鮮地黃低聚糖純化及其理化特性和抗氧化活性研究

錢艷艷，王 麗*，文春南，周 艷，李 曉，張麗先，周賢宇，麻兵繼*

1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院中藥材系；2河南省生物技術(shù)開發(fā)中心，鄭州 450002

地黃為玄參科地黃屬植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的塊根，為常用中藥材，通常以三種形式(鮮地黃、生地黃、熟地黃)入藥[1]。地黃的新鮮塊根稱鮮地黃[2]，鮮地黃性寒、味甘苦，具有降血糖、補(bǔ)肝腎等功效，歷代醫(yī)學(xué)對其特殊功效均有論述，且早已被臨床證實(shí)[3]。鮮地黃在河南民間有鮮食的習(xí)俗，如涼拌、烹炒[4]。地黃中的糖類化合物占地黃較大比例，其低聚糖是繼苷類、多糖之后發(fā)現(xiàn)的又一類活性組分，已知地黃低聚糖具有補(bǔ)血、降血糖等藥理活性，是地黃的有效成分[1]。鮮地黃由于不易保存且運(yùn)輸不便，致使其開發(fā)應(yīng)用受到一定的限制，目前的研究多集中在生地和熟地上，對鮮地黃系統(tǒng)的研究相對較少，Jia等[5]研究結(jié)果表明鮮地黃中水蘇糖含量為26.45%，明顯高于生地黃(9.16%)和熟地黃(5.98%)，具有潛在的研究價值。本實(shí)驗以鮮地凍干片為原料，利用超聲法和熱水法同時制備低聚糖，經(jīng)進(jìn)一步純化處理，最終獲得兩組低聚糖片段(GRCP和GRSP)，并對二者的理化特性及抗氧化能力進(jìn)行系統(tǒng)全面的分析，旨在為鮮地黃的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

懷地黃采自河南省焦作市溫縣，品種為85-5。硫酸(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)；無水乙醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；福林酚試劑、考馬斯亮藍(lán)(北京博奧拓達(dá)科技有限公司)；以上試劑均為分析純；1，1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH)購自東京化成工業(yè)株式會社。

1.2 主要儀器

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；JW-1032低速離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司)；YU-1810型號紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；Discovery DV215CD型號精密電子天平(美國奧豪斯公司)；SK2200H超聲波儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；LGJ-10真空冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)；BioTek Epoch全波長酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 提取純化

將鮮地黃洗凈瀝干，切薄片，放入-24 ℃冰箱中預(yù)冷凍之后，置于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥40 h，打粉備用。超聲法：稱取5 g地黃凍干粉，按料液比1∶20(g:mL)加入蒸餾水，在提前升溫至60 ℃的超聲儀中以100%的功率(即200 W)超聲提取10 min，停頓5 min，重復(fù)3次為一次提取，過程中不時攪拌，提取兩次，合并提取液[6]。熱水法：稱取5 g地黃凍干粉，按液料比1∶20加入蒸餾水，利用磁力攪拌器進(jìn)行提取，提取時間為4 h，溫度為80 ℃，提取兩次，合并提取液。提取液適當(dāng)濃縮后，采用80%乙醇醇沉，Sevag法脫蛋白，大孔樹脂HP-20脫色等處理后凍干，即得到兩種低聚糖。低聚糖溶液經(jīng)DEAE纖維素陰離子交換柱層析和Sephadex G-50凝膠柱層析純化，最終獲得超聲提鮮地低聚糖(GRCP)與熱水提鮮地低聚糖(GRSP)。

1.3.2 化學(xué)成分含量測定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法測定GRCP與GRSP中碳水化合物含量；以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用間羥基聯(lián)苯法測定酸性糖含量；以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量[7]。

1.3.3 糖分析與甲基化

采用Agilent 1260高效液相色譜儀(HPLC)進(jìn)行三種低聚糖含量測定，樣品濃度為5 mg/mL，色譜柱：Agilent ZORBOX NH2(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈∶水(7∶3)；進(jìn)樣量10 μL，流速為1.0 mL/min，柱溫箱溫度為40 ℃。示差折光檢測器(RID)檢測，檢測池溫度50 ℃。采用外標(biāo)一點(diǎn)法進(jìn)行分析。

采用配備電化學(xué)檢測器與DionexTMCarboPacTMPA20柱子的ICS5000型號離子色譜系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific)測定GRCP與GRSP的單糖組成[8]。樣品甲基化結(jié)果采用氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC/MS)進(jìn)行分析[9]。

1.3.4 光譜掃描

分別取純品適量，加水溶解，配制成濃度為0.5 mg/mL的溶液，使用紫外可見分光光度儀在190～600 nm范圍內(nèi)掃描，掃描間隔為2 nm，得到GRCP與GRSP的紫外掃描圖譜。取干燥的樣品適量，與溴化鉀研磨壓片，采用Bruker-Vector 22型號紅外光譜儀進(jìn)行紅外光譜掃描，掃描波數(shù)為4 000～400 cm-1[10]。

1.3.5 掃描電子顯微鏡(SEM)分析

GRCP與GRSP在真空濺射鍍膜機(jī)中鍍上金膜后，使用美國FEI公司的Quanta 250型號掃描電子顯微鏡對其進(jìn)行掃描電鏡分析，加速電壓為5 kV[11]。

1.3.6 熱分析

熱穩(wěn)定性的檢測使用的熱重量分析儀型號為NETZSCH STA 409 PC/PG。使用約5 mg的樣品，在氬氣(Ar)的保護(hù)下進(jìn)行分析，溫度從30 ℃上升到730 ℃，加熱速度為10.0 K/min。

1.3.7 質(zhì)譜分析

質(zhì)譜分析采用電噴霧質(zhì)譜(ESI)，正離子和負(fù)離子模式全掃描，質(zhì)量掃描范圍為m/z100～1 200。儀器型號為ama Zon ETD。

1.3.8 體外抗氧化能力測定

以Wang等[12]方法為基礎(chǔ)并稍做修改，進(jìn)行樣品對體外DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除活性測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 純化及化學(xué)分析

通過超聲法和熱水法獲得的兩組粗糖，得率分別為50.79%和68.27%。由圖1A、圖1C可以看到超聲提鮮地粗糖和熱水提鮮地粗糖經(jīng)過陰離子交換柱層析洗脫后，均可得3個峰，其中水洗脫組分得率最高，明顯高于另外兩個NaCl洗脫組分，表明粗糖中的主要組分均為水洗脫組分，分別命名為RCP和RSP。由圖1B、圖1D可以看到RCP和RSP經(jīng)Sephadex G-50柱洗脫后均得到單一對稱峰，說明經(jīng)DEAE-52纖維素分離已經(jīng)得到較高純度的低聚糖或是結(jié)構(gòu)相似的低聚糖[13]。GRCP和GRSP中的化學(xué)成分檢測結(jié)果見表1，二者碳水化合物含量分別是901.39±0.73和948.06±5.03 mg/g，糖醛酸含量分別為53.19±1.37和58.83±0.42 mg/g，可初步判斷二者均為中性糖。GRCP和GRSP的總蛋白含量未檢出，表明本實(shí)驗采用的脫蛋白方法較合理。

表1 GRCP和GRSP糖類組成 Table 1 Composition of GRCP and GRSP carbohydrate composition

圖1 DEAE-52和Sephadex G-50柱層析結(jié)果Fig.1 Results of DEAE-52 and Sephadex G-50 columns

2.2 理化特性分析

2.2.1 糖分析及甲基化分析

采用高效液相色譜法直接測定GRCP和GRSP中蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量，標(biāo)品出峰位置為：蔗糖:6.87 min，棉子糖：10.15 min，水蘇糖：15.80 min，GRCP和GRSP溶液在標(biāo)品位置上有相應(yīng)的峰存在。蔗糖、棉子糖和水蘇糖在GRCP和GRSP中總占比分別為85.06%和86.55%，水蘇糖在GRCP和GRSP中的相對含量分別是79.73%和80.99%，表明GRCP和GRSP中主要成分是低聚糖，且以水蘇糖為主。GRCP和GRSP均由8種單糖組成，均為阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、果糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸。GRCP中這8種單糖的質(zhì)量百分比為0.08∶51.40∶43.25∶0.57∶0.12∶4.23∶0.17∶0.17。GRSP中這8種單糖的質(zhì)量百分比為0.08∶51.56∶43.80∶0.46∶0.10∶3.74∶0.14∶0.11 。單糖的質(zhì)量百分比比值結(jié)果顯示GRCP和GRSP主要由半乳糖、葡萄糖組成，其次是果糖，表明二者可能具有相似的碳鏈骨架。半乳糖醛酸與葡萄糖醛酸在GRCP和GRSP中的總質(zhì)量百分比分別為0.32%、0.23%，此結(jié)果與糖醛酸含量測定結(jié)果一致，表明GRCP和GRSP均屬于中性糖。低聚糖主要為水蘇糖，是由2分子α-半乳糖、1分子α-葡萄糖和1分子β-果糖構(gòu)成的四糖。蔗糖是由1分子β-果糖、1分子α-葡萄糖構(gòu)成的二糖；棉子糖是由1分子α-半乳糖、1分子α-葡萄糖、1分子β-果糖構(gòu)成的三糖。以此推測，果糖和葡萄糖的質(zhì)量百分比應(yīng)該相接近，單糖組成果糖含量遠(yuǎn)低于葡萄糖，其原因可能是由于大量果糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖，其確切的原因有待進(jìn)一步研究。

由甲基化結(jié)果總離子流圖(見圖2)顯示，GRCP和GRSP主要甲基化樣品出峰時間相差不多，三個主峰的出峰時間均為13.8、16.9和17.9 min左右，對應(yīng)糖殘基分別是T-Glcp、1,6-Glcp、1,6-Galp，表明GRCP和GRSP的糖鏈主要以1→6連接的葡萄糖(分別占46.17%和49.32%)和半乳糖(分別占48.71%和46.50%)組成，端基主要是葡萄糖(分別占5.12%和4.18%)[14]。

圖2 GRCP(A)和GRSP(B)的甲基化總離子流圖Fig.2 Total ion flow diagrams of methylation of GRCP (A) and GRSP (B)

2.2.2 光譜分析

紫外掃描結(jié)果顯示，GRCP和GRSP均在約190 nm波長處有單一尖銳的大峰，表明樣品純度較高。二者在254 nm波長處均有小峰，GRSP在298 nm波長處有小峰，表明可能含有少量雜質(zhì)。二者峰形相似，但紫外吸收值不同，說明不同提取方法制備得到的兩組片段，其含量存在差異。紅外光譜分析的目的是鑒別GRCP和GRSP中的主要官能團(tuán)，如圖3B所示，二者FT-IR光譜相似，說明其含有相似官能團(tuán)。光譜在3 400 cm-1附近由于O-H鍵的伸縮振動出現(xiàn)了強(qiáng)而寬的吸收峰，表明樣品中存在分子內(nèi)氫鍵或分子間氫鍵[15]。在2 925 cm-1處的一個小峰是由次甲基中C-H鍵的伸縮振動引起的。1 644 cm-1處的峰常被認(rèn)為是來自結(jié)晶水中O-H鍵的伸縮振動。FT-IR光譜在1 560 cm-1處不存在特征帶，與提取的糖中蛋白質(zhì)含量極低相一致。在1 419、1 417和1 350 cm-1處的峰值與C-H鍵的折疊有關(guān)。在1 200～1 000 cm-1處較大的吸收峰是糖類化合物C-O的伸縮振動，與糖苷鍵的伸縮振動有關(guān)，其中1 143 cm-1為C-O-H的伸縮振動，1 050 cm-1為C-O-C的伸縮振動[16]。

圖3 GRCP和GRSP紫外光譜(A)和紅外光譜(B)分析圖Fig.3 Ultraviolet (A) and infrared (B) spectra of GRCP and GRSP

2.2.3 掃描電子顯微鏡(SEM)

由圖4中不同放大倍數(shù)下的地黃低聚糖SEM圖片可以看出，GRCP和GRSP的結(jié)構(gòu)有明顯不同。在×500、50 μm的放大條件下可以明顯看出GRCP呈片狀，且為大小不一的無規(guī)則碎片，含有較多不規(guī)則碎片狀顆粒，斷面尖銳；GRSP表面平滑且線條流暢[17]。在×2 000，20 μm的放大條件下可以看出GRCP含有表面凹凸不平的粗棒狀結(jié)構(gòu)，也有較細(xì)的光滑棒狀結(jié)構(gòu)，GRSP有直徑5～10 μm的光滑結(jié)節(jié)。原因可能是水提法較溫和，而超聲法由于超聲空化作用，對糖類結(jié)構(gòu)破壞較大，使其原本光滑的表面變得粗糙[18]。

圖4 GRCP(A)和GRSP(B)的SEM照片圖像Fig.4 Scanning electron micrographs of GRCP (A) and GRSP (B)注：圖像1的放大條件為5 kV，×500，100 μm；圖像2的放大條件為5 kV，×2 000，20 μm；圖像3的放大條件為5 kV，×1 000，50 μm；圖像4的放大條件為5 kV，×2 000，20 μm。Note:The magnifying condition of image 1 was 5 kV,×500,100 μm;The magnifying condition of image 2 was 5 kV,×2 000,20 μm;The magnifying condition of image 3 was 5 kV,×1 000,50 μm;The magnifying condition of image 4 was 5 kV ×2 000,20 μm.

2.2.4 熱分析

由圖5可知GRCP與GRSP的熱分解均分為兩個階段。第一階段為30.0～205.5 ℃和30.0～209.0 ℃，GRCP與GRSP在此過程中的質(zhì)量損失分別約為7.79%和6.77%，此過程主要與樣品中結(jié)合水的損失有關(guān)。第二階段的分解，可能是由于有機(jī)物的解聚。在205.5 ℃至700 ℃之間，GRCP的質(zhì)量下降了約69.69%，在209.0 ℃至700.0 ℃之間，GRSP的質(zhì)量下降了約72.49%。在第一階段GRCP質(zhì)量減少較多，第二階段則是GRSP質(zhì)量減少較多。GRCP與GRSP的初始分解溫度分別為205.5、209.0 ℃，兩個組分的分解速率分別在217.4、222.5 ℃時達(dá)到最大，二者裂解峰尖銳且對稱，表明成分單一，純度較高。TG和DSC結(jié)果表明，GRCP與GRSP結(jié)構(gòu)分別在205.5、209.0 ℃下相對穩(wěn)定，表明二者熱穩(wěn)定性好。

圖5 GRCP和GRSP的熱分解曲線Fig.5 Thermal decomposition curves of GRCP and GRSP

2.2.5 質(zhì)譜分析

利用ESI質(zhì)譜對GRCP和GRSP主成分進(jìn)行分析(荷質(zhì)比均四舍五入為整值進(jìn)行計算)，選擇質(zhì)譜中最顯著的分子離子峰進(jìn)行分析[19]。在正離子模式下，GRCP和GRSP表現(xiàn)出突出的三組分子離子峰信號：m/z365和527(對應(yīng)分子離子[M+Na]+)提示兩種化合物相對分子質(zhì)量為342和504；m/z689和705提示存在相對分子質(zhì)量為666的一種化合物(分別對應(yīng)分子離子[M+Na]+和[M+K]+)。在負(fù)離子模式下，m/z341和377提示存在相對分子質(zhì)量為342的一種化合物(分別對應(yīng)分子離子為[M-H]-、[M+35Cl]-)；同樣，m/z503、539和m/z665、701分別提示存在相對分子質(zhì)量為504和666的兩種化合物。而相對分子質(zhì)量為342、504、666的化合物，對應(yīng)的物質(zhì)分別是蔗糖、棉子糖和水蘇糖[20]。GRCP和GRSP的正離子質(zhì)譜圖中的m/z689、705與負(fù)離子質(zhì)譜圖中的m/z665、701豐度明顯高于其他峰，表明GRCP和GRSP的主要成分為水蘇糖，而棉子糖含量則遠(yuǎn)低于水蘇糖含量。

2.3 抗氧化活性

利用GRCP和GRSP清除DPPH自由基和超氧陰離子自由基能力評價其體外抗氧化活性，結(jié)果(見圖6)在樣品濃度為0.5～7.0 mg/mL時，GRSP清除DPPH自由基能力強(qiáng)于GRCP，濃度為7.0～9.0 mg/mL時，GRCP強(qiáng)于GRSP，在10 mg/mL時二者清除DPPH自由基能力幾乎相同。在樣品濃度為0.5～10.0 mg/mL范圍內(nèi)，GRCP清除超氧陰離子自由基能力強(qiáng)于GRSP，至10 mg/mL時，二者的清除能力均達(dá)到60%。隨著樣品濃度由0.5 mg/mL增加到10 mg/mL，GRCP和GRSP清除DPPH自由基能力分別提高了約15%和10%，二者清除超氧陰離子自由基能力分別提高了約15%和30%。綜上所述，GRCP和GRSP對DPPH自由基和超氧陰離子自由基均表現(xiàn)出一定的清除作用，可作為潛在的抗氧化劑。

圖6 GRCP和GRSP的抗氧化能力Fig.6 The radical scavenging activities of GRCP and GRSP

3 討論

以鮮地黃凍干片為原料，利用超聲法和熱水法對其所含低聚糖進(jìn)行提取純化處理，最終得到GRCP和GRSP兩組片段。二者的碳水化合物含量分別是901.39和948.06 mg/g，二者雜質(zhì)少、純度高，表明純化比較成功，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前人提取的糖類中水蘇糖占比為26.45%的結(jié)論[21]。本實(shí)驗對鮮地黃中水蘇糖的提取純化及理化性質(zhì)進(jìn)行全面研究，結(jié)果表明，GRCP和GRSP中的主要官能團(tuán)相同，主要成分均為低聚糖，以水蘇糖為主，熱分析結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)分別在205.5、209.0 ℃以下較為穩(wěn)定。兩組片段的單糖組成種類一致，但比例不同，SEM觀察表明其外觀形貌具有一定的差異，表明不同提取方法對低聚糖結(jié)構(gòu)具有一定的影響?；钚詼y定結(jié)果表明兩組片段有一定的抗氧化活性。質(zhì)譜結(jié)果同樣表明GRCP和GRSP的主要成分是水蘇糖，水蘇糖是一種功能性低聚糖，由2分子α-半乳糖、1分子α-葡萄糖和1分子β-果糖構(gòu)成的四糖，具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、調(diào)節(jié)免疫等功效，是一種優(yōu)質(zhì)的功能性食品配料。低聚糖為2～10個單糖通過糖苷鍵連接而成的低聚糖，常用低聚糖提取方法為水提醇沉法，用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇沉淀以去除多糖，降低多糖的干擾，有利于進(jìn)一步純化[22]。Wu[23]采用75%乙醇提取鮮地黃低聚糖，取上清液進(jìn)行后續(xù)提取。同時，體積分?jǐn)?shù)為80%左右的乙醇常被用于沉淀以獲得多糖。如Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)可分別采用體積分?jǐn)?shù)為30%、60%、80%的乙醇沉淀獲得不同分子量的多糖以得到平菇多糖。Yang等[24]采用80%的乙醇沉淀多糖并對其進(jìn)行純化，最終分別得到樺褐孔菌多糖和紅棗多糖。Ye等[6]從提取液的90%乙醇沉淀中得到白花蛇舌草多糖等。本實(shí)驗加入四倍于提取液體積的無水乙醇(最終濃度為80%)進(jìn)行醇沉，取沉淀繼續(xù)純化，最終純化物的主要成分是水蘇糖，表明80%的乙醇沉淀中存在低聚糖，并不都是多糖。產(chǎn)生這一結(jié)果的原因可能是水蘇糖以被包裹的形式，大量被80%乙醇所沉淀，或者是水蘇糖在80%的乙醇中溶解度有限，可部分沉淀。然而，具體的原因還有待進(jìn)一步研究。預(yù)實(shí)驗中將醇沉物用3 500 Da透析袋透析發(fā)現(xiàn)，3 500 Da透析袋內(nèi)的糖類物質(zhì)得率只有0.61%，也表明醇沉物中絕大部分物質(zhì)分子量較小。所以后期采用500～1 000 Da的透析袋將純化物與其他小分子物質(zhì)及雜質(zhì)分離開，這是提高樣品純度的一種簡便好用的方法。本研究為鮮地黃低聚糖尤其是水蘇糖資源的系統(tǒng)研究和進(jìn)一步合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)。