基于外周血Th17和Treg細胞探討掃白茴風(fēng)丸治療陽虛血瘀型白癜風(fēng)的作用機制

王遠紅，董曉儀，李慧

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江省中醫(yī)醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150036)

白癜風(fēng)是一種獲得性、多因性色素減退性疾病，是皮膚中黑素細胞被破壞造成的皮膚著色障礙[1]，其特征是在皮膚上出現(xiàn)白色斑塊，并對應(yīng)功能性表皮甚至是毛囊黑素細胞的喪失[2]。白癜風(fēng)病因復(fù)雜，治療手段有限且療效參差不齊，一直是醫(yī)學(xué)界急于攻克的難題。近年來，Th17、Treg細胞及其相關(guān)因子與多種自身免疫性疾病的關(guān)系逐漸引起眾多學(xué)者的注意。Th17作為一種新發(fā)現(xiàn)的獨立細胞亞群已被證實與白癜風(fēng)、特異性皮炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病存在相關(guān)性，多項研究顯示白癜風(fēng)病灶中存在Th17的浸潤[3]。外周血中調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)的減少及其功能失調(diào)會增加對黑色素細胞的損害[4]。Treg和Th17之間具有相互轉(zhuǎn)化性及相互拮抗性，兩者間的動態(tài)平衡在機體自身免疫病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[3]，并可為白癜風(fēng)的防治提供新的理論基礎(chǔ)。因此，本研究旨在通過對入組的白癜風(fēng)患者給予中藥自擬經(jīng)驗方掃白茴風(fēng)丸，觀察給藥前后外周血中免疫指標(biāo)的變化并揭示其潛在的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究所選的病例均來自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科門診，入選時間為2019年1月—2019年12月。根據(jù)國家衛(wèi)生部《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》(1993年)制定研究方案，入組時選取符合標(biāo)準的18～65歲白癜風(fēng)患者120例，其中治療組、對照組各60例；另選正常組30例為黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院健康體檢者。研究過程中脫落4例、剔除3例(治療組3例因家庭原因退出實驗，對照組3例因自行更改藥物剔除，1例主動退出；正常組30例無脫落、剔除)，有效病例共143例。最終57例患者采用口服中藥經(jīng)驗方掃白茴風(fēng)丸納入治療組，其中男性29例，女性28例，年齡19～61歲，平均年齡為(37.74±9.97)歲，平均病程為(4.77±2.63)年；對照組56例給予口服中藥白癜風(fēng)丸，其中男性26例，女性30例，年齡18～55歲，平均年齡為(36.61±10.01)歲，平均病程為(5.32±2.77)年。兩組患者的性別、年齡、病程、臨床分型等一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準

西醫(yī)診斷標(biāo)準及白癜風(fēng)分型、分期參照中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會皮膚性病專業(yè)委員會色素病學(xué)組的《黃褐斑與白癜風(fēng)的診療標(biāo)準》(2010年版)制定[5]；中醫(yī)證候診斷及辨證分型標(biāo)準(陽虛血瘀型)參考國家中醫(yī)藥管理局1994年《中醫(yī)病癥診斷療效標(biāo)準》制定[6]，癥見：皮膚變白，或為斑片或為斑點，或伴驚惕失眠、腰膝酸軟、畏寒肢冷、便溏溲清、肌膚粗糙、倦怠乏力等癥狀；婦女多伴月經(jīng)失調(diào)；脈象多沉細，舌質(zhì)多淡或邊有齒痕，舌邊尖有瘀點瘀斑。

1.3 納入及排除標(biāo)準

納入標(biāo)準：①年齡在18～65歲；②符合上述診斷標(biāo)準；③近1個月內(nèi)無針對性治療；④簽署知情同意書并配合治療者。

排除標(biāo)準：①伴有嚴重原發(fā)性疾病(心血管疾病、免疫缺陷病等)；②處于妊娠、哺乳期婦女；③對治療有關(guān)藥物過敏者；④不能配合檢查、調(diào)查問卷和治療者。

1.4 中止及退出標(biāo)準

①出現(xiàn)病情變化或加重，全身不良反應(yīng)者；②由于各種原因(不配合檢查、療程中斷、外出、中途改藥、失訪等)自行退組者。

1.5 研究方法

1.5.1 分組及治療方法

治療組給予口服中藥經(jīng)驗方掃白茴風(fēng)丸(由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室制備)，主要藥物組成有：熟地黃、炙麻黃、桂枝、荊芥、防風(fēng)、小茴香、百部、刺蒺藜、金銀花、淫羊藿、蓽撥、干姜、當(dāng)歸、生甘草等。服用方法：溫水送服，每次6丸(0.2 g/丸)，2次/日，2個月為一療程，連續(xù)服用4個月。

對照組給予白癜風(fēng)丸(吉林省天光藥業(yè)有限公司，批準文號：Z22020497)，主要成分：山藥、干姜、龍膽草、蒺藜、川芎、當(dāng)歸、香附、桃仁、丹參、烏梢蛇、紫草、白鮮皮、補骨脂、黃芪、紅花。服用方法：白癜風(fēng)丸溫水送服，每次6丸(0.2 g/丸)，2次/日，連續(xù)服用4個月。

1.5.2 皮損測量方法

①利用一張10 cm×10 cm的透明薄膜，設(shè)定單一最小單元1/16 cm2方格以便精確計算皮損的面積，對兩組患者治療四個月前后白斑面積進行測量，并計算組間差異；②數(shù)碼相機照相法。

1.5.3 DLQI評分

根據(jù)白癜風(fēng)對患者生活及心理方面的影響，分別于治療前與治療4個月后進行DLQI調(diào)查。

1.5.4 療效判定標(biāo)準

參照《皮膚科疾病臨床評分表》中白癜風(fēng)面積及其嚴重程度評分(vitiligo area severity index,VASI)；參照中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會皮膚性病專業(yè)委員會色素病學(xué)組的《黃褐斑與白癜風(fēng)的診療標(biāo)準》(2010年)[5]，進行臨床痊愈、顯效、有效、無效的判定。痊愈：白斑全部消退，恢復(fù)正常膚色。顯效：白斑部分消退或縮小，恢復(fù)正常膚色的面積占皮損面積≥50%。有效：白斑部分消退或縮小，恢復(fù)正常膚色的面積占皮損面積≥10%、<50%。無效：白斑無變化或縮小，恢復(fù)正常膚色面積中皮損面積<10%。病情控制：白斑面積不再擴大，無新皮損出現(xiàn)。總有效率=(臨床痊愈例數(shù)+顯效例數(shù)+有效例數(shù))/本組總病例數(shù)×100%，治療4個月后判定療效。

1.5.5 觀察指標(biāo)與實驗室分析：

①標(biāo)本采集：晨起取入組人員靜脈血3 mL，加入EDTA抗凝管中抗凝，待檢。②取抗凝全血100 μL；加入CD4-FITC 20 μL和CD25-PE 20 μL，IgG1-FITC和IgG1-PE作為同型對照；③混勻后室溫避光孵育15 min；加入1 mL細胞固定/破膜液；室溫避光孵育30 min，PBS洗滌兩次；分別加入APC-Foxp3 10 μL、2.5 μL IL-17-PE進行胞內(nèi)染色；④用PBS洗滌液洗滌重懸細胞，并用流式細胞儀檢測。分析其CD25和Foxp3雙陽性細胞的含量，即為Treg細胞占CD4+T細胞的百分比；分析其IL-17A陽性細胞的含量，即為Th17細胞占CD4+T細胞的百分比。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組患者分期、治療前后皮損面積比較

根據(jù)VIDA評分等標(biāo)準判定疾病分期，分期具有可比性(P>0.05)。治療組治療前后皮損面積具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；對照組治療前后皮損面積具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；兩組之間治療后皮損面積比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 兩組陽虛血瘀型白癜風(fēng)患者分期、治療前后皮損面積比較

2.2 中醫(yī)證候積分比較

兩組內(nèi)單項評分均較治療前有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明兩組對單項癥狀均可改善；兩組間相比，治療組在5個癥狀改善方面均優(yōu)于對照組(P<0.05)，具有統(tǒng)計學(xué)意義；治療前治療組和對照組中醫(yī)證候總評分經(jīng)t檢驗，t=0.630，P=0.106(P>0.05)，說明兩組總評分具有可比性；4個月后，治療組和對照組中醫(yī)證候總評分經(jīng)t檢驗，t=-2.493，P<0.05，說明治療組在減小中醫(yī)總評分方面較對照組有效，見表2。

表2 兩組陽虛血瘀型白癜風(fēng)患者中醫(yī)證候評分分)

2.3 兩組DLQI評分比較

DLQI評分可以反映出白癜風(fēng)對患者日常生活的一些不利影響，治療前后比較評分對判斷藥物療效和病情變化有一定幫助。兩組患者治療前評分經(jīng)獨立樣本t檢驗(P>0.05)，兩組數(shù)據(jù)具有可比性；經(jīng)4個月治療后，兩組組內(nèi)比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩組間比較(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明在改善患者日常生活等方面，治療組優(yōu)于對照組，見表3。

表3 兩組陽虛血瘀型白癜風(fēng)患者治療前后DLQI評分比較分)

2.4 3組治療前后外周血Treg、Th17比例比較

3組治療前外周血Treg比例比較(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；治療組治療前、后外周血Treg比例比較，t=-18.357，P<0.01，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；治療前治療組與對照組相比，t=-0.923，P>0.05，兩組數(shù)據(jù)具有可比性；治療后治療組與對照組相比，t=10.449，P<0.01，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見表4。

3組治療前外周血Th17比例比較(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；治療組治療前、后外周血Th17比例比較，t=14.927，P<0.01，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；治療前治療組與對照組相比，t=-1.542，P>0.05，兩組數(shù)據(jù)具有可比性；治療后治療組與對照組相比，t=-3.066，P<0.01，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見表4。

表4 3組外周血Treg、Th17比例比較

2.5 治療前后療效比較

經(jīng)過4個月的治療，兩組患者病情均有不同程度改善，經(jīng)秩和檢驗Z=-3.259，P<0.05，兩組療效有顯著差異，治療組優(yōu)于對照組，見表5。

表5 兩組陽虛血瘀型白癜風(fēng)患者治療后療效對比(例)

2.6 安全性分析

在治療期間共有3例出現(xiàn)不良反應(yīng)，治療組有2例患者在服藥后出現(xiàn)胃部不適的情況，對病因排查后確定與第一次服用中藥有關(guān)，囑其餐后服藥，不良反應(yīng)緩解。對照組有1例患者出現(xiàn)頭暈，對病因排查后確認與過度運動有關(guān)，休息后不良反應(yīng)緩解。

3 討論

白癜風(fēng)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一直是個未攻克的難題，目前西醫(yī)的診斷治療雖已形成比較系統(tǒng)的體系，但是治療效果局限，復(fù)色率較低。西醫(yī)對白癜風(fēng)的病因病機主要圍繞自身免疫、黑素細胞自毀、神經(jīng)精神因素、遺傳因素等學(xué)說[1]。中醫(yī)也在不斷針對白癜風(fēng)的病因病機進行探索，認為白癜風(fēng)的發(fā)病機理多為肝郁氣滯、肝腎不足、瘀血阻絡(luò)[8]。筆者根據(jù)多年臨床經(jīng)驗結(jié)合地域因素，提出白癜風(fēng)患者發(fā)病的主要原因多為陽虛血瘀，“汗孔郁閉、毒邪內(nèi)蘊、脈絡(luò)瘀阻”是基本病機。古代醫(yī)籍《素問·皮部論》中記載，大多白色癥狀的病變與“寒”密切相關(guān)，白癜風(fēng)患者的典型皮損為白色或乳白色斑塊或斑點，說明此病癥與“寒”有一定的關(guān)聯(lián)性[7]，而陽虛體質(zhì)易感寒濕之邪。因地理因素的影響，北方屬寒濕之地，故北方患者多為陽虛寒濕之型；南方雖夏季炎熱，但冬季仍濕冷，陽虛寒濕之型亦多見。陽虛寒濕之體易外感風(fēng)邪，致使衛(wèi)陽被遏，腠理閉塞，搏于肌膚。寒邪侵襲人體又易致氣血凝滯，絡(luò)脈瘀阻，陽氣不達，故白癜風(fēng)患者易成陽虛血瘀之證[8]。筆者常用祛風(fēng)托毒、補腎溫陽、活血化瘀的方法進行治療，在院內(nèi)制劑“茴風(fēng)丸”的基礎(chǔ)上結(jié)合經(jīng)方加味而成自擬經(jīng)驗方“掃白茴風(fēng)丸”，在臨床實踐中療效頗著。

掃白茴風(fēng)丸以中醫(yī)基礎(chǔ)理論為指導(dǎo)，結(jié)合白癜風(fēng)病因病機，具有補腎助陽，養(yǎng)血祛風(fēng)的功效。方中麻黃、桂枝共為君藥，起到發(fā)汗解表、調(diào)和營衛(wèi)、疏散風(fēng)邪的作用，二者在臨床上常作為藥對出現(xiàn)[9]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載麻黃治療風(fēng)寒感冒、水腫及風(fēng)疹瘙癢等病，現(xiàn)代藥理研究其具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗腫瘤等作用[10]。桂枝味甘、辛，治以散寒、通陽、溫經(jīng)、發(fā)汗。桂枝中的揮發(fā)油等成分長于體外殺菌、抑菌、抗病毒、抗炎及免疫調(diào)節(jié)[11]。荊芥、防風(fēng)在皮膚病的治療中屬于常用藥對，二者配伍可治療風(fēng)疹瘙癢、瘡瘍初起的表證。荊芥提取物可以降低血清IgE、TNF-α、IL-6水平，荊防藥對同時使用可以增強抗過敏、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗菌的作用[12]，在臨床上防風(fēng)、荊芥配伍的方藥經(jīng)常治療各種損容性疾病，對痤瘡、斑禿、白癜風(fēng)、雀斑等皮膚病均有良好的療效。淫羊藿入腎肝兩經(jīng)，為方中臣藥，具有補腎陽、益精氣、強筋骨、祛風(fēng)邪的功效，對陽虛體質(zhì)的白癜風(fēng)患者，可以發(fā)揮補腎壯陽的作用。淫羊藿中的活性成分黃酮、生物堿、多糖、木質(zhì)素等可以起到抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗氧化等作用[13]。白癜風(fēng)致病原因中最關(guān)鍵的一點則是風(fēng)邪侵體，刺蒺藜有平肝陽、祛風(fēng)邪的功效，在臨床上治療白癜風(fēng)、瘙癢癥等皮膚病療效顯著。金銀花在本方中為避免溫陽太過，疏散風(fēng)熱；金銀花中的活性成分黃酮、揮發(fā)油、三萜皂類化合物、無機元素、有機化合物等可以起到抗炎、解熱、止血、抗病毒、保肝、抗菌等作用[14]。百部入肺經(jīng)，具有潤肺祛風(fēng)、殺蟲止癢的功效。古文載“肺主皮毛”，治療皮膚病可以通過肺氣的宣發(fā)肅降，從而驅(qū)散外邪，使皮膚腠理致密[15]。干姜、小茴香、蓽撥味辛，性熱，皆入腎經(jīng)，三藥配伍功擅溫陽發(fā)汗、補益脾腎。干姜具有抗炎、鎮(zhèn)痛、體外抑菌的基礎(chǔ)藥理作用[16]。小茴香中的化學(xué)成分可以抗炎、抑菌、保肝利膽[17]，部分白癜風(fēng)患者長期服用西藥，適當(dāng)口服中藥可以保護肝臟，緩解副作用的刺激。掃白茴風(fēng)丸中熟地黃與當(dāng)歸配伍可增強補益精血的功效，既達到補血的效果，又可使血脈通暢。熟地黃不僅可以改善人體的免疫功能而且還具有抗衰老、抗氧化、抗腫瘤的作用[18]。當(dāng)歸味甘、辛，性溫。陽虛血瘀型白癜風(fēng)患者多由氣血瘀滯所致，加當(dāng)歸一味可入血分，補血活血，使補中有行，故有祛瘀活血之功。當(dāng)歸中的多糖、有機酸、揮發(fā)油可以增強人體免疫，改善血液循環(huán)[19]。甘草在中藥處方中廣泛應(yīng)用，具有和中緩急、解毒、調(diào)和諸藥的功效，防止藥物產(chǎn)生的毒副作用損傷機體，臨床常做使藥使用。掃白茴風(fēng)丸中運用甘草調(diào)和諸藥，護胃安中，緩解其他藥物藥性峻烈傷及正氣，且甘草在調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗腫瘤、解毒方面效果顯著[20]。

隨著病因?qū)W研究的深入，國內(nèi)外許多學(xué)者已針對白癜風(fēng)患者體內(nèi)T淋巴細胞及其亞群進行分析。研究發(fā)現(xiàn)Th17、Treg細胞與白癜風(fēng)發(fā)病密切相關(guān)，白癜風(fēng)患者一般會伴有Th17、Treg細胞表達異常[3]。本次實驗結(jié)果充分驗證了這一點，并為掃白茴風(fēng)丸治療白癜風(fēng)提供了免疫學(xué)依據(jù)。本研究雖對白癜風(fēng)的病因病機和中醫(yī)治療方面提出了一些觀點，但限于條件和觀察時間較短，未能進行深入的研究與探索。今后應(yīng)加大樣本量進行觀察，并且對患者進行長期的隨訪，進一步針對其作用機制深入研究。