響應面優(yōu)化黃精根莖總皂苷、總黃酮提取方法及其在不同產(chǎn)地黃精成分含量比較中的應用

黃金月，崔芙巖，鄭時嘉，姜佳欣，楊佳穎，王志剛，于純淼，楊波*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.天問山農業(yè)綜合開發(fā)股份有限公司，黑龍江 哈爾濱 150300)

中國藥典中記載的黃精藥材(Polygonatirhizoma)為百合科植物黃精(PolygonatumsibiricumRed.)、滇黃精(PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.)或多花黃精(PolygonatumcyrtonemaHua)的干燥根莖，根據(jù)形狀有“雞頭黃精”“姜形黃精”“卷葉黃精”別稱[1]，富含皂苷、黃酮、多糖等活性成分，具有保肝護腎、降脂降糖、增強免疫力等藥理作用[2]。黃精多產(chǎn)于東北、河北等北方地區(qū)；滇黃精多產(chǎn)于云南、四川、貴州等地；多花黃精多產(chǎn)于湖南、湖北、江蘇、安徽等地[3]。皂苷、黃酮是黃精中較為重要的活性成分，也是衡量各產(chǎn)地黃精的重要指標，但目前尚無對中國藥典3種黃精根莖中總皂苷、總黃酮含量進行比較的報道。

在黃精有效成分的各種提取方法中，加熱回流法的時間長、操作繁瑣[4]；閃式提取法的提取容器受限、破碎后過濾難[5]；微波消解法的成分易分解、條件不好掌握[6]，而超聲輔助提取法的提取率高、時間短、適用范圍廣[7]。在各種提取條件優(yōu)化方法中，正交試驗只能對一個孤立點分析，而響應面法可以對各水平連續(xù)分析[8]。本研究以響應面法優(yōu)化超聲輔助乙醇提取黃精根莖中總皂苷、總黃酮，對3種黃精中總皂苷、總黃酮的含量進行比較，為各產(chǎn)地黃精的質量控制和資源開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

GR150B研磨機：合肥榮事達小家電有限公司；KQ-250B型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；島津UVmini-1240紫外分光光度計：島津企業(yè)管理(中國)有限公司。

1.2 試劑與藥品

分析純香草醛、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、冰乙酸、高氯酸、無水乙醇、95 %乙醇、甲醇購自天津市富宇精細化工有限公司；對照品：人參皂苷Rb1(批號：110704-202028，含量≥98 %)、蘆丁(批號：100080-201811，含量≥98 %)均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.3 藥材

黃精生藥材經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院孫慧峰教授鑒定為黃精、滇黃精及多花黃精，詳見表1。

表1 黃精生藥材來源、產(chǎn)地、品種及批號

2 方法

2.1 黃精總皂苷、總黃酮的含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱定人參皂苷Rb1、蘆丁對照品各2 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，分別用甲醇、60%乙醇定容至刻度線，混勻，配制成0.2 mg/mL的人參皂苷Rb1、蘆丁對照品溶液，置4 ℃冰箱冷藏備用[9-10]。

2.1.2 供試品溶液的制備

黃精根莖，切片，置60 ℃烘箱干燥至恒重，粉碎，過4號篩。稱取黃精粉末3 g，置150 mL錐形瓶中，加80%乙醇20 mL，超聲0.5 h，提取3次，合并濾液，離心，取上清液水浴揮去乙醇至無醇味。用等體積正丁醇萃取3次，減壓揮去正丁醇，用甲醇復溶于10 mL容量瓶中，即總皂苷供試液；用等體積乙酸乙酯萃取3次，減壓揮去乙酸乙酯，用60%乙醇復溶于10 mL容量瓶中，即總黃酮供試液[9-10]。

2.1.3 對照品及供試品溶液顯色

2.1.3.1 人參皂苷Rb1對照品及總皂苷供試品溶液顯色

60 ℃水浴蒸干溶劑，加入新鮮配制的5%香草醛冰醋酸0.2 mL，冰浴下加入高氯酸0.8 mL，混勻，在60 ℃水浴下顯色18 min，轉移至10 mL具塞試管中，冰浴冷卻2 min，加入冰醋酸5 mL，混勻，靜置3 min。以甲醇為空白對照[10-11]。

2.1.3.2 蘆丁對照品及總黃酮供試品溶液顯色

將對照品及供試品溶液各濃縮至1 mL，轉移至25 mL容量瓶中，加入5 %亞硝酸鈉1 mL，混勻，靜置5 min，加入10%硝酸鋁1 mL，混勻，靜置5 min，加入4%氫氧化鈉10 mL，用60%乙醇定容至刻度線處，混勻，靜置13 min。以60%乙醇為空白對照[10-11]。

2.1.4 檢測波長的確定

將顯色的對照品及供試品溶液，用紫外分光光度計在200～700 nm范圍內掃描，測得總皂苷最大吸收波長為540 nm、總黃酮最大吸收波長為505 nm，分別定為總皂苷、總黃酮的檢測波長[10]。

2.1.5 標準曲線的繪制

精密吸取人參皂苷Rb1對照品溶液各0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL置10 mL具塞試管中；蘆丁對照品溶液各0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL置25 mL容量瓶中，按上述方法顯色分別于540 nm、505 nm波長處測定吸光度值，以吸光度值為縱坐標，人參皂苷Rb1、蘆丁濃度為橫坐標，繪制標準曲線[10]，得總皂苷回歸方程：Y=6.433 9X+0.135 6(r=0.999 2)，線性范圍：0.016～0.103 mg/mL；總黃酮回歸方程：Y=9.652 7X-0.000 9(r=0.999 8)，線性范圍：0～0.083 mg/mL。

2.1.6 樣品含量測定

準確稱量黃精粉末3 g，按上述方法制備顯色后分別于540 nm、505 nm測定吸光度值，平行測定3 次，代入各自回歸方程，計算含量后取平均值[10]。

2.2 方法學考察

2.2.1 精密度試驗

取上述對照品溶液，連續(xù)測定6次，測得RSD均<1.610%。

2.2.2 回收率試驗

取已知總皂苷、總黃酮含量的供試液各1 mL，共6份，分別加入對照品溶液1 800 μL、300 μL，按上述方法測定，測得RSD均<2.798%。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗

按上述方法制備供試液，在0、5、10、15、20、25、30 min時測定，測得RSD均<0.310%。

2.2.4 重復性試驗

按上述方法制備供試液，連續(xù)測定5次，測得RSD均<0.200%。

2.3 響應面優(yōu)化試驗

以液料比(A)、提取時間(B)、提取次數(shù)(C)為單因素試驗的3個考察因素，確定提取的適宜范圍為液料比15～25、提取時間1～2 h、提取次數(shù)1～3 次，作為響應面優(yōu)化的基礎。結合Box-Behnken中心組合實驗設計及Design Expert10.0.7軟件，采用以液料比(A)、提取時間(B)、提取次數(shù)(C)為自變量，總皂苷、總黃酮提取率(Y)為因變量的3因素3水平，進行響應面分析，因素與水平設計見表2[12]。

表2 響應面分析因素與水平

3 結果與分析

3.1 響應面優(yōu)化結果

響應面優(yōu)化設計及結果見表3。

表3 響應面優(yōu)化設計與結果

3.2 響應面方差及曲面分析

利用Design Exerpt10.0.7軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得總皂苷二次回歸方程：Y=0.720+0.042A+0.029B+0.150C+0.015AB+0.025AC+0.002 5BC-0.032A2-0.015B2+0.020C2;總黃酮二次回歸方程：Y=0.15+0.005 463A+0.015B+0.053C+0.001AB+0.007 075AC-0.007 35BC-0.015A2-0.006 288B2-0.018C2。顯著性試驗P<0.01，表明該模型具有統(tǒng)計學意義，可用于響應值的預測，響應面曲面分析見圖1～圖6。

由圖1～圖6可知，對黃精總皂苷、總黃酮提取率的影響大小順序為：液料比>提取次數(shù)>提取時間。采用Design Exerpt10.0.7軟件得出的最優(yōu)提取條件為液料比25∶1、提取時間2 h、提取次數(shù)3次，預測總皂苷含量9.611 mg/g、總黃酮含量1.883 mg/g。

圖1 液料比與提取時間對總皂苷提取率的交互影響

圖2 液料比與提取次數(shù)對總皂苷提取率的交互影響

圖3 提取時間與提取次數(shù)對總皂苷提取率的交互影響

圖4 液料比與提取時間對總黃酮提取率的交互影響

圖5 液料比與提取次數(shù)對總黃酮提取率的交互影響

圖6 提取時間與提取次數(shù)對總黃酮提取率的交互影響

3.3 各產(chǎn)地黃精成分含量比較

3種黃精的每個批次均進行3次平行測定，結果見表4。

表4 3種黃精中總皂苷、總黃酮含量

由表4可見，3種黃精中總皂苷、總黃酮含量各有差異，其中黃精中總皂苷含量顯著多于滇黃精及多花黃精，而總黃酮含量差異較小，黃精中總黃酮含量略多于滇黃精及多花黃精。

4 討論

中國藥典中記載的黃精為傳統(tǒng)藥食同源植物，具有極高的藥用價值。此前黃精有效成分研究多集中于多糖的提取工藝及含量測定，而總皂苷、總黃酮也是其重要的活性成分。李麗等[6]優(yōu)化了黃精中總黃酮的提取條件，而對總皂苷未做分析；苑璐等[9]對嶗山種植的黃精中總皂苷提取條件進行了優(yōu)化，而未與其他產(chǎn)地黃精進比較分析；張麗等[10]優(yōu)化了黃精莖稈中總多糖、總皂苷及總黃酮的提取條件，但莖稈并非中國藥典所記載的黃精主要藥用部位。本研究以響應面法精確地優(yōu)化了黃精最重要的藥用部位—根莖中總皂苷、總黃酮的超聲輔助乙醇提取條件，并對中國藥典中3種黃精的總皂苷、總黃酮含量進行了比較分析。黃精(東北)中總皂苷、總黃酮含量多于滇黃精及多花黃精，體現(xiàn)了黃精(東北)藥用價值的優(yōu)越性，本研究方法及結果為各產(chǎn)地黃精的質量控制和資源開發(fā)提供參考。