基于類黃酮成分的不同品種無花果采收時機及抑癌活性研究

李 曉，鄧佳麗，安玉艷，林澤崑，汪良駒,2*

1南京農業(yè)大學園藝學院，南京 210095；2青島海德坤生物科學研究院，青島 266200

無花果(FicuscaricaL.)屬于?？崎艑贉貛淙~果樹，原產于幼發(fā)拉底河和底格里斯河流域，是人類馴化最早的栽培果樹之一，距今已有1萬年以上種植歷史[1]。類黃酮類化合物被證實是一種潛在的天然抗氧化劑，具有抑菌、抗腫瘤等作用[2,3]。無花果的根、莖、葉、果均可入藥。20世紀50年代Ullman提出，外用無花果乳汁處理動物腸道，能引起大量的毛細血損傷，嚴重時導致動物死亡；但若經口服，則沒有任何毒性[4]。從無花果乳汁中分離出4種活性組分，其中2種組分經皮下注射或者靜脈注射，能抑制小鼠移植性肉瘤生長。后續(xù)證實，無花果乳汁液能顯著抑制小鼠原發(fā)性乳腺癌細胞生長，導致癌細胞壞死，延緩移植性腺癌、骨髓性白血病、淋巴肉瘤和肉瘤發(fā)生，并引起肉瘤退化[5]。在中國，Wang等[6]首先報道無花果根、莖、葉和果實(包括幼果和成熟果)提取液對S180肉瘤、肺癌、肝癌和艾氏腹水癌均具有明顯的抑制活性。他們將無花果水提液供給荷瘤小鼠或癌癥病患，均能提高試驗對象的免疫功能，因而建議，無花果制劑可以作為一種天然、無毒的輔助性藥物，以緩解化療、放療患者病痛，提高生活質量。然而，無花果抗癌有效成分卻一直未闡明。Takeuchi等[7]最早提出，苯甲醛是無花果抗癌的主要成分。Yin等[8]認為，無花果抗癌是包括香豆素類化合物、苯甲醛和呋喃環(huán)類小分子芳環(huán)化合物共同作用的結果，苯甲醛只是增效劑或有機活性分子之一。后來發(fā)現(xiàn)，無花果多糖具有抗癌活性[9]。但是，多糖物質結構復雜，其與抗腫瘤的關系需要更多探討。另一方面，類黃酮與抗癌的關系引起大家重視。Sharada等[10]提出，無花果中含有的一種類黃酮物質桑色素(morin)可以抑制1，2-二甲基肼(DMH)誘發(fā)的大鼠結腸癌發(fā)生。有關這一研究缺乏后續(xù)報道。介于無花果品種眾多，不同時期成熟的果實葉片可能具有不同功能。為此，本研究于2019年7月至11月間，采集3個無花果品種葉片，分別提取并精制類黃酮，研究不 同月份品種葉片對人體癌細胞增殖的抑制活性，探討無花果類黃酮的抑癌機理，分析類黃酮物質與抗癌活性的關系，以期為無花果類黃酮在抗癌醫(yī)藥上的應用開發(fā)提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用的無花果(FicuscaricaL.)共有三個品種，即‘布蘭瑞克’(Brunswick)、‘瑪斯義陶芬’(Masui Dauphine)和‘波姬紅’(Bojihong)。其中，前兩品種葉片采摘于常州市圣王果蔬有限公司無花果園，‘波姬紅’葉片采自南京市浦口區(qū)翔辰家庭農場無花果園。從2019年7月至11月份，每個月份采集一次新梢中部成熟葉片。洗凈后，在110 ℃烘箱中殺青10 min，在80 ℃條件下烘干，磨碎后過60目篩以備類黃酮提取之用。人肝癌HepG-2細胞購于中國科學院上海生命科學研究院細胞庫，胃癌BGC-823和SGC-7901細胞由中國藥科大學倪孟祥教授饋贈。

1.2 試驗試劑與儀器

1.2.1 試劑

DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)、RPMI(Roswell Park Memorial Institute)培養(yǎng)基、PBS(Phosphate Buffer Solution)、0.25%胰蛋白酶為Hyclone公司產品；胎牛血清(Fatal Bovine Serum，F(xiàn)BS)來自Gibco公司。細胞培養(yǎng)級別二甲亞砜(DMSO)、MTT細胞增殖抑制試劑盒(MTT Cell Proliferation Assay Kit)、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit)、細胞周期DNA含量檢測試劑盒(DNA Content Quantitation Assay-Cell Cycle)、線粒體電位檢測試劑盒(JC-1)(Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1)全部來自北京索萊寶生物科技有限公司，130種酚類標準品由上海鹿明生物科技有限公司提供。

1.2.2 儀器

冷凍干燥機；超聲波清洗機；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Electron Corporation，MA，USA)；倒置顯微鏡；流式細胞儀(BD Accuri C6 Ⅱ)；多功能酶標儀(Cytation 3)；高速冷凍離心機；三重四極桿質譜儀(AB Qtrap 6500+)；高效液相色譜儀(AB ExionLC)。

1.3 試驗方法

1.3.1 類黃酮提取與精制

取不同品種不同月份的無花果葉片粉末各50 g，按照1∶49物液比加入80%乙醇溶液，在70 ℃條件下以420 W功率超聲波提取40 min，減壓真空抽濾，重復以上操作兩次，合并濾液。在真空旋轉蒸發(fā)儀中旋轉蒸發(fā)，用冷凍干燥機凍干，得粗黃酮。隨后，采用D101型大孔樹脂進行靜態(tài)吸附精制。具體方法為：稱取8 g已活化處理的D101型大孔樹脂，以60%乙醇溶液按照1∶40物液比溶解1 g上述粗黃酮。在25 ℃恒溫搖床中以150 rpm轉速浸搖吸附12 h，再用去離子水沖洗吸附后的樹脂，去除洗滌水。然后，加入70%乙醇溶液20 mL，再于25 ℃恒溫搖床中以150 rpm轉速浸搖解析12 h，減壓抽濾，旋轉蒸發(fā)，最后冷凍干燥得到精制類黃酮。

1.3.2 細胞培養(yǎng)

人體肝癌HepG-2細胞培養(yǎng)在含有80%DMEM和20%胎牛血清培養(yǎng)基上，胃癌BGC-823和SGC-7901細胞培養(yǎng)在含有90%RPMI和10%胎牛血清培養(yǎng)基上，置于37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱。

1.3.3 細胞增殖抑制試驗

1.3.3.1 無花果品種和月份類黃酮樣品抑癌效應

利用MTT法檢測無花果葉片類黃酮對胃癌細胞SGC-7901增殖的抑制效應，比較不同品種和月份葉片的抑癌效率。在對數(shù)生長期，將細胞濃度調整為1×105/mL。取100 μL加入到96孔板中，吹打成單細胞，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h至貼壁。棄除上清，加入含有1 mg/mL無花果葉片類黃酮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。棄除培養(yǎng)基，加入90 μL新鮮培養(yǎng)基和10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，再培養(yǎng)4 h。然后棄除孔內溶液，加入110 μL二甲亞砜(DMSO)，水平晃動10 min，使晶體充分溶解，在酶標儀490 nm處測定吸光度。抑制癌率=(1 - OD樣品/ OD空白)×100%。該試驗重復10次以上，取平均值。

1.3.3.2 無花果葉片類黃酮對不同癌細胞株系的抑制效率

以人體肝癌HepG-2細胞、胃癌BGC-823和SGC-7901細胞為材料，利用MTT法檢測類黃酮對不同癌細胞系增殖抑制效率，比較不同癌細胞增殖對無花果類黃酮的敏感性。具體方法同“1.3.3.1”。

1.3.3.3 細胞形態(tài)觀察

介于‘布蘭瑞克’無花果8月份葉片類黃酮對SGC-7901細胞增殖的抑制率最高(見結果與分析)，本研究用該體系來探討無花果類黃酮抑癌機理。在細胞形態(tài)觀察中，將SGC-7901細胞均勻鋪在兩組6孔板中，用不同濃度類黃酮處理，培養(yǎng)48 h后選擇一組加入MTT染色后，分別在倒置光學顯微鏡下觀察兩組SGC-7901細胞形態(tài)變化。

1.3.3.4 細胞凋亡測定

在SGC-7901細胞對數(shù)生長期，將細胞濃度調整為1×105/mL，取2 mL加入6孔板中，吹打均勻，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h至貼壁。棄除上清液，加入含有不同濃度類黃酮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細胞后，用預冷的PBS洗滌，2 000 rpm離心5 min，棄上清。用1 mL Binding Buffer (1×)懸浮細胞，2 000 rpm離心10 min，棄上清。用Binding Buffer重懸細胞，使細胞密度達到1×106個/mL。吸取100 μL重懸細胞，加入5 μL AnnexinV-FITC溶液，暗孵育10 min。加入5 μL碘化丙啶(PI)，暗孵育5 min，按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書，在流式細胞儀上檢測細胞凋亡情況。

1.3.3.5 線粒體膜電位測定

參照“1.3.3.4”法收集經不同濃度類黃酮處理的SGC-7901細胞，去除上清，用PBS洗滌2次，再加入1 mL細胞培養(yǎng)液和1 mL JC-1工作液，充分混勻后，在細胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。4 ℃下600 g離心5 min，去除上清液。用JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次，再加入適量JC-1染色緩沖液(1×)重懸細胞，按照線粒體電位檢測試劑盒(JC-1)說明書，在流式細胞儀上分析無花果葉片類黃酮對SGC-7901細胞線粒體膜電位的影響。

1.3.3.6 細胞周期分析

參照“1.3.3.4”法收集經不同濃度類黃酮處理的SGC-7901細胞。經PBS沖洗兩次，用70%預冷乙醇固定過夜；再用PBS洗滌2次，加入500 μL含RNase的碘化丙啶(PI)染色液，在4 ℃下避光孵育30 min，按照細胞周期DNA含量檢測試劑盒說明書，在流式細胞儀上檢測激發(fā)波長為488 nm紅色熒光下細胞周期情況。

1.3.3.7 細胞凋亡相關基因表達

參照“1.3.3.4”法收集經不同濃度類黃酮處理的SGC-7901細胞，利用RNA simple Total RNA Kit 試劑盒提取RNA，利用微量分光光度計測定RNA濃度，經瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA18S和26S條帶完整性。使用cDNA反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。以此為模板，用qRT-PCR測定p53、Bax、Bcl-2以及與周期相關基因表達量，以GAPDH為內參。引物序列如表1。

表1 用于RT-qPCR分析的引物序列Table 1 Oligonucleotide sequences for primers used in RT-qPCR

1.3.4 液相色譜串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)法測定黃酮類物質含量

以三種抑癌效率不同的無花果葉片類黃酮為材料，采用UPLC-ESI-MS/MS開展定性定量檢測，借以探索與抑癌率相關的無花果黃酮種類。色譜條件：Waters UPLC HSS T3(100 mm× 2.1 mm，1.8 μm)液相色譜柱，流動相A(0.1%甲酸-水溶液)，流動相B(乙腈)，梯度洗脫，流速為0.3 mL/min，進樣量5 μL。分析前，先將130種黃酮類標準品分別用甲醇溶解，制備1 mg/mL母液。梯度稀釋后，制作標準曲線并優(yōu)化質譜條件。無花果葉片樣品分析時，用精制后黃酮。根據出峰時間、峰面積和標準曲線，定性定量分析黃酮類代謝物絕對含量。每個樣品生物學重復3次。

1.4 數(shù)據處理

所有數(shù)據均為重復3次以上試驗的平均值。經單因素或雙因素方差分析和Duncan氏顯著性測驗。當P< 0.05時，認為差異顯著；當P< 0.01時，認為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 無花果葉片類黃酮對癌細胞增殖的抑制效應

表2為添加1 000 μg/mL無花果類黃酮對人體胃癌SGC-7901細胞增殖抑制率。從中可以看出，除了‘布蘭瑞克’8月份葉片的抑癌率達39.24%外，其他月份以及其他兩個品種‘瑪斯義陶芬’和‘波姬紅’葉片類黃酮的抑癌率均相當?shù)?，甚至為負值，表明并非所有品種月份無花果葉片類黃酮都有抑癌活性。

表2 不同品種月份無花果葉片類黃酮對人體胃癌SGC-7901細胞增殖抑制效率Table 2 The inhibitory efficiency of flavonoids of fig leaves of different cultivars harvested indifferent months on the proliferation of human gastric cancer SGC-7901 cells

介于8月份采集的‘布蘭瑞克’無花果葉片類黃酮對人體胃癌SGC-7901細胞具有明顯的抑癌活性，我們以此為材料，利用MTT法測定了它對三種癌細胞系，包括肝癌細胞Hepg-2、胃癌細胞SGC-7901和BGC-823增殖抑制的濃度效應，結果如圖1。從中可以看出，在100～1 600 μg/mL濃度范圍內，無花果類黃酮對3種癌細胞的抑制率均隨著濃度增加而迅速上升。當濃度為1 600 μg/mL時，無花果葉片類黃酮對肝癌Hepg-2細胞抑制率為21.93%，對胃癌SGC-7901細胞抑制率為86.65%，對胃癌BGC-823細胞抑制率為26.31%。顯然，無花果葉類黃酮對胃癌SGC-7901細胞抑制率最高，而對其他兩種癌細胞的抑制率均低于30%。

圖1 8月份采集的‘布蘭瑞克’無花果葉片類黃酮對不同癌細胞增殖的抑制效應Fig.1 The inhibitory effect of flavonoids from ‘Brunswick’ fig leaves harvested in August on the proliferation of different lines of cancer cells注：圖中相同小寫字母代表在P = 0.05水平上差異不顯著。Note:The same lowercases in a figure indicate no significant difference at P = 0.05 level.

圖2顯示的是倒置顯微鏡中觀察到的8月份采集的布蘭瑞克無花果葉片類黃酮對人體胃癌SGC-7901細胞增殖的抑制情況。從中可以看出，無論是否經MTT染色，癌細胞數(shù)量均隨無花果類黃酮濃度增加而迅速下降，細胞松散，逐漸萎縮死亡。MTT染色可以提高這一效應的可視性，因為MTT可以被活細胞線粒體脫氫酶還原生成深紫色結晶體，顏色越深，表明活細胞數(shù)量越多。從圖2可以看出，隨著無花果葉類黃酮濃度的提高，SGC-7901細胞顏色逐漸變淺，細胞數(shù)量迅速下降。當類黃酮濃度達1 600 μg/mL時，幾乎見不到能被染色的活細胞。表明，無花果葉片類黃酮處理對胃癌SGC-7901細胞增殖有顯著抑制效應。

2.2 無花果葉片類黃酮誘導SGC-7901細胞凋亡效應

圖3為不同濃度無花果葉片類黃酮處理誘發(fā)人體胃病SGC-7901細胞凋亡的流式細胞儀檢測結果。其中，A圖由6個小圖組成，每一個小圖有4個象限。Q1為裸核細胞，Q2為凋亡晚期細胞或已經壞死的細胞，Q3為處于凋亡早期的可逆性細胞，Q4為活細胞。B圖是多次重復測試后獲得的不同類型細胞百分率。從中可以看出，正常培養(yǎng)條件下，92.83%為活細胞。隨著無花果類黃酮濃度增加，活細胞數(shù)量直線下降。其回歸方程y= -0.045 7x+ 76.381，相關系數(shù)r= -0.910 1*。由此計算出無花果類黃酮對SGC-7901細胞的半致死濃度IC50為577.26 μg/mL。另一方面，正常培養(yǎng)條件下凋亡早期和凋亡晚期的細胞很少，兩者總共只有5.26%。當無花果葉類黃酮濃度為100 μg/mL時，凋亡細胞總數(shù)升為13.26%。當無花果葉類黃酮濃度達到1 600 μg/mL時，凋亡細胞總數(shù)升為83.6%，其中凋亡早期細胞為24.1%，凋亡晚期細胞為59.5%。以上結果再次證明，無花果葉片類黃酮以劑量依賴方式促進人體胃癌SGC-7901細胞凋亡。

圖3 不同濃度無花果類黃酮處理對人體胃癌SGC-7901細胞凋亡的影響Fig.3 Effects of fig flavonoids in different concentrations on apoptosis of human gastric cancer SGC-7901注：A：流式細胞儀照片；B：不同凋亡時期細胞百分數(shù)。圖中相同字母代表在P = 0.05水平上差異不顯著。Note:A:Photos of flow cytometry.B:Percentage of apoptotic cells at different stages.The same letters in the figure represent no significant difference at P = 0.05 level.

2.3 無花果葉片類黃酮對SGC-7901細胞線粒體膜電位的影響

JC-1是一種特殊的熒光染料。它在細胞線粒體外能產生紅色熒光。當線粒體膜電位下降時，它可以進入線粒體，熒光則由紅色轉變?yōu)榫G色。因而，JC-1可以作為分子探針，特異性地檢測線粒體膜電位變化。如圖4，未經類黃酮處理的人體胃癌SGC-7901細胞紅色熒光強度為97.9%，100 μg/mL類黃酮處理對此沒有明顯影響。當類黃酮濃度達200 μg/mL時，紅色熒光顯著下降(P< 0.05)。以后，隨著類黃酮濃度上升，紅色熒光強度迅速下降。當類黃酮濃度為1 600 μg/mL時，紅色熒光降低到3.9%。與此相反的是，綠色熒光強度隨著類黃酮濃度上升而上升。當類黃酮濃度為1 600 μg/mL時，綠色熒光上升至96.07%。紅色熒光與綠色熒光的比值從對照的47.68%到下降到0.04%。這些結果表明，200 μg/mL以上濃度的無花果葉片類黃酮處理顯著降低SGC-7901細胞線粒體膜電位。

圖4 不同濃度的無花果類黃酮處理對人體胃癌SGC-7901細胞線粒體膜電位的影響Fig.4 Effects of fig leaf flavonoids at different concentrations on mitochondrial membrane potential of human gastric cells SGC-7901注：A：流式細胞儀JC-1檢測結果；B：紅綠熒光比值。Note:A:Images from flow cytometer.B:Red and green fluorescence and their ratio which present mitochondrial membrane potential.

2.4 無花果葉片類黃酮對SGC-7901細胞周期的影響

圖5展示的是無花果葉類黃酮對人體胃癌SGC-7901細胞周期的影響。其中，G1為DNA復制前期，主要合成與DNA復制有關的RNA、結構蛋白以及酶蛋白等；S為DNA復制期，它不僅復制DNA，導致DNA加倍，而且合成與DNA組裝構成染色質等有關的組蛋白；G2為DNA復制后期，主要負責染色體濃縮以及形成有絲分裂所需的成分。從圖5B可以看出，G1期細胞比例隨著無花果葉片類黃酮濃度增加逐漸下降。當濃度為400 μg/mL時，G1細胞僅為對照的52.56%，差異達到極顯著水平。與此同時，S期細胞比例極顯著增加，處理組比對照高出47.98%。類似地，G2期細胞比例也明顯增加。當類黃酮濃度達1 600 μg/mL時，處理組G2細胞比例比對照高出77.58%。以上結果說明，無花果葉類黃酮對SGC-7901細胞G1期沒有阻滯效應，但顯著抑制DNA復制，導致S期細胞比例顯著增加。同時，G2期細胞比例也有顯著提高。由于細胞周期受阻于S期和G2期，細胞增殖停滯，同時逐漸凋亡。

圖5 不同濃度無花果葉片類黃酮對人體胃癌SGC-7901細胞周期的影響Fig.5 Effects of fig leaf flavonoids in different concentrations on the cell cycle of human gastric cancer SGC-7901注：A：流式細胞儀檢測出的細胞周期圖；B：細胞周期不同階段細胞所占比百分數(shù)。圖中相同字母代表在P = 0.05水平上差異不顯著。 Note:A:Images of cell cycles by flow cytometer;B:Cell percentage at different stages of cell cycles.The same letters in the figure represent no significant difference at P = 0.05 level.

2.5 無花果葉片類黃酮對SGC-7901細胞凋亡相關基因表達的影響

為了在mRNA水平上闡明無花果葉類黃酮抑制SGC-7901細胞增殖機理，本試驗采用qRT-PCR技術檢測了細胞凋亡相關基因的相對表達量，如圖6A。促凋亡基因Bax在SGC-7901細胞內的相對表達量隨無花果葉類黃酮濃度的升高而上升。當類黃酮濃度達到400 μg/mL后，Bax相對表達量與對照間達到顯著差異(P< 0.05)。類似地，抑癌基因p53表達也表現(xiàn)出上調趨勢，但類黃酮濃度低于400 μg/mL時，其差異未達到P= 0.05的顯著水平；當類黃酮濃度達800 μg/mL時，p53相對表達量比對照高出1.89倍(P< 0.05)；1 600 μg/mL時，高出4.24倍，說明一定濃度無花果葉類黃酮處理顯著上調p53表達。與此相反，抑凋基因Bcl-2相對表達量隨著類黃酮濃度的升高而下降。這種效應在無花果葉類黃酮濃度為100 μg/mL時就顯著存在(P< 0.05)；當濃度為1 600 μg/mL時，Bcl-2相對表達量僅為對照的16%，說明無花果葉類黃酮處理顯著抑制抑凋基因Bcl-2表達。

圖6 不同濃度無花果葉類黃酮處理對SGC-7901細胞基因表達的影響Fig.6 Effect of fig leaf flavonoids in different concentrations on the gene expressions of SGC-7901 cells注：A：細胞凋亡相關基因；B：細胞周期相關基因。同一基因相同字母代表在P = 0.05水平上差異不顯著。Note:A:Apoptosis-related genes;B:Cell cycle-related genes.The same letters in a gene represent no significant difference at P = 0.05 level.

CDK1、CDK2和CDK6為細胞周期蛋白依賴激酶(Cyclin-dependent kinase，CDKs)編碼基因。從圖6B可以看出，隨類黃酮濃度升高，CDK1、CDK2和CDK6相對表達量均呈下降趨勢。就CDK1、CDK6而言，類黃酮濃度低于400 μg/mL時，效果不顯著(P> 0.05)；當類黃酮濃度上升為800 μg/mL時，CDK1和CDK6的相對表達量僅為對照的30%左右，達到P= 0.05顯著水平。CDK2相對表達量對類黃酮濃度更敏感。當類黃酮濃度為200 μg/mL時，相對表達量降至對照的82.62%(P< 0.05)。此后，隨著類黃酮濃度升高，表達量進一步下降。當類黃酮濃度為1 600 μg/mL時，處理僅為對照的11.34%。Cyclin D1為細胞周期蛋白(Cyclins)編碼基因。與CDKs類似，Cyclin D1的表達量隨無花果葉類黃酮處理濃度的升高而呈降低。當類黃酮濃度上升為800 μg/mL時，差異達到P= 0.05顯著水平；當濃度為1 600 μg/mL時，處理僅為對照的8.94%。另一方面，從圖6B可知，無花果葉類黃酮促進E2F1基因表達。這種效應在類黃酮濃度為1 600 μg/mL時顯著存在(P< 0.05)，相對表達量約為對照的2倍。以上結果說明，無花果葉類黃酮顯著降低SGC-7901細胞周期相關基因CDKs和Cyclin D1表達，同時促進E2F1表達。

2.6 液相色譜串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)定性定量測定黃酮類物質種類與含量

為了探討無花果葉片類黃酮抑制SGC-7901細胞增殖效應的活性成分，根據表2結果，我們選取抑癌率不同的3組類黃酮，即‘布蘭瑞克’8月、‘瑪斯義陶芬’9月和‘波姬紅’9月，利用LC-MS/MS技術定性定量測定類黃酮成分和含量，其中圖7展示的是130種標準品的總離子流圖。從中可以看出，每個標樣出峰清晰，3次進樣的出峰時間重疊，說明檢測條件良好且穩(wěn)定。另外，每個樣品的標準曲線相關系數(shù)均在0.998以上(數(shù)據未列出)，可以用于定量檢測。

圖7 標品總離子流圖Fig.7 Total ion flow diagram of standards

3組樣品各3次重復共檢測出60種類黃酮物質(資料未列出)，其總量分別為714.75、636.45和505.69 μg/mL。它們與抑癌率呈正相關關系，但相關系數(shù)未達到P= 0.05顯著水平。以單個物質含量與抑癌率做相關分析，共有11種含量與抑癌率的相關關系達到P= 0.05顯著水平(表3)。其中，2.6-二羥基苯甲酸、香草乙酮為苯丙類，芥子酸、單咖啡酰酒石酸為苯丙素類，其余均為黃酮類物質。無花果葉片中特有的桑色素(morin)含量與抗癌率相關系數(shù)的P= 0.08，雖然未達到但很接近0.05顯著水平，所以也列入表中。從表3可得，水仙苷含量與無花果類黃酮抑癌率相關系數(shù)達0.999 9以上(P< 0.01)；2.6-二羥基苯甲酸、紫云英苷、香草乙酮、氯化矢車菊素-3-O-蕓香糖苷、表兒茶素、異葒草苷、煙花苷、芥子酸、單咖啡酰酒石酸和金絲桃苷含量與無花果類黃酮抑癌率均呈顯著相關關系(P< 0.05)。這些結果為后續(xù)抗癌活性物質鑒定提供了依據。

表3 三種無花果葉差異代謝物含量及與抑癌率相關性Table 3 Correlation between different metabolite content and anti-cancer efficiency of three kinds of fig leaves

3 討論

類黃酮是兩個苯環(huán)通過三個碳原子相互連接而成的一系列化合物的總稱，具有C6-C3-C6結構，難溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有機溶劑。因此，無花果醇類提取液，甚至無花果酒中都含有一定量的類黃酮，并且具有抑癌活性[11]。在抗腫瘤方面，Bai等[12]利用無花果乙醇提取物腹腔注射荷S180實體瘤小鼠，發(fā)現(xiàn)對肉瘤生長有明顯的抑制作用，并增加臟器指數(shù)，增強T淋巴細胞百分數(shù)，暗示著無花果乙醇提物可能通過增強荷瘤小鼠免疫功能起到抗腫瘤效果。這是無花果類黃酮抑制動物腫瘤的最早報道。本試驗中，我們觀察到無花果葉片類黃酮對人體胃癌細胞SGC-7901細胞增殖有顯著抑制活性，但是，對胃癌BGC-823和肝癌Hepg-2細胞增殖效應卻相對較低(見圖1)。從不同品種月份采集的葉片提取出的類黃酮抑癌效應上看，‘布蘭瑞克’8月份葉片對SGC-7901細胞抑制率最高，其他品種以及月份葉片類黃酮的抑制率均比較低(見表2)。似乎只有特定品種和特定月份的無花果葉片類黃酮對特定腫瘤細胞增殖才有顯著效應。有人提出，蟬花蟲草醇提液對癌細胞增殖的抑制率也是SGC-7901最高[13]。本試驗結果與此相似。隨著無花果葉片類黃酮濃度增加，胃癌SGC-7901細胞數(shù)目減少，變短皺縮，逐漸脫離細胞板，其抑制作用呈劑量效應(見圖2)。這為無花果葉片的采收時機確定及類黃酮抑癌功效開發(fā)提供了理論依據。

我們首次利用流式細胞儀觀察無花果葉片類黃酮誘導細胞凋亡(見圖3)。在類黃酮濃度為200 μg/mL時，細胞總凋亡率為39.08%；當濃度達1 600 μg/mL時，總凋亡率達83.60%。據此計算出無花果類黃酮對SGC-7901細胞半致死濃度為577.25 μg/mL。這與Purnamasari等[14]提出的無花果甲醇提取液對肝癌細胞Huh7it半抑制濃度為653 μg/mL相似。他們發(fā)現(xiàn)，無花果葉片甲醇提取液能抑制肝癌細胞增殖，促進凋亡，導致細胞壞死。細胞凋亡涉及一系列基因的激活、表達和調控，主要包括內源性線粒體途徑和外源性死亡受體調節(jié)途徑[15]。細胞線粒體膜電位下降是線粒體依賴性凋亡早期的一個標志性事件[16]。García-Zepeda等[17]證明，白藜蘆醇誘導宮頸癌細胞系的線粒體膜電位降低，促進癌細胞凋亡。本試驗觀察到，無花果類黃酮降低人體胃癌SGC-7901細胞線粒體膜電位水平(見圖4)。這表明無花果葉片類黃酮通過誘導SGC-7901細胞線粒體膜電位水平降低，促進細胞凋亡。

我們還觀察了無花果葉片類黃酮對癌細胞周期的抑制效應，發(fā)現(xiàn)它將SGC-7901細胞有絲分裂主要阻滯在S期，也有部分在G2期(見圖5)。曾報道，辣椒素能將子宮內膜癌細胞阻滯于S期，并引起凋亡率升高[18]。據研究，辣椒素抑癌機理在于抑制細胞周期依賴性蛋白激酶CDK2、CDK4、CDK6蛋白表達[19]。人工合成的黃酮類氨基酸衍生物也能使MGC-803胃癌細胞周期受阻于G2/M期，同時下調抗凋亡蛋白Bcl-2表達，上調促凋亡蛋白Bax表達，從而引發(fā)細胞凋亡[20]。本試驗在mRNA水平上分析無花果類黃酮抑制SGC-7901細胞凋亡機理。我們發(fā)現(xiàn)，經無花果葉類黃酮處理的SGC-7901細胞CDK1、CDK2、CDK6和Cyclin D1基因表達顯著下降，E2F1表達升高(見圖6B)。在多種腫瘤組織中，CDKs都處于異?；罨癄顟B(tài)[21]，抑制CDKs表達便能抑制腫瘤無序增殖。此外，無花果葉類黃酮處理還影響到抑癌基因P53和Bax以及促癌基因Bcl-2的表達(見圖6A)。這三個基因中，Bax與Bcl-2屬于同一基因家族，其中，Bcl-2促進細胞周期，而Bax與Bcl-2形成蛋白二聚體，拮抗后者活性，抑制細胞周期，引起細胞凋亡[22]。據報道，天山雪蓮類黃酮可導致人食管癌細胞CaEs-17 Bax表達量上調，Bcl-2表達量下調，從而誘導細胞凋亡[23]。我們觀察到的無花果葉類黃酮促進抑癌基因P53和Bax表達，抑制促癌基因Bcl-2表達。這說明，無花果葉類黃酮對胃癌細胞SGC-7901的凋亡誘導作用可能是通過調節(jié)凋亡相關基因Bax、P53和Bcl-2的表達來實現(xiàn)的。

為挖掘無花果葉類黃酮抑制胃癌SGC-7901細胞增殖效應的具體活性成分，根據不同品種不同月份無花果葉片類黃酮對人體胃癌SGC-7901細胞增殖抑制效率不同，我們選取三個(‘布蘭瑞克’8月、‘瑪斯義陶芬’9月、‘波姬紅’9月)樣品進行LC-MS/MS定性定量分析。經篩選，獲得12種與抑癌率高度相關的差異代謝物(見表3)。其中，水仙苷與無花果類黃酮抑癌率呈極顯著正相關。曾報道，水仙苷具有抗病毒活性，還對阿爾茨海默癥、Ⅱ型糖尿病、帕金森癥等蛋白構象病的防治具有重要意義[24]。最近有人提出，水仙苷可以用于防治新冠病毒[25]。但是，它是否具有抑癌效應還有待研究。表3結果還表明，異葒草苷與無花果類黃酮抑癌率呈顯著相關關系。有人報道，異葒草苷能夠顯著抑制膠質瘤組織miR-23a表達，從而抑制癌細胞增殖[26]。因而，無花果葉片異葒草苷與抗腫瘤的關系值得深入研究。第三，桑色素能夠抑制腫瘤細胞生長[10]，且發(fā)生在細胞周期的S期[27]。但也有人認為，阻滯發(fā)生在G2/M期[28]。本研究也檢測出桑色素的存在，而且其含量與抗癌率的相關系數(shù)r= 0.9923，P= 0.08。雖然未達到0.05水平，但非常接近。而且，我們觀察到無花果葉片類黃酮抑制SGC-7901細胞周期效應在S期。這與前人[27]結果類似。由于無花果屬于?？崎艑?，這種黃酮物質是否與無花果抗癌活性有關，值得深入研究。此外，我們還觀察到2.6-二羥基苯甲酸、香草乙酮、氯化矢車菊素-3-O-蕓香糖苷、煙花苷、表兒茶素、芥子酸等含量與無花果類黃酮抑癌率呈顯著相關關系(表3)。曾報道，兒茶素對人體肝癌有抑制效應[29]。但是，本試驗中，我們觀察到無花果葉片類黃酮對肝癌HepG-2的抑制效應比較低(見圖1)，因而推測，它對SGC-7901的抑制效應可能與表兒茶素無關。其他幾種代謝物與抑癌效應的關系目前很少見報道。

綜上所述，本文首先分析了‘布蘭瑞克’、‘瑪斯義陶芬’和‘波姬紅’等3個品種葉片在7月到11月份間的類黃酮對不同癌細胞株增殖的抑制效率，發(fā)現(xiàn)‘布蘭瑞克’無花果品種8月份葉片類黃酮對SGC-7901胃癌的抑制率最高。隨著類黃酮濃度上升，癌細胞密度和粘附性下降，活細胞減少，死亡細胞和凋亡晚期細胞比例上升。抑癌機理研究表明，無花果葉類黃酮將細胞周期阻滯在S期以及少量的G2期，細胞線粒體膜電位明顯下降，促細胞凋亡基因Bax和p53、細胞周期調控基因E1F2表達量顯著上升，抗凋亡基因Bcl-2以及細胞周期相關基因Cyclin D1和CDKs表達量顯著下降。這些都是無花果葉類黃酮促進癌細胞凋亡的重要機制。此外，借助于LC-MS/MS技術和相關分析，我們篩選得到水仙苷、異葒草苷、桑色素等幾種與抑癌率高度相關的差異代謝物。這為后續(xù)無花果葉片抗癌藥物開發(fā)開辟了新視野。