丁酸梭菌CB1制劑對肉雞生產(chǎn)性能、腸道形態(tài)和菌群的影響

何 菊，李筱雯，崔衛(wèi)濤，郭 杰，王 純，肖運才，李自力，周祖濤

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院/湖北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，武漢 430070；2.湖北華大瑞爾科技有限公司/生物發(fā)酵飼料湖北省工程研究中心，武漢 430070）

歐盟委員會在2013年批準(zhǔn)丁酸梭菌可作為蛋雞飼料添加劑，中國也于2013年正式將丁酸梭菌納入新飼料添加劑中［1］。研究報道，在種雞和肉雞飼糧中添加丁酸梭菌能有效提高日增重、平均體重、產(chǎn)蛋率和飼料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)腸道發(fā)育和腸道形態(tài)的完整，提高腸道有益菌數(shù)量，抑制有害菌，可有效預(yù)防腸炎的發(fā)生［2，3］。作為飼料添加劑，丁酸梭菌既可單獨使用也可和其他益生菌復(fù)合使用，目前丁酸梭菌單獨使用在抗病促生長方面尚難達(dá)到與抗生素相同的效果，而與芽孢桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌等菌種復(fù)合及與低聚糖、中草藥、維生素和酶制劑等添加劑聯(lián)合應(yīng)用顯示出優(yōu)異的成績［4，5］，因此復(fù)合型益生菌添加劑的研究顯得非常必要。為此，本試驗將丁酸梭菌CB1單菌制劑及其與枯草芽孢桿菌復(fù)合菌制劑添加于肉雞日糧中，評價丁酸梭菌CB1制劑對肉雞生產(chǎn)性能、腸道形態(tài)和菌群的影響，確定丁酸梭菌CB1制劑的益生效果，為肉雞日糧中抗生素替代提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品及試驗動物

丁酸梭菌CB1制劑（有效活菌數(shù)2×109CFU/g）和復(fù)合菌制劑（丁酸梭菌CB1有效活菌數(shù)2×109CFU/g，枯草芽孢桿菌TL有效活菌數(shù)2×1010CFU/g），由湖北華大瑞爾科技有限公司提供。金霉素（含量為15%）購自金河生物科技股份有限公司。試驗肉雞品種為Cobb500，購自湖北荊州正康家禽有限公司。

1.2 試驗動物與試驗設(shè)計

選取1日齡Cobb 500肉雞15 000只，隨機(jī)分為5組：A組（基礎(chǔ)日糧）、B組（基礎(chǔ)日糧+50 g/t金霉素）、C1組（基礎(chǔ)日糧+100 g/t丁酸梭菌CB1制劑）、C2組（基礎(chǔ)日糧+200 g/t丁酸梭菌CB1制劑）、D組（基礎(chǔ)日糧+200 g/t復(fù)合菌制劑），每組3個重復(fù)，每個重復(fù)1 000只?；A(chǔ)日糧為玉米豆粕型日糧，參照NRC（1994）營養(yǎng)需要配制，試驗周期為42 d。飼喂試驗在湖北當(dāng)陽正陽家禽養(yǎng)殖專業(yè)合作社開展，同一棟雞舍，網(wǎng)上平養(yǎng)，免疫按常規(guī)程序進(jìn)行。

1.3 生產(chǎn)性能測定方法

生產(chǎn)性能指標(biāo)包括平均日增重、料肉比和死亡率。試驗期間每天記錄采食量和雞群數(shù)量，分別在1、7、14、21、28、35、42 d時，每個重復(fù)隨機(jī)抽取100只雞進(jìn)行稱重，稱重在早晨喂料前進(jìn)行，計算1～21、22～42、1～42 d的平均日增重和死淘率，全程料肉比和死亡率。

1.4 相關(guān)指標(biāo)檢測方法

分別在21 d和42 d，每個重復(fù)隨機(jī)抽取10只雞，稱取每只采樣雞活體重量并記錄，頸部靜脈放血處死，剖開腹腔采集各項檢測指標(biāo)所需樣品。

1.4.1 腸道形態(tài)檢測 用細(xì)線結(jié)扎盲腸和回腸中上段一端，取長度約2 cm的腸段，于4%甲醛溶液中固定，經(jīng)洗滌、脫水、透明、透蠟、包埋、修蠟、切片等處理步驟，進(jìn)行常規(guī)HE染色。使用日本Nikon 80i生物光學(xué)顯微鏡并結(jié)合NIS-Elements高清晰度彩色圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行測量、觀察和取圖，每張切片觀察選出2～3個典型視野，測定10根完整絨毛的絨毛高度（VH）和隱窩深度（CD），計算絨毛高度與隱窩深度的比值（VH/CD）。

1.4.2 腸道菌群q RT-PCR檢測目的基因 結(jié)扎固定位置和固定長度的回腸、盲腸，置于50 mL滅菌離心管中保存，于無菌超凈臺中稱取腸道內(nèi)容物。為減少個體差異所帶來的試驗偏差，將每組采集的糞便樣品混合。以乳酸桿菌、雙歧桿菌、梭菌、大腸桿菌和沙門氏菌屬特異性基因為靶基因構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。PCR擴(kuò)增引物及退火溫度見表1。

采用3步法定量檢測腸道菌群數(shù)量的q PCR，其中，大腸桿菌和沙門氏菌反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性30 s；40個循環(huán)，95℃變性5 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s。乳酸桿菌和梭菌反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性30 s；40個循環(huán)，95℃變性5 s，56℃退火20 s，72℃延伸30 s。雙歧桿菌反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性30 s；40個循環(huán)，95℃變性5 s，58℃退火20 s，72℃延伸30 s。反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex Taq II 10μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.4μL，模板2μL，加去離子水補(bǔ)足至20μL。每次RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，通過用熔解曲線（65～95℃）來檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的單一性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，利用ANOVA、LSD進(jìn)行差異顯著性檢驗和Duncan多重比較，試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁酸梭菌CB1制劑對肉雞生產(chǎn)性能的影響

2.1.1 平均日增重 丁酸梭菌CB1及其復(fù)合菌制劑對肉雞平均日增重的影響結(jié)果見表2。由表2可知，在1～21 d，C2和D組平均日增重均極顯著高于A組（P<0.01），D組平均日增重最高（37.74 g/d）；與B組相比，C1、C2和D組平均日增重分別提高了4.76%、6.54%、14.33%。在22～42 d，B組平均日增重極顯著高于A、C1、C2和D組（P<0.01）。在1～42 d，與A組相比，B、C1、C2和D組的平均日增重分別提高了5.46%、0.37%、1.52%和4.10%，D組與B組平均日增重基本持平。上述結(jié)果顯示，丁酸梭菌CB1制劑及其復(fù)合菌制劑對肉雞1～21 d促生長效果優(yōu)于抗生素組，22～42 d促生長效果低于抗生素組，從全程比較，復(fù)合菌制劑促生長效果與抗生素相當(dāng)。

表2 丁酸梭菌CB1制劑對肉雞平均日增重的影響（單位：g/d）

2.1.2 料肉比與死亡率 由圖1可知，C2、D組料肉比與死亡率均優(yōu)于A組和B組，說明在肉雞日糧中添加丁酸梭菌CB1及其復(fù)合菌制劑可以提高飼料轉(zhuǎn)化率和肉雞存活率。

2.2 丁酸梭菌CB1制劑對肉雞腸道形態(tài)的影響

丁酸梭菌CB1及其復(fù)合菌制劑對肉雞腸道形態(tài)的影響結(jié)果見表3和表4。由表3、表4可知，21 d時，B、C1、C2和D組回腸VH/CD值比A組分別提高了1.0%、1.51%、7.79%和32.41%。B、C1、C2和D組盲腸VH/CD值比A組分別提高了11.54%、50.00%、65.38%和95.51%。?D組回腸、盲腸VH/CD值均極顯著高于C1、C2組。

42 d時，B、C1、C2和D組回腸VH/CD值比A組分別提高了18.34%、19.48%、22.92%和47.56%，D組VH/CD值與B、C1、C2組相比差異極顯著（P<0.01）。B、C1、C2和D組盲腸VH/CD值比A組分別提高了31.49%、54.70%、80.11%和95.58%，D組VH/CD值最高。上述結(jié)果表明，日糧中添加丁酸梭菌CB1及其復(fù)合菌制劑可提高肉雞回腸、盲腸絨毛高度，降低隱窩深度和顯著提高絨毛高度與隱窩深度比值，有效改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2.3 丁酸梭菌CB1制劑對肉雞腸道菌群的影響

丁酸梭菌CB1制劑及其復(fù)合菌制劑對腸道菌群的影響結(jié)果見表5和表6。由表5、表6可知，在21 d時，回腸中乳酸桿菌數(shù)量C1、C2和D組極顯著高于A組和B組（P<0.01），B組乳酸桿菌數(shù)量最低；雙歧桿菌數(shù)量C1、C2和D組極顯著高于B組（P<0.01）；大腸桿菌數(shù)量各處理組均低于A組。盲腸中乳酸桿菌數(shù)量C2、D組極顯著高于A組和B組（P<0.01）；雙歧桿菌數(shù)量C1、C2和D組極顯著高于A組和B組（P<0.01），與B組相比，分別提高了8.25%、10.77和9.34%；大腸桿菌數(shù)量各處理組均低于A組；沙門氏菌數(shù)量C2和D組顯著低于A組（P<0.05）。添加丁酸梭菌CB1制劑提高了C1、C2和D組回腸、盲腸中梭菌數(shù)量。

在42 d時，C1、C2和D組回腸乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量極顯著高于B組（P<0.01）；大腸桿菌數(shù)量B、C1、C2和D組均極顯著低于A組（P<0.01）。盲腸中乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量C1、C2和D均極顯著高于A組和B組（P<0.01），雙歧桿菌數(shù)量B組最少；沙門氏菌數(shù)量C1、C2和D組顯著低于B組（P<0.05）。上述結(jié)果顯示，在肉雞日糧中添加丁酸梭菌CB1及其復(fù)合菌制劑提高了回腸、盲腸乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量，降低了沙門氏菌的數(shù)量，高劑量組和復(fù)合菌組尤其顯著。

3 小結(jié)與討論

3.1 丁酸梭菌CB1制劑對肉雞生產(chǎn)性能的影響

丁酸梭菌能夠促進(jìn)機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高肉雞生產(chǎn)性能。杜云平等［11］研究表明，日糧中添加丁酸梭菌可明顯改善肉雞日增重、飼料轉(zhuǎn)化率和經(jīng)濟(jì)效益，日增重比對照組提高了4.61%，飼料轉(zhuǎn)化率提高9.26%，只均利潤提高0.97元。趙旭［12］研究報道，日糧中添加丁酸梭菌顯著提升了肉雞的平均日采食量和日增重（P<0.05）。丁酸梭菌還具有降低脂肪沉積的功能，其主要的代謝產(chǎn)物丁酸發(fā)揮重要作用，丁酸梭菌也改變了肉雞腸道中的菌群結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)肉雞的脂肪合成。

表5 丁酸梭菌CB1制劑對21 d肉雞腸道菌群數(shù)量的影響 ［單位：log（copies/g）］

表6 丁酸梭菌CB1對42 d肉雞腸道菌群數(shù)量的影響 ［單位：log（copies/g）］

本研究中，肉雞日糧中添加丁酸梭菌CB1及其復(fù)合菌制劑能夠改善肉雞生產(chǎn)性能，有效降低料肉比和死亡率。在1～21 d，丁酸梭菌CB1制劑添加組C1、C2和D組的平均體重顯著高于抗生素組（P<0.05或P<0.01），但22～42 d的平均體重極顯著低于抗生素組（P<0.01）。其原因可能是在生長前期，肉雞腸道菌群不完善，外源添加丁酸梭菌CB1及其復(fù)合菌制劑迅速促進(jìn)了腸道菌群的建立及維持穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)機(jī)體的生長，其作用優(yōu)于抗生素。在21 d后，腸道菌群變化逐漸趨于穩(wěn)定，丁酸梭菌CB1制劑對菌群豐度的影響作用趨低，而抗生素調(diào)整菌群豐度作用趨高，其作用優(yōu)于丁酸梭菌CB1制劑。龔琪等［13］研究發(fā)現(xiàn)，雛雞盲腸菌群從7～14日齡為一個過渡期，從14～42日齡為相對穩(wěn)定期，益生菌或抗生素的添加可以促進(jìn)腸道菌群在過渡期更有效地完成過渡，在穩(wěn)定期維持更穩(wěn)定的狀態(tài)。經(jīng)試驗全期分析，在肉雞日糧中添加丁酸梭菌CB1與枯草芽孢桿菌TL復(fù)合菌制劑（200 g/t），其促生長效果與金霉素組相當(dāng)，能替代抗生素類藥物，起到抗病促生長的作用。

3.2 丁酸梭菌CB1制劑對肉雞腸道形態(tài)的影響

腸道是營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的主要部位，腸道功能與腸絨毛高度（VH）和隱窩深度（CD）密切相關(guān)。VH/CD比值升高，說明腸道形態(tài)功能得以增強(qiáng)，消化吸收功能提高。劉來亭等［14］報道，添加0.6%、0.9%酪酸芽孢桿菌可顯著提高肉雞小腸絨毛高度（P<0.05）。日糧中添加不同劑量的丁酸梭菌，與對照組相比，顯著提高了肉雞14、21和42 d回腸絨毛高度，降低了隱窩深度（P<0.05）；肉仔雞飼喂益生菌飼料添加劑后，小腸黏膜皺襞增多，絨毛高度增高，小腸吸收面積增大［15］。本研究中，添加丁酸梭菌CB1制劑后能有效促進(jìn)腸道形態(tài)的生長發(fā)育，顯著提高21、42 d肉雞盲腸和回腸VH/CD值，丁酸梭菌CB1復(fù)合菌制劑對腸道形態(tài)的改善優(yōu)于抗生素。

3.3 丁酸梭菌CB1制劑對肉雞腸道菌群的影響

動物腸道內(nèi)復(fù)雜的微生物菌群對營養(yǎng)吸收和健康起著重要作用。丁酸梭菌為厭氧芽孢桿菌，能產(chǎn)生丁酸、乙酸和丙酸，促進(jìn)雙歧桿菌、乳酸桿菌等腸道有益菌群增殖，抑制大腸桿菌、傷寒沙門氏菌等致病菌和腐敗菌的生長，促進(jìn)腸道微生物菌群平衡，降低有害物質(zhì)的產(chǎn)生。丁酸梭菌能夠促進(jìn)有益微生物的生長而減少有害菌的增殖，具有調(diào)控腸道內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)平衡、優(yōu)化宿主腸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境的功能［16，17］。

本研究中，日糧中添加丁酸梭菌CB1制劑對肉雞腸道回腸和盲腸雙歧桿菌、乳酸桿菌的增殖有顯著的促進(jìn)作用。在21和42 d，丁酸梭菌CB1制劑添加組C1、C2和D組回腸和盲腸乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量極顯著增加（P<0.01），高于A組和抗生素B組，大腸桿菌、沙門氏菌數(shù)量有降低的趨勢。在試驗中，隨著日齡的增加，腸道內(nèi)容物中有益菌逐漸增加，有害菌不斷減少，說明丁酸梭菌CB1制劑在促進(jìn)有益菌繁殖和維持腸道菌群平衡方面具有優(yōu)勢。