加200 mL水，煎至水剩余約125 mL時，加淡豆豉（包煎），繼續(xù)煎至水剩余約75 mL時，絹布過濾，收集濾液，加水至75 mL，然后以12 000 r/min離心10 min，取上清液，即得不同配比梔子豉湯供試品溶液，記為S1～S4。（2）淡豆豉單煎供試品溶液的制備：分別按配伍比例取淡豆豉5.0、7.5、10.0、12.0 g，各加入125 mL水，煎至水剩余為75 mL時，絹布過濾，收集濾液，加水至75 mL，然后以12 000 r/min離心10 min，取上清液，即得淡豆豉單煎供試品溶液，記為S1′～S4′。

2.1.5 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.3”項下系列對照品溶液各5 μL，分別按“2.1.1”“2.1.2”項下條件進樣測定，記錄色譜圖。以染料木素質(zhì)量濃度（x）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標繪制標準曲線并進行回歸計算，得到染料木素的標準曲線回歸方程為y=85.236x+428.26（R2=0.999 7）。結(jié)果表明，染料木素質(zhì)量濃度在5.23～ 1 045.50 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.6 精密度試驗 取供試品溶液S1，按“2.1.1”“2.1.2”項下條件下連續(xù)進樣測定6次，記錄色譜圖。結(jié)果，染料木素峰面積的RSD為0.88%（n=6），表明該方法精密度良好。

2.1.7 重復性試驗 稱取梔子和淡豆豉（2 ∶ 1）共15.0 g，共6份，按“2.1.4（1）”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”“2.1.2”項下條件下進樣測定，記錄色譜圖，并根據(jù)標準曲線計算含量。結(jié)果，染料木素的平均含量為0.027 ?g/mL，RSD為1.32%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液S1和“2.1.3”項下染料木素對照品稀釋液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時，按“2.1.1” “2.1.2”項下條件下進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，供試品溶液S1、染料木素對照品稀釋液中染料木素峰面積的RSD分別為1.71%、1.23%（n=6），表明兩種溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性均良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 稱取梔子和淡豆豉（2 ∶ 1）適量，共9份，分別按已知含量的0.5、1、1.5倍比例加入染料木素對照品，再按“2.1.4（1）”項下方法制備梔子豉湯供試品溶液，然后按“2.1.1”“2.1.2”項下條件進樣測定，記錄色譜圖，并根據(jù)標準曲線計算含量進而計算加樣回收率。結(jié)果，染料木素的平均加樣回收率為99.78%，RSD為1.81%（n=9），表明本方法準確度較好。加樣回收率試驗結(jié)果見表1。

2.1.10 染料木素含量的測定 精密吸取“2.1.3”項下染料木素對照品稀釋液、“2.1.4”項下供試品溶液S1～S4和S1′～S4′，分別按“2.1.1”“2.1.2”項下條件下進樣測定，記錄色譜圖，根據(jù)標準曲線計算各溶液中染料木素的含量。結(jié)果顯示，梔子和淡豆豉不同比例配伍梔子豉湯中染料木素的含量均低于淡豆豉單煎液;隨著淡豆豉用量的增加，梔子豉湯中染料木素含量呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，當梔子與淡豆豉的配伍比例為1 ∶ 1、1 ∶ 2時梔子豉湯中染料木素含量最高。不同溶液的MRM圖見圖1，染料木素的二級質(zhì)譜圖見圖2，梔子豉湯、淡豆豉單煎液中染料木素含量的變化趨勢見圖3。

2.2 梔子豉湯中總黃酮的含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 取蘆丁對照品15.00 mg，精密稱定，加甲醇溶解并定容至50 mL，得質(zhì)量濃度為300.00 μg/mL的蘆丁對照品母液。取該母液18.3 mL，加甲醇定容至25 mL量瓶中，得質(zhì)量濃度為219.60 μg/mL的蘆丁對照品稀釋液。另分別吸取上述母液1.25、1.50、1.75、2.00、2.25、2.50 mL，加甲醇定容至3 mL，得質(zhì)量濃度分別為125、150、175、200、225、250 μg/mL的系列蘆丁對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 （1）不同配比梔子豉湯供試品溶液：按“2.1.4（1）”項下方法制備75 mL梔子和淡豆豉不同配比的梔子豉湯;分別取該煎液10 mL，蒸干，再用甲醇溶解并定容至25 mL量瓶中，得梔子和淡豆豉不同配比的梔子豉湯供試品溶液，記為S5～S8。（2）淡豆豉單煎供試品溶液：按“2.1.4（2）”方法稱取淡豆豉適量并制備75 mL淡豆豉單煎液;分別取該煎液10、20、10、10 mL，蒸干，用甲醇溶解并定容至25 mL量瓶中，即得淡豆豉單煎供試品溶液，記為S5′～S8′。（3）梔子單煎供試品溶液：按梔子豉湯中梔子比例分別取梔子10、7.5、5、3 g，分別加入200 mL水煎煮，煎至水剩余75 mL時，絹布過濾，收集濾液，加水稀釋至75 mL，即得梔子單煎液;分別取該煎液10 mL，蒸干，甲醇溶解并定容至25 mL量瓶中，即得梔子單煎供試品溶液，記為S5″～S8″。

2.2.3 檢測液和空白對照液的制備 取“2.2.1”項下蘆丁對照品稀釋液3 mL，“2.2.2”項下溶液S5～S8各0.9、1.0、1.1、1.5 mL，溶液S5′～S8′各3 mL，溶液S5″～S8″各500 μL，分別置于不同25 mL量瓶中，先加甲醇補足3 mL后，加5%NaNO2溶液1 mL，搖勻，靜置6 min;再加10% Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻，繼續(xù)靜置6 min;最后加NaOH溶液5 mL，然后用水稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min，即得到各溶液的相應檢測液[16]。另在25 mL量瓶中加3 mL甲醇，按相同方法加入相應試劑并顯色，制備不含總黃酮的空白對照液。

2.2.4 檢測波長的確定 分別取“2.2.3”項下蘆丁對照品檢測液、 S5檢測液、S5′檢測液和S5″檢測液，采用紫外分光光度計在200～700 nm波長范圍內(nèi)進行掃描（先用空白對照液校正基線，下文同）。結(jié)果顯示，各樣品檢測液在波長為322 nm時均有吸收，因此將322 nm確定為本研究的檢測波長。紫外掃描圖見圖4。

2.2.5 線性關(guān)系考察 取“2.2.1”項下系列質(zhì)量濃度的蘆丁對照品溶液，分別置于不同25 mL量瓶中，同“2.2.3”項下方法制備檢測液。采用紫外分光光度計在322 nm波長處檢測，記錄吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度（c）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線并進行回歸計算，回歸方程為A=0.002 8c+0.000 2（R2=0.999 7）。結(jié)果表明，蘆丁質(zhì)量濃度在125～250 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度考察 按“2.2.3”項下方法制備蘆丁對照品檢測液及S5檢測液，采用紫外分光光度計在322 nm波長處測定其吸光度，連續(xù)測定6次。結(jié)果，蘆丁對照品檢測液及S5檢測液吸光度的RSD分別為0.18%、0.33%（n=6），表明該方法精密度較好。

2.2.7 重復性考察 取梔子和淡豆豉（2 ∶ 1）共15.0 g，共6份，按“2.2.2”“2.2.3”項下方法制備檢測液，采用紫外分光光度計在322 nm波長處測定其吸光度并根據(jù)標準曲線計算蘆丁含量。結(jié)果，檢測液中蘆丁含量為1.574? mg/mL，RSD為1.69%（n=6），表明本方法重復性較好。

2.2.8 穩(wěn)定性考察 按“2.2.3”項下方法制備蘆丁對照品檢測液、S5檢測液，分別于室溫下放置0、10、15、30、45、60 min時，采用紫外分光光度計在 322 nm處測定其吸光度。結(jié)果顯示，蘆丁對照品檢測液和S5檢測液在10 min內(nèi)的吸光度較為穩(wěn)定，從10 min后吸光度均開始下降。穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表2。

2.2.9 加樣回收率試驗 稱取梔子和淡豆豉（2 ∶ 1）適量，共9份，分別按已知含量的0.5、1、1.5倍比例加入蘆丁對照品，再按“2.2.2”“2.2.3”項下方法制備S5檢測液，采用紫外分光光度計在 322 nm波長處測定其吸光度并根據(jù)標準曲線計算含量，進而計算加樣回收率。結(jié)果，蘆丁的平均加樣回收率為98.54%，RSD為1.25%（n=9），表明該方法的準確度較好。加樣回收率試驗結(jié)果見表3。

2.2.10 樣品中總黃酮含量的測定 取“2.2.3”項下各樣品檢測液，分別用紫外分光光度計在322 nm波長處測定其吸光度，根據(jù)標準曲線方程計算總黃酮含量。結(jié)果顯示，當梔子與淡豆豉的比例為1 ∶ 1時，梔子豉湯中總黃酮含量最高（1.861 mg/mL）;當梔子與淡豆豉的比例為1 ∶ 4時，淡豆豉單煎液和梔子單煎液中總黃酮含量最高（分別為0.172 、2.291 mg/mL）。當梔子與淡豆豉比例為1 ∶ 1時，梔子豉湯中總黃酮含量與梔子單煎液+淡豆豉單煎液總黃酮含量之和的差值為正數(shù)（0.180）;當兩者比例為1 ∶ 1、1 ∶ 2、1 ∶ 4時，該差值為負數(shù)（分別為-0.023、-0.352、 -0.951）。梔子豉湯、淡豆豉單煎液和梔子單煎液中總黃酮含量測定結(jié)果見圖5。

3 討論

梔子和淡豆豉不同配伍比例（2 ∶ 1、1 ∶ 1、1 ∶ 2、1 ∶ 4）的梔子豉湯中染料木素的含量與對應比例的淡豆豉單煎液中染料木素的含量相比均有所下降，其中配伍比例為1 ∶ 1時下降得最多，說明梔子對淡豆豉中染料木素的煎出存在抑制作用。原因可能有以下兩點：一是梔子中某些成分與淡豆豉中染料木素的化學性質(zhì)相似，因此在煎出時產(chǎn)生了競爭性抑制;二是梔子中某種成分可能與淡豆豉中染料木素產(chǎn)生某種化學變化，使染料木素的煎出量降低。梔子豉湯中總黃酮含量與梔子與淡豆豉單煎液總黃酮含量之和的差值在梔子與淡豆豉比例為2 ∶ 1時最高，且該差值隨著淡豆豉比例的增大而減小。梔子和淡豆豉單煎液中總黃酮含量在梔子和淡豆豉比例為1 ∶ 4時均為4種比例（2 ∶ 1、1 ∶ 1、1 ∶ 2、1 ∶ 4）中最高，但在相應比例梔子豉湯中卻降低了。該現(xiàn)象說明梔子與淡豆豉配伍時，淡豆豉中某些成分對梔子中總黃酮的煎出產(chǎn)生了抑制作用，且該作用隨著淡豆豉用量的增大而增大。從中染料木素和總黃酮的含量測定結(jié)果來看，在梔子與淡豆豉比例為1 ∶ 1時梔子豉湯中染料木素和總黃酮含量在4種配伍比例中均為最高，說明以此比例配伍時，梔子豉湯中染料木素和總黃酮的煎出效果最好。

在預試驗中，筆者在選擇染料木素作為對照品檢測梔子豉湯中總黃酮含量時，以甲醇為空白對照，在紫外 200～400 nm波長范圍內(nèi)全掃描，并得到染料木素的最大吸收波長為261 nm。但在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，當梔子與淡豆豉比例不同時（2 ∶ 1、1 ∶ 1、1 ∶ 2、1 ∶ 4），梔子豉湯的最大吸收波長為（237±2） nm。后續(xù)選擇了用萃取法、柱色譜法提取分離各供試品，但均未出現(xiàn)與染料木素對照品相同的波長。

綜上所述，梔子與淡豆豉不同配伍比例的梔子豉湯中染料木素含量較淡豆豉單煎液均有不同程度的降低，而總黃酮含量均有不同程度的升高。隨著淡豆豉用量的增加，梔子豉湯中染料木素含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且梔子與淡豆豉的配伍對梔子豉湯中總黃酮的煎出產(chǎn)生了先促進、再抑制的作用，其中在1 ∶ 4比例配伍時抑制作用最明顯。當梔子與淡豆豉按1 ∶ 1的比例配伍時，梔子豉湯中黃酮類成分的含量最高。本文結(jié)果可為后續(xù)不同配伍比例的梔子豉湯抗抑郁的藥效學研究以及臨床應用提供一定的參考。

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（收稿日期： 2019-11-08 修回日期：2020-03-27）

（編輯：林 靜）