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    不同產(chǎn)地山茱萸總皂苷及總環(huán)烯醚萜苷的地理變異分析

    2021-10-09 07:03:38安淑靜牛豆王婷韓彬凱王紅菊康杰芳
    中醫(yī)藥學(xué)報 2021年9期
    關(guān)鍵詞:經(jīng)度山茱萸總皂苷

    安淑靜,牛豆,王婷,韓彬凱,王紅菊,康杰芳

    (陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,教育部藥用資源與天然藥物化學(xué)重點實驗室,西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室,陜西 西安 710119)

    山茱萸(CornusofficinalisSieb.et Zucc.)是山茱萸科山茱萸屬植物,又名山萸肉、棗皮、藥棗等,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1],其干燥成熟果肉可入藥,具有補益肝腎、澀精固脫等功效[2]。研究表明山茱萸皂苷類和環(huán)烯醚萜苷類化合物是重要的生物活性成分,具有降血糖、抗氧化、抗炎、抗癌、神經(jīng)保護、肝臟保護和腎臟保護[3-9]等作用。山茱萸主要分布在陜西、河南、浙江、山西、湖北和安徽等地。洑香香等[10]對4個地區(qū)7個山茱萸群體的種子形態(tài)指標變異、種子形態(tài)指標與環(huán)境因子的相關(guān)性、種子形態(tài)地理變異趨勢和群體聚類進行了探討,表明不同群體種子形態(tài)均存在顯著差異;種子寬度與體積呈顯著正相關(guān),且二者與緯度呈顯著負相關(guān);種子寬度和種子體積的地理變異趨勢明顯。焦媛等[11]采用ICP-MS法分析5個產(chǎn)區(qū)22種無機元素的差異性,發(fā)現(xiàn)山茱萸中無機元素的含量與產(chǎn)地存在高度相關(guān)性。其他研究也發(fā)現(xiàn)山茱萸產(chǎn)地與其生物活性成分存在一定相關(guān)性[12-14]。

    以上對于山茱萸有效成分的研究表明了不同產(chǎn)地間含量存在差異,但少有對有效成分含量與不同產(chǎn)地具體環(huán)境因素相關(guān)性研究的報道。尋找影響活性成分含量的具體環(huán)境因子對于優(yōu)良產(chǎn)區(qū)的選擇、品種選育、質(zhì)量控制及規(guī)范化栽培有重要的指導(dǎo)作用。本研究對6個主產(chǎn)區(qū)15個產(chǎn)地的具體環(huán)境因素(緯度、經(jīng)度、海拔、年降雨量、年均氣溫、年日照、無霜期)與山茱萸總皂苷和總環(huán)烯醚萜苷含量進行相關(guān)性和聚類分析,為山茱萸質(zhì)量控制、優(yōu)良產(chǎn)區(qū)篩選和規(guī)范化栽培等提供相關(guān)的理論支撐。

    1 材料與方法

    1.1 儀器

    RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);MD-SpectraMax M5多功能酶標儀(Molecular Devices);LG-04C微型植物粉碎機(瑞安市百信藥機器械廠);XH-B型旋渦混合器(美堰市康健有限公司);XO-200超聲微波反應(yīng)系統(tǒng)(南京先歐儀器制造有限公司);LC-2010A HT型高效液相色譜儀(日本 SHIMADZU)。

    1.2 試藥

    15批山茱萸藥材樣品的地理信息見表1,經(jīng)西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室曹曉燕教授鑒定為山茱萸科山茱萸(CornusofficinalisSieb et.Zucc.)的成熟果肉。取山茱萸樣品,粉碎,過40目篩,備用。

    表1 不同產(chǎn)地山茱萸地理位置特征

    齊墩果酸標準品(sigma公司);馬錢苷(批號:MUST-12052813)、獐牙菜苷(批號:MUST-13031124)、莫諾苷(批號:MUST-13070102)、山茱萸新苷(批號:MUST-12101526)均購于上海源葉生物科技有限公司,純度≥98 %;乙腈(色譜純);冰乙酸(色譜純);其余試劑為分析純。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 總皂苷樣液制備

    稱取樣品1.00 g,70%乙醇提取,料液比為1∶21,超聲功率471 W,微波功率369 W,5 min,抽濾,正丁醇萃取,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去正丁醇,定容至20 mL,備用,每個樣本重復(fù)提取3次。

    1.3.2 總環(huán)烯醚萜苷樣液制備

    稱取樣品1.00 g,80%甲醇提取,料液比為1∶21,超聲功率357 W,微波功率641 W,9 min,抽濾,甲醇補到原始重量,0.22 μm微孔濾膜過濾,備用,每個樣本重復(fù)提取3次。

    1.3.3 總皂苷含量的測定

    總皂苷含量的測定參照CHEN等[15]的方法,略作改動。取齊墩果酸標準品2.00 mg,定容至10 mL。取不同量標準品液制成0.003 6、0.004 8、0.006 0、0.007 2、0.008 4、0.009 6、0.010 8、0.012 0、0.013 2、0.014 4 mg/mL濃度的樣品,水浴,冷卻后加入0.20 mL香草醛-冰醋酸、0.80 mL高氯酸,60℃水浴15 min。冷卻后加入5.00 mL冰醋酸,于550 nm下測吸光度。標準曲線為:A=0.037 6c-0.021 0,R2=0.999 2。吸取山茱萸樣品50 μL,相同的方法測定,取3次結(jié)果平均值為測定結(jié)果。

    1.3.4 總環(huán)烯醚萜苷含量測定

    HPLC色譜條件: Phenomenex luna ODS 色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱溫:35 ℃,波長:240 nm,流速:1.0 mL/min,進樣量:10 μL。流動相:A (冰乙酸),B(乙腈);梯度洗脫:0~15 min,10%~20% B;15~19 min,20%~22% B;19~25 min,22%~25% B;25~35 min,25%~27% B;35~50 min,27%~70% B;50~55 min,70%~10% B。莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷和山茱萸新苷的線性回歸方程見表2。在此條件下,測定各個成分的峰面積,計算各產(chǎn)地山茱萸藥材環(huán)烯醚萜苷的含量,取3次平均值即為測定結(jié)果。

    表2 各成分線性回歸方程

    1.4 統(tǒng)計分析

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同產(chǎn)地山茱萸總皂苷和總環(huán)烯醚萜苷含量分析

    表3顯示了15批山茱萸藥材中總皂苷和環(huán)烯醚萜苷的含量,不同產(chǎn)地之間含量存在顯著差異,其中總皂苷含量以河南西峽最高,其次為陜西佛坪;總環(huán)烯醚萜苷含量以浙江淳安最高,其次為河南西峽;總皂苷含量的變化幅度為13.55~26.65 mg/g,總環(huán)烯醚萜苷含量的變化幅度為23.05~32.68 mg/g。

    表3 不同產(chǎn)地山茱萸總皂苷和總環(huán)烯醚萜苷含量

    對表3進行多重比較分析,結(jié)果顯示15個產(chǎn)地間的山茱萸總皂苷和總環(huán)烯醚萜苷的含量存在顯著差異。河南西峽、陜西佛坪的總皂苷含量最高,分別為26.22 mg/g、25.80 mg/g。安徽石臺在所選的15個產(chǎn)地中含量最低,為13.55 mg/g,其中山西陽城、河南魯山、浙江淳安、陜西丹鳳、湖北???、湖北南漳和湖北鄖縣7個產(chǎn)地之間總皂苷含量無明顯差異,平均含量為17.86 mg/g。15個產(chǎn)地的總環(huán)烯醚萜苷含量多重比較分析表明,浙江淳安和河南西峽兩地的總環(huán)烯醚萜苷含量最高,分別為32.67 mg/g和31.68 mg/g,但和陜西丹鳳、佛坪等地差異不顯著。

    2.2 地理因子相關(guān)性分析

    采用Person對總皂苷和環(huán)烯醚萜苷與產(chǎn)地地理因子進行相關(guān)性分析。表4顯示山茱萸總皂苷含量與產(chǎn)地海拔、緯度和無霜期正相關(guān),其中與海拔呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與經(jīng)度、年降雨量、年日照、年均氣溫負相關(guān),其中與經(jīng)度呈顯著負相關(guān)(P<0.05),表明總皂苷含量隨著海拔的升高而增加,隨著經(jīng)度的增加而減少,出現(xiàn)明顯的東西部地域分化即西高東低的趨勢;山茱萸總環(huán)烯醚萜苷與經(jīng)度、年降雨量、年均氣溫、無霜期正相關(guān),但相關(guān)性不顯著(P>0.05),與海拔、緯度負相關(guān),但相關(guān)性也不顯著(P>0.05),與年日照無相關(guān)性,究其原因可能是由于不同產(chǎn)地對環(huán)境因子響應(yīng)的差異性減弱了其相關(guān)性。圖1顯示總皂苷與經(jīng)度、海拔之間的散點圖,Loess加擬合線,結(jié)果顯示山茱萸總皂苷含量隨產(chǎn)地經(jīng)度的增加逐漸遞減,整體表現(xiàn)出西高東低的變化趨勢,而隨產(chǎn)地海拔的增加逐漸遞增,與其他5個地理因子之間不顯著相關(guān);山茱萸總環(huán)烯醚萜苷含量與地理因子無顯著相關(guān),表明次生代謝產(chǎn)物是植物與環(huán)境長期相互作用的結(jié)果[16],各種生態(tài)因子對植物的次生代謝產(chǎn)物起一種連續(xù)的、動態(tài)的生態(tài)綜合作用,而不是單一的對植物起作用,影響著植物次生代謝產(chǎn)物的生成與動態(tài)變化[17-18]。

    2.3 不同產(chǎn)地山茱萸總皂苷和總環(huán)烯醚萜苷含量的聚類分析

    根據(jù)表4和圖1的結(jié)果,對15個產(chǎn)地山茱萸的總皂苷和總環(huán)烯醚萜苷與海拔、經(jīng)度進行SPSS聚類分析,結(jié)果如圖2所示。15個產(chǎn)地的山茱萸種質(zhì)資源大致可分為四類,第一類有4個產(chǎn)地,分別是:浙江臨安、安徽歙縣、安徽石臺、安徽霍山,其皂苷平均含量為14.58 mg/g,總環(huán)烯醚萜苷平均含量為27.18 mg/g;第二類有5個產(chǎn)地,分別是:河南鞏義、河南魯山、浙江淳安、湖北南漳、湖北??担湓碥掌骄繛?7.28 mg/g,總環(huán)烯醚萜苷含量為30.32 mg/g;第三類有3個產(chǎn)地,分別是:湖北鄖縣、山西陽城、陜西丹鳳,其皂苷平均含量為17.69 mg/g,總環(huán)烯醚萜苷含量為27.57 mg/g;第四類有3個產(chǎn)地,分別是:河南內(nèi)鄉(xiāng)、河南西峽、陜西佛坪,其皂苷平均含量為24.35 mg/g,總環(huán)烯醚萜苷含量為27.13 mg/g。在四類中,前兩類經(jīng)度較大,海拔較高,且親緣關(guān)系和地理位置較近,又可聚為一大類,其皂苷及總環(huán)烯醚萜苷的平均含量為45 mg/g;后兩類經(jīng)度相對較小,海拔較高,且山茱萸中總皂苷及總環(huán)烯醚萜苷的平均含量為53.37 mg/g,其中的陜西丹鳳、河南西峽、陜西佛坪的總皂苷及總環(huán)烯醚萜苷含量均較高,可作為山茱萸種質(zhì)資源的優(yōu)良產(chǎn)地。

    表4 山茱萸總皂苷和總環(huán)烯醚萜苷含量與地理因子的相關(guān)系數(shù)分析

    圖1 山茱萸總皂苷含量與海拔和產(chǎn)地經(jīng)度間的關(guān)系

    圖2 不同產(chǎn)地山茱萸總皂苷、總環(huán)烯醚萜苷的聚類分析圖

    3 討論與結(jié)論

    山茱萸為世界三大名貴木本藥材之一,其藥用和食用價值已具有1 500多年的歷史,控制其質(zhì)量對山茱萸的開發(fā)應(yīng)用意義重大。2015年版《中國藥典》以馬錢苷和莫諾苷含量作為山茱萸質(zhì)量的控制標準[2]。然而,僅以馬錢苷和莫諾苷作為其質(zhì)量的控制標準比較單一,缺乏全面性和系統(tǒng)性,尋找新的質(zhì)量控制標準,有助于山茱萸類產(chǎn)品的深度開發(fā),更好地應(yīng)用于醫(yī)藥和保健行業(yè)。研究表明,山茱萸主要含有環(huán)烯醚萜苷、皂苷、有機酸、酯類、鞣質(zhì)、黃酮和多糖等多種成分[19-21]。皂苷是苷元為三萜或螺旋甾烷類化合物的一類糖苷,陸地高等植物中含量較多,如人參、桔梗等,具有降血糖血脂、保護神經(jīng)元、抗癌和保護腎臟等藥理活性;萬靜枝等[22]發(fā)現(xiàn)竹節(jié)參皂苷通過激活Sirt1蛋白抑制線粒體功能障礙來改善D-半乳糖對神經(jīng)細胞的損傷;張紫薇等[23]從耐藥、抗炎和血管生成等多方面對薯蕷皂苷的抗癌機制進行闡述,為開發(fā)薯蕷皂苷的抗癌藥物提供理論依據(jù)。王娟[24]等和關(guān)悅等[25]發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rg3和苦瓜總皂苷均對糖尿病腎病大鼠有保護作用。鑒于皂苷的藥用價值,考慮亦可將總皂苷含量作為山茱萸質(zhì)量控制的標準之一。環(huán)烯醚萜類化合物具有多種生物活性,其中馬錢苷、莫諾苷和獐牙菜苷是山茱萸中最主要的環(huán)烯醚萜苷成分。許多研究表明[26]山茱萸環(huán)烯醚萜苷中含量較高的馬錢苷與莫諾苷對保護神經(jīng)元、抑制黑素和改善糖尿病有顯著作用。HE等[27-28]發(fā)現(xiàn)山茱萸中的馬錢苷,莫諾苷,熊果酸可以保護胰島β細胞免受高糖誘導(dǎo)的過度氧化應(yīng)激和細胞凋亡;LV、JIANG等[29-30]發(fā)現(xiàn)山茱萸環(huán)烯醚萜苷還可以通過減少NF-κB及其下游合成酶和細胞因子的產(chǎn)生顯著減輕糖尿病器官損傷。因此,山茱萸中總皂苷和總環(huán)烯醚萜苷的含量,可為山茱萸質(zhì)量控制提供重要參考依據(jù)。

    山茱萸是多年生小喬木,喜生長在400~1 200 m海拔之間,主要分布于陜西、河南、浙江、安徽、山西和湖北,產(chǎn)地的不同,意味著海拔、溫度、氣候的差異性。本研究通過對不同產(chǎn)地山茱萸樣品中總皂苷與總環(huán)烯醚萜苷的測量,結(jié)果顯示不同產(chǎn)地間含量差異顯著,表明地理因子對山茱萸總皂苷和總環(huán)烯醚萜苷含量有著重要的影響;有效成分產(chǎn)地地理環(huán)境因子的相關(guān)性發(fā)現(xiàn),總皂苷含量與產(chǎn)地經(jīng)度呈負相關(guān)、與海拔呈正相關(guān),東西地域間存在明顯的分化,即西部低于東部的變異趨勢。郭蘭萍[31]和NCUBE[32]研究表明,植物次生代謝產(chǎn)物受生態(tài)因素直接或間接的影響,如:產(chǎn)地氣候、環(huán)境、土壤等,具有明顯的地域特性;與海拔和地理位置有顯著的相關(guān)性。因此,不同產(chǎn)地的地理因子的差異是造成山茱萸次生代謝物含量不同的主要因素。

    近年來,道地性藥材品質(zhì)的提升是中藥現(xiàn)代化的基石,需要根據(jù)產(chǎn)地地理環(huán)境、自然氣候等自然環(huán)境特點對道地藥材種植進行合理規(guī)劃。因此,對于山茱萸資源發(fā)展和利用來說,探索山茱萸有效成分含量和環(huán)境因子的相關(guān)性將會為山茱萸道地性和有效成分形成的生態(tài)機制提供重要參考。在15個產(chǎn)地中,陜西丹鳳、佛坪和河南西峽的皂苷和環(huán)烯醚萜苷的含量均較高,可作為山茱萸種質(zhì)資源的優(yōu)良產(chǎn)地。

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