牛角瓜莖的化學成分及其細胞毒活性研究

于 淼，戴好富，黃圣卓，冉紅玲，蓋翠娟，蔡彩虹，梅文莉，王 昊

中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所 海南省黎藥資源天然產物研究與利用重點實驗室;海南熱帶農業(yè)資源研究院，?？?571101

牛角瓜(Calotropisgigantea(L.)Dry.ex Ait.f.)又名斷腸草、五狗臥花心，為蘿藦科(Asclepiadaceae)牛角瓜屬(Calotropis)植物，主要分布在中國南部、印度、越南、斯里蘭卡和緬甸等地，在我國云南、海南、廣東和四川等地均有分布，生長于低海拔向陽山坡、曠野地及海邊[1]。牛角瓜具有祛痰平喘功效、抗菌、抗氧化、消炎和解毒等作用[2]。牛角瓜花具有鎮(zhèn)痛作用[3]；莖干具有保肝作用[4]；葉具有抗腹瀉作用[5]；乳汁具有促進傷口愈合及抗菌的功效[6,7]?，F代研究表明牛角瓜中含有多種化學成分，包括強心苷類、甾體類、三萜類及黃酮類等成分[8-11]。由于其顯著的抗腫瘤活性，諸多學者已對牛角瓜化學成分進行分離純化和結構鑒定。為了更好的研究牛角瓜化學物質基礎，進一步完善該植物的生物活性內容，本課題對牛角瓜莖的化學成分及其細胞毒活性進行研究，采用硅膠、Sephadex LH-20等多種色譜分離技術對牛角瓜莖乙醇提取物的乙酸乙酯部位進行分離，并采用四甲基唑藍(MTT)法測定化合物對4種腫瘤細胞的體外細胞毒活性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker AV-500型超導核磁共振波譜儀，TMS為內標(德國Bruker公司)；Autospec 300質譜儀(英國VG公司)；高效液相色譜儀(Agilent 1260)(美國安捷倫科技有限公司)；旋轉蒸發(fā)儀(Heidolph Laborota)；核磁管TA1008-200(河流科技有限公司)；ZHJH-C1109C超凈工作(上海智誠分析儀器制造有限公司)；HHB11360-S CO2培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)；Sephadex LH-20(德國Merck公司)；C18反相硅膠(日本Fuji公司)；柱層析硅膠G(200～300、60～80目)(青島海洋化工廠)；薄層層析硅膠H(青島海洋化工廠)；甲醇、乙腈為色譜純(天津市科密歐有限公司)；水為超純水；10%硫酸乙醇顯色劑。

1.2 材料

牛角瓜于2019年8月采自海南省?？谑?，并經中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所黃圣卓博士鑒定為蘿藦科(Asclepiadaceae)牛角瓜屬(Calotropis)植物牛角瓜(Calotropisgigantea)，憑證標本(WANG202001)，保存于中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所。

1.3 實驗方法

1.3.1 提取與分離

牛角瓜莖(5.2 kg)，干燥粉碎后用95%乙醇浸泡提取3次，提取液減壓濃縮得到乙醇提取物(219.7 g)。將提取物分散于水中成懸濁液，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(14.1 g)和正丁醇萃取物。乙酸乙酯萃取物經正相硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯(15∶1→0∶1)、丙酮梯度洗脫，得到14個流份(Fr.1～Fr.14)。Fr.10經反相硅膠柱色譜(甲醇-水3∶7→1∶0)得到13個流份(Fr.10.1～Fr.10.13)，其中流份Fr.10.8(633.6 mg)經減壓硅膠柱色譜和Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇)分離得到化合物1(2.0 mg)、2(5.9 mg)、4(22.0 mg)、5(402.7 mg)；流份Fr.10.6(14.5 mg)經Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇)分離得到化合物3(5.1 mg)。流份Fr.2(964.4 mg)經反相硅膠柱色譜(甲醇-水3∶7→1∶0)得到6個流份(Fr.2.1～Fr.2.6)，其中流份Fr.2.1(87.7 mg)經減壓硅膠柱色譜分離得到化合物9(4.1 mg)和10(5.0 mg)；流份Fr.2.2(9.0 mg)通過結晶得到化合物8(5.4 mg)，流份Fr.2.3(27 mg)經Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇)分離得到化合物6(15.0 mg)，Fr.2.4(11.3 mg)經Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇)分離得到化合物7(5.4 mg)。

1.3.2 活性測試

采用MTT法測試化合物1～10對慢性髓原白血病細胞K562、人胃癌細胞SGC-7901、人肺癌細胞A549和人宮頸癌細胞HeLa的體外細胞毒活性?；衔锓謩e用DMSO溶解后配成20 mmol/L儲備液，臨用前稀釋到適合的濃度。將4種人體腫瘤細胞制成單細胞懸浮液，接種于96孔板上，并設空白組、對照組以及實驗組，每組設3個平行孔，實驗組為0.078、0.156、0.312、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L的含藥樣品溶液，在96孔板中直接加入各個樣品溶液10 μL，連續(xù)培養(yǎng)72 h后。再加入15 μL配制好的MTT溶液(5 mg/mL)，在CO2恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，孵育后使用酶標儀測量其在波長為490 nm下的吸光度(A)，并計算生長抑制率及IC50值。鹽酸阿霉素為陽性對照。

2 實驗結果

2.1 結構鑒定

化合物1白色粉末；C26H32O11；ESI-MS：m/z521.1 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δH：7.15(1H，d，J= 8.4 Hz，H-5)，7.03(1H，d，J= 1.8 Hz，H-2)，6.95(1H，d，J= 1.8 Hz，H-2′)，6.93(1H，dd，J= 8.4，1.8 Hz，H-6)，6.82(1H，dd，J= 8.1，1.8 Hz，H-6′)，6.77(1H，d，J= 8.1 Hz，H-5′)，4.88(1H，m，H-1′′)，4.77(1H，d，J= 4.1 Hz，H-7′)，4.71(1H，d，J= 4.1 Hz，H-7)，4.25(2H，m，H-9a，9′a)，3.90(1H，m，H-6′′a)，3.87(3H，s，3-OCH3)，3.86(3H，s，3′-OCH3)，3.88(2H，m，H-9b，9′b)，3.69(1H，m，H-6′′b)，3.49(1H，m，H-2′′)，3.45(1H，m，H-3′′)，3.40(1H，m，H-4′′)，3.39(1H，m，H-5′′)，3.15(2H，m，H-8，8′)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δC：137.5(C-1)，111.6(C-2)，151.0(C-3)，147.5(C-4)，118.0(C-5)，119.8(C-6)，87.5(C-7)，55.3(C-8)，72.7(C-9)，133.8(C-1′)，111.0(C-2′)，147.3(C-3′)，149.1(C-4′)，116.1(C-5′)，120.0(C-6′)，87.9(C-7′)，55.8(C-8′)，72.7(C-9′)，102.8(C-1′′)，74.8(C-2′′)，77.8(C-3′′)，71.3(C-4′′)，78.2(C-5′′)，62.5(C-6′′)，56.7(3-OCH3)，56.4(3′-OCH3)。以上數據與文獻報道對照基本一致[12]，故鑒定化合物1為(-)-松脂醇-4′-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物2棕色粉末;C34H38O14；ESI-MS：m/z671.6 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δH：7.58(1H，dd，J= 8.2，1.8 Hz，H-6′′′)，7.54(1H，br s，H-2′′′)，6.99(1H，d，J= 8.3 Hz，H-5)，6.98(1H，s，H-2′)，6.97(1H，br s，H-2)，6.88(1H，d，J= 8.3 Hz，H-5′)，6.82(1H，dd，J= 8.3，1.8 Hz，H-6′)，6.78(1H，d，J= 8.2 Hz，H-5′′′)，6.45(1H，br d，J= 8.3 Hz，H-6)，4.87(1H，d，J= 7.3 Hz，H-1′′)，4.69(2H，m，H-7，7′)，4.66(1H，dd，J= 11.7，2.2 Hz，H-6′′a)，4.48(1H，dd，J= 11.7，8.2 Hz，H-6′′b)，4.26(1H，dd，J= 9.0，7.9 Hz，H-9a)，4.15(1H，dd，J= 9.0，7.9 Hz，H-9′a)，3.89(3H，s，3-OCH3)，3.84(1H，m，H-9b)，3.82(3H，s，3′-OCH3)，3.82(3H，s，3′′′-OCH3)，3.82(1H，m，H-9′b)，3.78(1H，m，H-5′′)，3.54(2H，m，H-2′′，3′′)，3.43(1H，dd，J= 9.2，8.9 Hz，H-4′′)，3.10(1H，m，H-8′)，3.00(1H，m，H-8)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δC：137.3(C-1)，111.7(C-2)，150.7(C-3)，147.1(C-4)，117.7(C-5)，119.3(C-6)，87.0(C-7)，55.4(C-8)，72.8(C-9)，133.7(C-1′)，111.1(C-2′)，149.1(C-3′)，144.3(C-4′)，116.0(C-5′)，120.2(C-6′)，87.6(C-7′)，55.3(C-8′)，72.5(C-9′)，102.4(C-1′′)，74.8(C-2′′)，77.8(C-3′′)，72.2(C-4′′)，75.6(C-5′′)，65.0(C-6′′)，122.5(C-1′′′)，113.9(C-2′′′)，148.8(C-3′′′)，153.1(C-4′′′)，116.1(C-5′′′)，125.3(C-6′′′)，167.8(C-7′′′)，56.7(3-OCH3)，56.5(3′-OCH3)，56.5(3′′′-OCH3)。以上數據與文獻報道對照基本一致[13]，故鑒定化合物2為(+)-pinoresinol-4-O-[6′′-O-vanilloyl]-β-D-glucopyranoside。

化合物3黃色油狀;C31H36O11；ESI-MS：m/z607.2 [M+Na]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δH：6.97(2H，br s，H-2，6)，6.97(2H，br s，H-2′，6′)，6.96(1H，br s，H-2′′)，6.77(1H，dd，J= 8.1，1.6 Hz，H-6′′)，6.72(1H，d，J= 8.1 Hz，H-5′′)，6.55(1H，d，J= 15.8 Hz，H-7′)，6.24(1H，dt，J= 15.8，6.0 Hz，H-8′)，5.58(1H，d，J= 6.0 Hz，H-7)，4.90(1H，d，J= 5.1 Hz，H-7′′)，4.25(1H，dd，J= 8.9，5.1 Hz，H-8′′)，4.20(2H，d，J= 6.0 Hz，H-9′)，3.92(1H，m，H-9′′a)，3.91(3H，s，5-OCH3)，3.88(2H，d，J= 5.2 Hz，H-9)，3.82(3H，s，5′-OCH3)，3.81(3H，s，3-OCH3)，3.79(3H，s，3′-OCH3)，3.59(1H，m，H-9′′b)，3.48(H，m，H-8)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δC：139.4(C-1)，103.9(C-2，6)，154.6(C-3，5)，136.3(C-4)，88.9(C-7)，55.5(C-8)，64.9(C-9)，132.8(C-1′)，116.5(C-2′)，130.0(C-3′)，149.1(C-4′)，145.5(C-5′)，112.1(C-6′)，131.9(C-7′)，127.7(C-8′)，63.8(C-9′)，133.8(C-1′′)，111.3(C-2′′)，148.6(C-3′′)，146.8(C-4′′)，115.6(C-5′′)，120.7(C-6′′)，74.0(C-7′′)，87.3(C-8′′)，61.6(C-9′′)，56.3(3-OCH3)，56.3(3′-OCH3)，56.6(5-OCH3)，56.8(5′-OCH3)。以上數據與文獻報道對照基本一致[14]，故鑒定化合物3為(-)-jatrointelignan B。

化合物4棕色粉末;C42H50O16；ESI-MS：m/z833.2 [M+Na]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δH：6.94(2H，br s，H-2′′，H-2′′′)，6.74(2H，br d，J= 8.1 Hz，H-6′′，H-6′′′)，6.69(2H，d，J= 8.1 Hz，H-5′′，H-5′′′)，6.65(4H，s，H-2，H-6，H-2′，H-6′)，4.91(2H，br s，H-7′′，H-7′′′)，4.71(2H，d，J= 2.5 Hz，H-7，H-7′)，4.23(2H，m，H-9b，9′b)，3.91(2H，m，H-8′′，H-8′′′)，3.87(2H，m，H-9′′a，9′′′a)，3.86(2H，m，H-9a，9′a)，3.83(12H，s，3′′-OCH3，3′′′-OCH3，5′′-OCH3，5′′′′-OCH3)，3.82(12H，s，3-OCH3，3′-OCH3，5-OCH3，5′-OCH3)，3.55(2H，m，H-9′′b，9′′′b)，3.08(4H，m，H-8，H-8′)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δC：138.8(C-1，C-1′)，104.2(C-2，C-6，C-2′，C-6′)，154.5(C-3，C-5，C-3′，C-5′)，136.1(C-4，C-4′)，87.2(C-7，C-7′)，55.6(C-8，C-8′)，73.0(C-9，C-9′)，133.8(C-1′′，C-1′′′)，111.3(C-2′′，C-2′′′)，148.6(C-3′′，C-3′′′)，146.8(C-4′′，C-4′′′)，115.6(C-5′′，C-5′′′)，120.7(C-6′′，C-6′′′)，74.0(C-7′′，C-7′′′)，87.2(C-8′′，C-8′′′)，61.7(C-9′′，C-9′′′)，56.7(3-OCH3，3′-OCH3，5-OCH3，5′-OCH3)，56.3(3′′-OCH3，3′′′-OCH3，5′′-OCH3，5′′′-OCH3)。以上數據與文獻報道對照基本一致[15]，故鑒定化合物4為(+)-(7R,7′R,7′′S,7′′′S,8S,8′S,8′′S,8′′′S)-4′′,4′′′-dihydroxy-3,3′,3′′,3′′′,5,5′-hexamethoxy-7,9′;7′,9-diepoxy-4,8′′;4′,8′′′-bisoxy-8,8′-dineolignan-7′′,7′′′,9′′,9′′′-tetraol。

化合物5白色粉末;C29H44O9；ESI-MS：m/z559.2 [M+Na]+；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δH：5.90(1H，s，H-22)，4.97(1H，d，J= 18.3 Hz，H-21a)，4.88(1H，d，J= 18.3 Hz，H-21b)，4.53(1H，d，J= 7.9 Hz，H-1′)，3.51(1H，m，H-3)，3.79(1H，m，H-3′)，3.64(1H，m，H-19a)，3.53(1H，m，H-5′)，3.49(1H，m，H-19b)，3.06(1H，m，H-2′)，2.96(1H，m，H-4′)，2.70(1H，dd，J= 9.0，5.3 Hz，H-17)，2.19(1H，d，J= 12.8 Hz，H-1a)，1.99(1H，m，H-16a)，1.98(1H，m，H-7a)，1.94(1H，m，H-15a)，1.76(1H，m，H-7b)，1.68(1H，m，H-2a)，1.62(1H，m，H-4a)，1.62(1H，m，H-8)，1.56(1H，m，H-15b)，1.54(1H，m，H-11a)，1.45(1H，m，H-11b)，1.40(1H，m，H-2b)，1.36(1H，m，H-12a)，1.28(1H，m，H-4b)，1.24(1H，m，H-12b)，1.20(1H，m，H-6a)，1.09(3H，d，J= 6.1 Hz，H-6′)，1.09(1H，m，H-6b)，1.08(1H，m，H-5)，0.94(1H，m，H-16b)，0.86(1H，td，J= 12.0，3.3 Hz，H-9)，0.80(3H，s，H-18)，0.63(1H，t，J= 12.8 Hz，H-1b)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δC：31.3(C-l)，29.5(C-2)，76.5(C-3)，34.6(C-4)，44.0(C-5)，28.0(C-6)，26.4(C-7)，41.2(C-8)，49.6(C-9)，38.8(C-10)，22.4(C-11)，39.5(C-12)，49.5(C-13)，83.9(C-14)，32.1(C-15)，27.3(C-16)，50.2(C-17)，15.8(C-18)，57.8(C-19)，176.5(C-20)，73.2(C-21)，116.2(C-22)，173.9(C-23)，98.1(C-1′)，70.7(C-2′)，71.4(C-3′)，72.7(C-4′)，68.6(C-5′)，18.0(C-6′)。以上數據與文獻報道對照基本一致[16]，故鑒定化合物5為弗如糖苷。

化合物6白色粉末;C13H18O3；ESI-MS：m/z245.1 [M+Na]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δH：7.00(1H，d，J= 15.8 Hz，H-7)，6.43(1H，d，J= 15.8 Hz，H-8)，5.95(1H，d，J= 8.0 Hz，H-4)，2.59(1H，d，J= 17.2 Hz，H-2a)，2.30(3H，s，H-10)，2.25(1H，d，J= 17.2 Hz，H-2b)，1.89(3H，s，H-11)，1.06(3H，s，H-12)，1.02(3H，s，H-13)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δC：42.6(C-1)，50.5(C-2)，200.4(C-3)，128.0(C-4)，164.7(C-5)，80.0(C-6)，148.4(C-7)，131.7(C-8)，200.7(C-9)，27.6(C-10)，23.5(C-11)，24.7(C-12)，19.2(C-13)。以上數據與文獻報道對照基本一致[17]，故鑒定化合物6為(+)-dehydrovomifoliol。

化合物7白色粉末;C9H7NO2；ESI-MS：m/z162.1 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δH：8.07(1H，br d，J= 7.5 Hz，H-5)，7.95(1H，s，H-2)，7.43(1H，br d，J= 7.5 Hz，H-8)，7.20(1H，br t，J= 7.5 Hz，H-6)，7.17(1H，br t，J= 7.5 Hz，H-7)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δC：133.4(C-2)，108.8(C-3)，127.6(C-4)，122.0(C-5)，123.6(C-6)，122.3(C-7)，112.9(C-8)，138.2(C-9)，169.3(C-10)。以上數據與文獻報道對照基本一致[18]，故鑒定化合物7為3-吲哚甲酸。

化合物8白色粉末;C9H10O4；ESI-MS：m/z183.1 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δH：7.25(1H，d，J= 7.2 Hz，H-6)，7.13(1H，d，J= 7.8 Hz，H-4)，7.06(1H，dd，J= 7.8，7.2 Hz，H-5)，3.81(3H，s，3-OCH3)，3.80(3H，s，2-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δC：127.4(C-1)，149.9(C-2)，154.7(C-3)，117.2(C-4)，123.2(C-6)，125.2(C-5)，169.7(C-7)，61.9(2-OCH3)，56.5(3-OCH3)。根據以上數據及二維核磁數據，故鑒定化合物8為2，3-二甲氧基苯甲酸。

化合物9白色粉末;C7H6O3；ESI-MS：m/z139.1 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δH：7.89(2H，d，J= 8.8 Hz，H-2，H-6)，6.84(2H，d，J= 8.8 Hz，H-3，H-5)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δC：122.7(C-1)，133.0(C-2，C-6)，116.0(C-3，C-5)，163.3(C-4)，170.1(C-7)。以上數據與文獻報道對照基本一致[19]，故鑒定化合物9為對羥基苯甲酸。

化合物10白色粉末;C8H8O4；ESI-MS：m/z169.1 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δH：7.57(2H，m，H-2，H-5)，6.86(1H，d，J= 8.7 Hz，H-6)，3.91(3H，s，3-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δC：123.1(C-1)，113.8(C-2)，152.7(C-3)，148.7(C-4)，115.8(C-5)，125.3(C-6)，170.1(1-COOH)，56.4(3-OCH3)。以上數據與文獻報道對照基本一致[20]，故鑒定化合物10為香草酸。

2.2 活性測試結果

化合物1～10的細胞毒活性測試結果(見表1)顯示化合物4和5對4種腫瘤細胞具有不同程度的細胞毒活性，其他化合物無明顯細胞毒活性。其中，化合物4對人宮頸癌細胞HeLa具有的抑制活性較強，IC50為12.37 μM；化合物5對慢性髓原白血病細胞K562的抑制活性最強，IC50為0.29 μM。

表1 化合物1～10的體外細胞毒活性測試結果Table 1 Results of compounds 1-10 cytotoxic activity in vitro

3 結論

從牛角瓜莖中分離得到10個化合物，化合物1、3、4和6～8為首次從該植物中分離得到，其中化合物1～4為木脂素類化合物，8～10為酚酸類化合物。測試化合物1～10對4種腫瘤的細胞毒活性，結果表明化合物4和5對4種腫瘤細胞具有不同程度的細胞毒活性，IC50值范圍分別為12.37～49.29和0.29～0.98 μM，其他化合物沒有顯示出明顯活性。根據文獻報道化合物4對人卵巢癌細胞SK-OV-3具有微弱的細胞毒活性，化合物5弗如糖苷是牛角瓜中主要的強心苷成分，超過提取物含量的2.8%，且對多種腫瘤細胞具有較強的細胞毒活性。最近的研究表明，弗如糖苷可通過誘導線粒體介導黑色素瘤細胞凋亡[21]，可能有助于預防黑色素瘤，這表明該化合物可能具有很多潛在活性尚未開發(fā)，具有進一步研究的價值。