基于短小芽孢桿菌轉(zhuǎn)錄組的強啟動子鑒定

姚動邦，張康，朱昫飏，吳敬*

1(食品科學與技術(shù)國家重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

短小芽孢桿菌(Brevibacilluschoshinensis)是一種革蘭氏陽性菌，具有胞外蛋白酶活性低、蛋白合成與分泌能力強以及非致病性等優(yōu)點[1]。相較于目前被廣泛用于蛋白表達的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，B.choshinensis不僅具有更低的胞外蛋白酶活性[2]，而且其胞外分泌蛋白質(zhì)量濃度可高達30 g/L[3]，這幾乎是B.subtilis最高胞外蛋白濃度的1.5倍[4]。因此，B.choshinensis被逐漸用于重組表達目的蛋白[5-7]。然而，目前常用于B.choshinensis表達系統(tǒng)的強啟動子僅有P2啟動子[8]，高效強啟動子的缺乏嚴重限制了B.choshinensis表達系統(tǒng)的進一步開發(fā)及應用[1]。

啟動子是一個重要的基因表達調(diào)控元件，選擇高效強啟動子是促進目的基因高效表達的一種有效方法[9]。高效強啟動子可通過對已有啟動子的關(guān)鍵位點(如-35或-10區(qū))進行修飾以及挖掘新啟動子2種方式獲得[10-11]。隨著轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)技術(shù)的發(fā)展，目前可基于基因的mRNA含量來挖掘新強啟動子，且該方法較傳統(tǒng)載體陷阱捕捉的方法具有時間短、勞動成本低等優(yōu)點[12-14]。因此，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘新強啟動子的方法逐漸得到推廣[15]。例如，LIU等[16]基于地衣芽孢桿菌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及基因的RPKM(reads per kilobase of exon model per million mapped reads)值挖掘了一個新強啟動子pBL9。當谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶為報告蛋白時，由啟動子pBL9介導的重組酶活性是啟動子P43介導的重組酶活性的1.23倍[16]。MENG等[17]基于B.subtilis的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及基因的RPKM值挖掘了一個新強啟動子PsodA。當普魯蘭酶為報告蛋白時，由啟動子PsodA介導的重組酶活性是啟動子P43介導的重組酶活性的1.82倍[17]。由此可推，基于B.choshinensis轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析將是獲得B.choshinensis內(nèi)源性新強啟動子的一種有效手段。

在本研究中，首先制備了RNA-Seq樣品并利用RNA-Seq技術(shù)獲得了B.choshinensis的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。然后基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘了B.choshinensis內(nèi)源性新強啟動子。最后通過其他報告蛋白以及3 L罐發(fā)酵進一步考察了篩選到的新內(nèi)源性強啟動子的通用性及有效性。本研究為B.choshinensis表達系統(tǒng)提供了更多的強啟動子，促進了B.choshinensis表達系統(tǒng)的開發(fā)與應用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

菌株B.choshinensisHPD31-SP3、B.choshinensis/pNCMO2-P2-amyS(BCWPS)、B.choshinensis/pNCMO2-P2-SI(BCWPSI)及B.choshinensis/pNCMO2-P2-Cut(BCWPCUT)、重組表達載體pNCMO2-P2-amyS(pNCP2S)、pNCMO2-P2-SI(pNCP2SI)和pNCMO2-P2-Cut(pNCP2Cut)均為作者所在課題組前期保藏，其他菌株及質(zhì)粒均由本研究所構(gòu)建。

1.1.2 實驗試劑

DNA聚合酶，大連寶生生物工程有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、細菌RNA提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；One-step Cloning kit一步克隆試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進口的分析純級。

1.1.3 儀器與設備

PCR儀，美國Bio-Rad公司；搖床培養(yǎng)箱，上海知楚生物科技有限公司；3 L發(fā)酵罐，美國NBS公司；離心機，德國Eppendorf公司；可見分光光度計，北京優(yōu)普通用科技有限公司；NanoDrop2000，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

TM液體培養(yǎng)基、TM固體培養(yǎng)基、SHC電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基、微量金屬離子液均參考鄒亮等[18]的研究報告。3 L 罐發(fā)酵基礎培養(yǎng)基組分包括：15 g/L牛肉浸膏，15 g/L多聚蛋白胨，10 g/L葡萄糖，10 mL/L微量金屬離子液。3 L罐發(fā)酵補料培養(yǎng)基為300 g/L葡萄糖。

1.2 實驗方法

1.2.1 分子操作方法

重組載體pNCPAS、pNCPBS、pNCPCS、pNCPDS、pNCPES、pNCPFS、pNCPGS、pNCPHS、pNCPIS、pNCPJS、pNCPKS、pNCPLS、pNCPMS、pNCPNS、pNCPOS、pNCPPS、pNCPQS、pNCPRS、pNCPSS分別由啟動子PA、PB、PC、PD、PE、PF、PG、PH、PI、PJ、PK、PL、PM、PN、PO、PP、PQ、PR、PS替換重組載體pNCP2S中的P2啟動子獲得。重組載體pNCESI和pNCECut分別由啟動子PE替換重組載體pNCP2SI和pNCP2Cut中的啟動子P2獲得。不同啟動子片段分別用表1中對應的引物，依B.choshinensisHPD31-SP3基因組為模板，通過PCR獲得。載體片段pNCMO2-amyS、pNCMO2-SI和pNCMO2-Cut均是通過表1中的FP/RP為引物，分別依重組表達載體pNCP2S、pNCP2SI和pNCP2Cut為模板，通過PCR獲得。含有不同啟動子的重組表達載體是由對應的啟動子片段與載體片段pNCMO2-amyS或pNCMO2-SI或pNCMO2-Cut通過一步克隆試劑盒進行連接獲得。將含有不同啟動子的重組表達載體通過電轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)到B.choshinensisHPD31-SP3中分別獲得對應的重組菌BCWAS、BCWBS、BCWCS、BCWDS、BCWES、BCWFS、BCWGS、BCWHS、BCWIS、BCWJS、BCWKS、BCWLS、BCWMS、BCWNS、BCWOS、BCWSP、BCWQS、BCWRS、BCWSS、BCWESI和BCWECUT。B.choshinensisHPD31-SP3的電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備及重組質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化方法均參考LI等[19]的研究報告。

表1 本研究中所使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 重組菌培養(yǎng)方法

搖瓶種子液培養(yǎng)、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)及3 L罐發(fā)酵培養(yǎng)方法均參考鄒亮等[18]的研究報告，其中的區(qū)別在于搖瓶發(fā)酵及3 L罐發(fā)酵是在本研究所列的培養(yǎng)基中進行，并且發(fā)酵溫度均為33 ℃。

1.2.3 菌體濃度測定方法

菌體濃度是通過測定發(fā)酵液在600 nm處的光密度值(OD600)獲得，同時為保證數(shù)據(jù)的準確性，需要對發(fā)酵液進行適當?shù)南♂屖?00 nm處的可見分光光度計讀數(shù)為0.2～0.8。

1.2.4 酶活性測定方法

α-淀粉酶、蔗糖異構(gòu)酶及角質(zhì)酶的酶活性測定方法及單位酶活性定義分別參考李祝等[20]、劉軍彤等[21]以及SU等[22]的研究報告。

1.2.5 RNA樣品的提取及檢測、反轉(zhuǎn)錄文庫構(gòu)建及測序

通過RNA提取試劑盒提取發(fā)酵菌體的總RNA。通過1%的瓊脂糖核酸電泳分析RNA樣品的完整度和純度；通過NanoDrop 2000分析RNA樣品的濃度及純度；通過Agilent 2100分析RNA樣品的完整度值(RNA integrity number，RIN)。檢測合格后的RNA樣品在干冰的保護下送往武漢華大醫(yī)學檢驗所有限公司進行后續(xù)的RNA富集純化、反轉(zhuǎn)錄文庫的構(gòu)建及測序。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

測序下機后的Raw Reads通過SOAPnuke軟件和trimmomatic軟件過濾掉包含接頭、低質(zhì)量以及未知堿基含量高的數(shù)據(jù)從而獲得Clean Reads。以B.choshinensisHPD31-SP3基因組(GenBank:CP069127)為參考基因組，通過HISAT軟件將獲得的Clean Reads與參考基因組進行比對分析。通過RSEM軟件計算各基因表達水平，并利用FPKM(fragment per kilobases per millionreads)值對不同基因的表達水平進行標準化處理。任意2個樣品間的Pearson系數(shù)是利用R軟件計算所得。利用GO數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/)和KEGG數(shù)據(jù)庫(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)分別對鑒定到的基因進行GO功能和KEGG功能的分類分析；利用DOOR數(shù)據(jù)庫(http://161.117.81.224/DOOR3/)、BPROM數(shù)據(jù)庫(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=bprom&group=programs & subgroup = gfindb)以及DBTBS數(shù)據(jù)庫(http://dbtbs.hgc.jp/)分別對目的基因的操縱子結(jié)構(gòu)、啟動子的-35和-10區(qū)以及啟動子的σ因子和轉(zhuǎn)錄因子進行預測。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA-Seq樣品的制備

將重組菌BCWPS進行3 L罐發(fā)酵培養(yǎng)，提取處于穩(wěn)定期前期的菌體總RNA作為RNA-Seq測序樣品。另外，為了保證實驗數(shù)據(jù)的科學有效性，將重組菌BCWPS的3 L罐發(fā)酵實驗進行3次生物學重復。如圖1重組菌發(fā)酵曲線所示，在3批生物學重復實驗中，重組菌BCWPS均在發(fā)酵培養(yǎng)48 h時進入穩(wěn)定期。因此，提取發(fā)酵48 h時的菌體總RNA作為RNA-Seq測序樣品。為了方便后續(xù)研究，將由3批生物學重復實驗獲得的樣品分別命名為B_1_T、B_2_T和B_3_T。

空心圖標為OD600，實心圖標為α-淀粉酶活性圖1 重組菌BCWPS的3 L罐發(fā)酵曲線Fig.1 The 3 L fermenter fermentation curve of recombinant strain BCWPS

2.2 RNA樣品的質(zhì)量檢測

質(zhì)量合格的RNA樣品是獲得有效RNA-Seq數(shù)據(jù)的重要保障。濃度、純度及完整度是評判RNA樣品質(zhì)量的3個重要指標。其中評判RNA樣品純度的指標包括OD260/OD280和OD260/OD230，評判RNA樣品完整度的指標主要為RIN。當OD260/OD280值為1.8～2.2，且OD260/OD230值>2.0時則認為RNA樣品具有良好的純度；當RIN越接近10時，RNA樣品的完整度越高。一般情況下，當RIN>8 時即可認為樣品的完整度較好。對于細菌樣品，為保證有足量的RNA(≥1 μg)用于cDNA文庫的構(gòu)建，RNA樣品的質(zhì)量濃度應>150 ng/μL。如表2所示，樣品B_1_T、B_2_T和B_3_T對應RNA樣品的OD260/OD280、OD260/OD230及RIN均達標且質(zhì)量濃度均>1 000 ng/μL，因此均可以用于后續(xù)的cDNA建庫分析。

表2 RNA樣品的質(zhì)量檢測結(jié)果Table 2 Quality test results of RNA samples

2.3 RNA-Seq結(jié)果的統(tǒng)計分析

2.3.1 測序數(shù)據(jù)的準確度分析

由表3中的RNA-Seq數(shù)據(jù)可知，各樣品的Clean Bases均≥3.40 Gb；Clean Reads Q20均>98%；Clean Reads Q30均>91%；Clean Reads Ratio均>97%。由此可知，獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)準確度較高，可用于后續(xù)分析。

表3 RNA-Seq數(shù)據(jù)統(tǒng)計表Table 3 Statistical table of RNA-Seq data

2.3.2 測序數(shù)據(jù)與參考基因組的匹配度分析

由表4中的Clean Reads與B.choshinensisHPD31-SP3基因組(GenBank:CP069127)的比對結(jié)果可知，各樣品的Total Mapping值均>80%，Uniquely Mapping值均>75%。由此可知，獲得的Clean Reads與參考基因組的匹配度良好，可進行后續(xù)分析。

表4 Clean Reads與參考基因組的比對結(jié)果Table 4 Comparison results of Clean Reads and reference genome

2.3.3 測序數(shù)據(jù)在全基因組水平的轉(zhuǎn)錄分析

RNA-Seq數(shù)據(jù)共檢測到5 998個基因，將檢測到的基因分別從GO和KEGG功能分類2個角度做全基因組水平的轉(zhuǎn)錄分析，分析結(jié)果分別如圖2和圖3所示。由圖2可知，RNA-Seq檢測到的基因共分布在34個GO分類條目中，其中基因數(shù)量最多的GO分類條目為催化活性(catalytic activity)，占基因總數(shù)的41.5%。由圖3可知，RNA-Seq檢測到的基因共分布在25個KEGG分類條目中，其中基因數(shù)量最多的KEGG分類條目為全局和總覽圖(global and overview maps)，占基因總數(shù)的13.8%。

圖2 基因GO分類分析Fig.2 GO classification analysis of genes

圖3 基因KEGG分類分析Fig.3 KEGG classification analysis of genes

2.3.4 測序樣品的相關(guān)性分析

在本研究中，樣品B_1_T、B_2_T和B_3_T間的相關(guān)性是通過任意2個樣品間相關(guān)性Person系數(shù)的平方(R2)進行分析。如圖4所示，任意2個樣品間的R2值均>0.95，因此3個樣品間具有很好的相關(guān)性，實驗數(shù)據(jù)可靠，滿足后續(xù)分析的要求。

圖4 樣品相關(guān)性熱圖Fig.4 Samples correlation heat map

2.4 高轉(zhuǎn)錄水平基因的挖掘

目前基于RNA-Seq數(shù)據(jù)挖掘強啟動子的研究所采用的方法均僅根據(jù)FPKM或RPKM值選擇高轉(zhuǎn)錄水平基因[15-17]。然而，僅基于基因FPKM或RPKM值而不考慮基因功能的高表達基因篩選方法，最終獲得的強啟動子通常難以顯著提高報告蛋白表達水平。因此，在本研究中我們采用了一種高轉(zhuǎn)錄水平基因新篩選方法，即在基因篩選過程中同時考慮了基因FPKM 值及基因功能。本研究中采用的高轉(zhuǎn)錄水平基因新方法是基于以下3個原則：(1)根據(jù)GO及KEGG功能分類結(jié)果，篩選每個GO條目和KEGG條目中FPKM值最高的前3個基因組成初級靶基因文庫；(2)按照圖2和圖3中GO和KEGG分類條目的排列順序，去除初級靶基因文庫中重復的基因，獲得二級靶基因文庫；(3)以胞外培養(yǎng)基中含量最豐富的細胞壁蛋白編碼基因(hwp)的FPKM值為基準，去除二級靶基因文庫中FPKM值低于該基準的基因。若某個GO或KEGG分類條目中所有基因的FPKM均低于該基準，則僅保留該條目中FPKM值最大的基因，最終獲得可用于后續(xù)啟動子篩選的終極靶基因文庫?；谏鲜?個篩選原則，最終獲得了包含19個基因的終極靶基因文庫。為了方便后續(xù)研究，將篩選到的基因分別命名為Bsa、Bsb、Bsc、Bsd、Bse、Bsf、Bsg、Bsh、Bsi、Bsj、Bsk、Bsl、Bsm、Bsn、Bso、Bsp、Bsq、Bsr、Bss，對應的FPKM平均值如圖5所示。

圖5 基因的FPKM值Fig.5 FPKM value of genes

2.5 強啟動子的序列分析

基于上述獲得的高轉(zhuǎn)錄水平基因在基因組中的操縱子結(jié)構(gòu)預測結(jié)果，直接選取基因編碼框起始密碼子5′端500 bp內(nèi)的序列為基因的啟動子序列，然后對啟動子的-35、-10區(qū)以及對應的σ因子和轉(zhuǎn)錄因子進行預測。如表5所示，篩選到的19個啟動子中總共預測到了11種σ因子和32種轉(zhuǎn)錄因子。

表5 啟動子序列特點Table 5 Promoter sequence characteristics

2.6 強啟動子的篩選及驗證

2.6.1 搖瓶發(fā)酵篩選

以α-淀粉酶為報告蛋白構(gòu)建含有不同啟動子的B.choshinensis重組菌篩選文庫，以含有P2啟動子的重組菌BCWPS為對照，以發(fā)酵上清液中的α-淀粉酶活性為篩選指標，進行強啟動子篩選文庫的搖瓶發(fā)酵篩選。如圖6所示，不同啟動子介導α-淀粉酶在B.choshinensis中的重組表達水平具有明顯的差異，其中啟動子PE和PF介導的重組菌BCWES和BCWFS的胞外α-淀粉酶活性均高于對照菌BCWPS。重組菌BCWES和BCWFS搖瓶發(fā)酵后胞外α-淀粉酶活性分別為7 880.1和4 375.4 U/mL，分別是對照菌BCWPS胞外α-淀粉酶活性(3 367.9 U/mL)的2.3和1.3倍。

圖6 含有不同啟動子的短小芽孢桿菌重組菌的搖瓶培養(yǎng)Fig.6 Shake-flask culture of B.choshinensis recombinant strains with different promoters

2.6.2 啟動子的轉(zhuǎn)錄活性分析

為了考察啟動子PE、PF和P2的轉(zhuǎn)錄活性，在本研究中分別測定了重組菌BCWES、BCWFS和BCWPS 在搖瓶發(fā)酵24、36和48 h時α-淀粉酶基因的mRNA含量。如圖7所示，啟動子PE、PF和P2具有不同的轉(zhuǎn)錄活性。其中，啟動子PE和PF的轉(zhuǎn)錄活性在重組菌搖瓶發(fā)酵過程中不斷增強，啟動子P2的轉(zhuǎn)錄活性在重組菌搖瓶發(fā)酵過程中卻先降低后增加。另外，在24和36 h時啟動子PE的轉(zhuǎn)錄活性均高于啟動子PF和P2，而啟動子P2在48 h的轉(zhuǎn)錄活性均高于啟動子PE和PF。綜上，啟動子的轉(zhuǎn)錄活性與重組菌胞外α-淀粉酶活性無明顯的線性關(guān)系，這表明除啟動子的轉(zhuǎn)錄活性外，重組菌胞外α-淀粉酶活性還與其他因素有關(guān)，比如基因組中啟動子所對應的目的基因功能及mRNA轉(zhuǎn)錄后修飾。因啟動子PE介導的重組菌BCWES胞外α-淀粉酶活性最高，因此僅選擇啟動子PE進行后續(xù)的研究。

圖7 不同啟動子對mRNA表達量的影響Fig.7 Effects of different promoters on mRNA expression

2.6.3 啟動子PE的通用性分析

為了考察啟動子PE的通用性，在本研究中另外選取蔗糖異構(gòu)酶和角質(zhì)酶作為報告蛋白，分別構(gòu)建由啟動子PE介導的蔗糖異構(gòu)酶和角質(zhì)酶B.choshinensis重組菌BCWESI和BCWECUT。將分別由P2啟動子介導的蔗糖異構(gòu)酶和角質(zhì)酶重組菌BCWPSI和BCWPCUT與重組菌BCWESI和BCWECUT進行搖瓶發(fā)酵48 h后，重組菌BCWPSI和BCWESI胞外上清液中蔗糖異構(gòu)酶活性分別為29.0和65.9 U/mL，重組菌BCWPCUT和BCWECUT胞外上清液中角質(zhì)酶活性分別為21.0和26.5 U/mL。其中，重組菌BCWESI胞外蔗糖異構(gòu)酶活性是重組菌BCWPSI的2.3倍，重組菌BCWECUT胞外角質(zhì)酶活性是重組菌BCWPCUT的1.3倍。由此可知，啟動子PE較P2所體現(xiàn)的正效果不局限于α-淀粉酶，對提高其他報告蛋白在B.choshinensisHPD31-SP3中的重組表達也具有一定的通用性。

2.6.4 重組菌BCWES的3 L罐發(fā)酵驗證

為了進一步驗證啟動子PE的效果，我們將重組菌BCWES進行3 L罐發(fā)酵驗證。如圖8所示，當發(fā)酵72 h時，發(fā)酵液的菌體濃度及胞外上清液中α-淀粉酶活性均達到最大值，分別為23.2和5 626.2 U/mL。而由P2啟動子介導的對照菌BCWPS在3L罐發(fā)酵過程中最高的菌體濃度及胞外α-淀粉酶活性分別為13.4和2 358.1 U/mL(圖1)。重組菌BCWES最高的菌體濃度及胞外α-淀粉酶活性分別是重組菌BCWPS的1.7和2.4倍。因此，與重組菌BCWPS相比，盡管菌體濃度的增加有利于提高重組菌BCWES胞外α-淀粉酶活性，但PE作為一種較P2更高效的強啟動子也是重組菌BCWES具有較高胞外α-淀粉酶活性的一個不可忽視的重要原因。綜上，PE啟動子與廣泛應用于B.choshinensis中的強啟動子P2相比是一種更高效的新內(nèi)源性強啟動子。

圖8 重組菌BCWES的3 L罐發(fā)酵曲線Fig.8 The 3 L fermenter fermentation curve of recombinant strain BCWES

3 結(jié)論

本研究通過RNA-Seq技術(shù)獲得了B.choshinensis的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并基于基因FPKM值及基因功能，挖掘到了新內(nèi)源性強啟動子PE和PF。其中，以α-淀粉酶為報告蛋白，啟動子PE介導的重組菌BCWES經(jīng)搖瓶和3 L罐發(fā)酵后的胞外α-淀粉酶活性分別是P2啟動子介導的對照菌BCWPS胞外α-淀粉酶活性的2.3和2.4倍。另外，以蔗糖異構(gòu)酶和角質(zhì)酶為新的報告蛋白證明了啟動子PE具有一定的通用性。因此，本研究為B.choshinensis表達系統(tǒng)提供了新的強啟動子，有助于進一步擴大B.choshinensis表達系統(tǒng)的應用范圍。