苦豆子總堿對潰瘍性結腸炎小鼠結腸及肝組織中FXR、TGR5、CYP7A1蛋白表達的影響

肖 瑩，華永麗，賈婭倩，董嘉琪，李 芳，魏彥明，袁子文，紀 鵬

甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州 730070

苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)是豆科槐屬多年生草本植物，主要分布在我國西北干旱半干旱荒漠草地、鹽堿地、沙丘，屬耐鹽堿沙生植物[1]。具有清熱解毒、除濕作用，對胃腸道等疾病具有很好的治療作用。生物堿是苦豆子的主要活性成分之一，研究顯示苦豆子生物堿對心肌炎、肝炎、潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)都具有良好的治療效果[2]。本課題組前期研究也證明苦豆子總堿對UC具有良好療效。

UC是一種病因尚未明確的非特異性結腸炎癥，病變主要累及結腸黏膜和黏膜下層[3]，與遺傳、環(huán)境、腸道微生態(tài)和免疫失衡等等多種因素有關[4]，這些因素導致腸道內(nèi)環(huán)境紊亂、腸黏膜上皮功能障礙、黏膜免疫反應異常，最后導致腸道反復炎癥，引起UC的發(fā)生發(fā)展[5,6]。近年研究已證實膽汁酸與腸道疾病有密切關系[7]，其UC的產(chǎn)生原因為腸道菌群失衡、上皮功能障礙和異常的免疫應答，而膽汁酸通過多種途徑都參與這些過程[8]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)苦豆子總堿可以降低UC小鼠血清中的總膽汁酸(TBA)和總膽固醇(T-CHO)水平，膽汁酸靶向代謝組學結果顯示血清中α-鼠膽酸(α-muricholic acid，α-MCA)、β-鼠膽酸(β-muricholic acid，β-MCA)、ω-鼠膽酸(ω-muricholic acid，ω-MCA)和膽酸(cholic acid，CA)在模型組顯著升高，而苦豆子總堿治療后顯著下降[9]。膽汁酸在胃腸道中主要通過兩個受體影響其功能，分別為法尼醇X受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)和G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5(G protein-coupled bile acid receptor 5，TGR5)，F(xiàn)XR和TGR5因發(fā)現(xiàn)其在肝臟和結腸大量表達，并在炎癥調(diào)節(jié)中有非常重要的作用，可能成為治療UC非常有價值的標靶[10,11]。UC的主要標志就是黏膜炎癥，F(xiàn)XR可以調(diào)節(jié)結腸黏膜內(nèi)的促炎細胞因子的產(chǎn)生[12]，其水平可有效反映潰瘍性結腸炎的病情嚴重程度[13]。肝臟和腸道有著密切的聯(lián)系[14]，膽固醇在肝細胞內(nèi)通過滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上膽固醇7α-羥化酶CYP7A1(cholesterol 7α-hydroxylase)啟動的中性(或經(jīng)典)途徑，合成膽汁酸[15,16]，膽汁酸在體內(nèi)作為一種信號分子，通過激活FXR、TGR5受體調(diào)控機體代謝。前期研究發(fā)現(xiàn)苦豆子總堿雖然可以影響血清膽汁酸的變化，但是膽汁酸合成通路受FXR/TGR5的調(diào)控，具體苦豆子總堿如何通過FXR/TGR5通路影響血清膽汁酸的變化還不明確。因此，本研究以苦豆子總堿為研究對象，采用葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導小鼠急性潰瘍性結腸炎模型，分析苦豆子總堿對小鼠結腸和肝臟組織FXR、TGR5、CYP7A1蛋白的表達影響，以探討苦豆子總堿對DSS誘導的急性UC小鼠FXR/TGR5通路的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只雄性BALB/c小鼠(8周齡，18～20 g)，購自中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心，動物許可證號：SCXK(甘)20200006。動物購進適應性飼養(yǎng)3天開始實驗，小鼠飼養(yǎng)條件：溫度24±2 ℃、濕度50%±5%、12 h明暗循環(huán)。全價配合飼料以及純凈水供小鼠自由攝取。動物實驗程序與福利均符合實驗動物倫理學要求(倫理批準編號：GSAU-AEW-2020-0911)。

1.2 藥物與試劑

苦豆子采自寧夏沙漠邊緣，由甘肅農(nóng)業(yè)大學魏彥明教授鑒定。柳氮磺胺嘧啶(salazosulfapyridine，SASP)腸溶片，國藥準字H31020557，購自上海信誼天平藥業(yè)有限公司；葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)(M.W.=36 000～50 000)購自MP公司；白介素-10(Interleukin-10，IL-10)、IL-23、IL-17、IL-1β小鼠ELISA試劑盒均購于欣博盛生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒500微孔購自北京索萊寶科技有限公司，貨號PC0020；總膽固醇TCH試劑盒(貨號A111-1-1)、總膽汁酸TBA試劑盒(貨號E003-2-1)購自南京建成生物工程研究所；Rabbit Polyclonal Antibody：FXR/NR1H4、CYP7A1 購自北京博奧森生物技術有限公司；TGR5/GPBAR1購自CUSABIO生物科技有限公司；beta Actin、HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)購自Proteintech生物科技有限公司。RIPA裂解液、上樣Loading Buffer、SDS、TEMED、BIS-ACR、SDS-PAGE分離膠/濃縮膠緩沖液、Tris、甘氨酸、吐溫80、PVDF膜、脫脂奶粉均購自北京索萊寶科技有限公司。ECL發(fā)光液購自南京諾維贊生物科技有限公司。

1.3 儀器

美國MD光吸收酶標儀，SpectraMaxPlus84/190/Versamax/340PC；Olympus DP-71顯微照相系統(tǒng)，日本Olympus公司；冷凍型高通量組織研磨機；Bio-Rad小型垂直板電泳槽、小型轉(zhuǎn)印槽、電泳儀均購自美國伯樂公司；紫外分光光度計。

1.4 藥物制備

稱取20 g苦豆子，研磨并用20目篩子篩選后以50%乙醇提取溶劑，提取3次，提取時間分別為12、8、4 h，加入提取劑的量分別為12、10及8倍?；旌先螢V液，濃縮，并制成干膏，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

總生物堿含量測定：稱取0.025 g苦豆子溶于5 mL乙醇，吸出30 μL揮發(fā)溶劑后分別加6 mL溴麝香草酚藍和氯仿振蕩混勻，靜置2 h，紫外分光光度計420 nm處測得總生物堿含量為246 mg/g。

1.5 動物造模與藥物治療

將60只BALB/c小鼠隨機分為空白對照組(control group，Con)、葡聚糖硫酸鈉模型組(dextran sulfate sodium model group，DSS)、陽性對照組(salazosulfapyridine group，SASP)、苦豆子總堿組(total alkaloids fromSophoraalopecuroidesgroup，TASA)，每組15只。實驗前適應性飼養(yǎng)3天。除空白對照組給予蒸餾水外，其余組給予 BALB/c小鼠3.5%DSS飲水使其連續(xù)自由飲用7天以建立小鼠急性UC模型，造模的同時每天灌胃苦豆子總堿(75 mg/kg)進行治療，根據(jù)課題組前期實驗選擇苦豆子總堿最佳治療濃度[9]，并以柳氮磺胺嘧啶(450 mg/kg)為陽性對照藥物，每天早晨更換新鮮DSS水溶液，小鼠灌胃體積均為0.015 mL/g。

1.6 疾病活動指數(shù)評分

實驗期間每天記錄各組小鼠體重、糞便性狀及便血程度，疾病活動指數(shù)評分判斷標準見表1[17]。

表1 疾病活動指數(shù)評分判斷標準Table 1 The score scales for the disease activity index

1.7 樣品采集

實驗結束后，摘眼球采血法收集血液于1.5 mL EP管中，室溫靜置2～3 h后3 000 rpm離心10 min，分離血清，存于-80 ℃?zhèn)溆?。采血后頸椎脫臼法處死小鼠，采集小鼠結腸并量取長度，后分段采集各組小鼠結腸(結前、結后)、回腸以及肝臟組織(3份)，凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。每組隨機抽取3只老鼠的結腸組織于10%甲醛溶液、中性甲醛固定液、多聚甲醛固定液中，分別用于蘇木精-伊紅(HE)染色、阿利新藍染色、過碘酸雪夫氏染色(schiff periodic acid shiff，PAS)。

1.8 HE染色法觀察結腸組織病理學變化

用結腸長度以及組織學損傷來評估小鼠的潰瘍性結腸炎的治療情況和是否成功構建潰瘍性結腸炎模型。每組抽取3只小鼠結腸組織固定于10%甲醛溶液，后依次進行常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟、HE染色、后拍照(Leica DFC顯微拍照系統(tǒng))觀察結腸組織病變情況。組織病理學評分被用于量化結腸組織損傷程度，主要包括腸上皮細胞損傷程度和炎癥浸潤程度兩個方面。評分標準見表2[17]。

表2 結腸組織病理學評分判斷標準Table 2 The score scales for the colonic histopathology

1.9 糖原PAS、阿利新藍染色檢測結腸組織中杯狀細胞

小鼠結腸組織切片常規(guī)脫蠟至水依次自來水洗和蒸餾水洗；高碘酸氧化液10～20 min；蒸餾水洗2次；Schiff液染色10 min；流水沖洗5 min；蘇木素復染2～3 min；0.5%鹽酸乙醇分化；無水酒精、二甲苯透明，中性樹膠封固。采用濟南丹吉爾電子有限公司生產(chǎn)的Pannoramic 250數(shù)字切片掃描儀對切片進行圖像采集，每張切片先于40倍下觀察全部組織，選擇要觀察的區(qū)域采集400倍圖片，觀察具體表達情況。

1.10結腸組織中細胞因子的檢測

ELISA試劑盒檢測每組小鼠結腸中IL-10、IL-23、IL-17、IL-1β的含量，另取每組小鼠結腸組織勻漿上清液，按照ELISA試劑盒說明書分別測定結腸中IL-10、IL-23、IL-17、IL-1β的含量。

1.11血清中總膽汁酸與總膽固醇的檢測

總膽固醇TCH試劑盒和總膽汁酸TBA試劑盒分別檢測每組小鼠中總膽固醇和總膽汁酸的含量。

1.12Westernblot法檢測小鼠肝臟組織和結腸組織蛋白的表達

取每組小鼠結腸前段組織和肝臟組織，分別稱重，結腸組織約0.025 0 g左右，肝臟組織約0.030 0 g左右，后剪碎以20 mg組織加200 μL RIPA高效裂解液的比例加入裂解液，后每個樣加入兩顆鐵珠子，再將每個樣放入冷凍型高通量組織研磨機充分裂解15～20 min，此過程均采用冰上操作，以提取蛋白。BCA法測定所得蛋白濃度，10%的SDS-PAGE分離蛋白，在此期間于分離膠第一孔加入PageRuler Prestained Protein Ladder用于參考，電泳1 h 30 min后采用0.22 μmPVDF膜進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時間1 h，轉(zhuǎn)膜后在5%的脫脂奶粉中室溫封閉2 h，后將膜于以5%脫脂奶粉稀釋的一抗中4度孵育過夜，一抗兔多克隆抗體Rabbit Polyclonal Antibody：FXR/NR1H4(1∶1 000稀釋)、TGR5/GPBAR1(1∶1 000稀釋)、CYP7A1(1∶3 000稀釋)、beta Actin(1∶5 000稀釋)，一抗孵育結束后，TBST緩沖液洗膜(5 min一次，8～10次)，加入帶有HRP標記的Ⅱ抗稀釋液，室溫孵育1 h，二抗：HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(1∶5 000稀釋)，二抗孵育結束后，TBST緩沖液洗膜(5 min一次，8～10次)，后加入ECL化學發(fā)光液，于Amersham Imager 600化學發(fā)光儀進行化學發(fā)光的信號采集與拍照，保存圖片，ImageJ軟件對每組圖片進行灰度值分析。

1.13FXR、TGR5、CYP7A1蛋白表達與總膽汁酸、炎癥因子的相關性分析

采用SPSS 25.0軟件分析FXR、TGR5、CYP7A1蛋白表達與總膽汁酸、炎癥因子的相關性(Pearson)。R值=0.8～1.0極度相關，0.6～0.8強相關，0.4～0.6中等程度相關。

1.14統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0軟件和GraphPad Prism 5.0軟件進行分析，各組之間的統(tǒng)計學差異采用單因素方差分析(one-way ANOVN)進行組間比較，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，假設檢驗均采用雙側檢驗，以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 苦豆子總堿對急性UC小鼠體重、疾病活動指數(shù)、結腸長度的影響

DSS誘導的小鼠急性潰瘍性結腸炎模型成功復制，主要表現(xiàn)為便血腹瀉、體重下降、結腸縮短等明顯的臨床癥狀。給予小鼠DSS后第3天即可以看見糞便變軟，有少量出血，造模第6天除空白對照組其余組小鼠均開始嚴重的便血，且體重開始下降，DAI也持續(xù)升高，而苦豆子總堿治療組對體重下降和DAI升高有一定的抑制作用，第7天開始相比空白對照組，DSS誘導的模型組體重顯著降低(P<0.01)(見圖1A)，DAI顯著升高(P<0.01)(見圖1B)。造模后模型組小鼠較空白對照組結腸顯著縮短(P<0.01)，苦豆子總堿治療組能夠顯著增加結腸長度(P<0.01)(見圖1C)，說明苦豆子總堿可以改善由潰瘍性結腸炎引起的小鼠結腸縮短。

圖1 苦豆子總堿對于潰瘍性結腸炎小鼠體重、疾病活動指數(shù)、結腸長度的影響Fig.1 Effects of total alkaloid from S.alopecuroides on body weight,disease activity index and colonic length in acute ulcerative colitis mice注：與空白對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05 **P<0.01，下同。Note:Compared with Con,##P<0.01;Compared with DSS, *P<0.05,**P<0.01,the same below.

2.2 苦豆子總堿對急性UC小鼠結腸組織病理學影響及評分

HE染色觀察小鼠結腸組織病理學變化，由圖2可見，空白對照組小鼠結腸鏡下結構完整，腸絨毛整齊排列，腸隱窩完整，杯狀細胞豐富，無炎癥，無組織學異常，DSS誘導的模型組腸絨毛脫落，結構模糊，腸隱窩缺失，腸腺溶解，腸腺腺口打開，大量炎性細胞浸潤，有局部病變灶，腸上皮增生，苦豆子總堿治療組和陽性對照組均能不同程度改善炎癥引起的組織學改變，可見腸絨毛結構恢復，腸腺分泌功能亢進，炎性細胞被吸收，治療效果明顯(P<0.01)。

圖2 苦豆子總堿對急性UC小鼠結腸組織病理學影響(HE，×200)Fig.2 Effects of total alkaloid from S.alopecuroides on colonic histopathology in acute ulcerative colitis mice(HE,×200)

2.3 苦豆子總堿對急性UC小鼠杯狀細胞的影響

通過對小鼠結腸組織光鏡下觀察，確定PAS(見圖3A)和阿利新藍法(見圖3C)染色后杯狀細胞的數(shù)量，杯狀細胞分泌黏液(PAS染色陽性)，對腸上皮有潤滑和保護作用，PAS染色和阿利新藍染色均表現(xiàn)為DSS誘導的模型組杯狀細胞數(shù)量較空白對照組顯著降低(P<0.01)，但經(jīng)苦豆子總堿治療后杯狀細胞明顯增多(P<0.05)(見圖3B、D)。

圖3 苦豆子總堿對急性UC小鼠杯狀細胞的影響(PAS和阿利新藍，×400)Fig.3 Effects of total alkaloid from S.alopecuroides on goblet cell in acute ulcerative colitis mice(PAS and Alcian blue,×400)

2.4 苦豆子總堿對急性UC小鼠結腸組織炎性細胞因子的影響

如圖4所示，與空白對照組相比，DSS誘導的模型組小鼠結腸中抗炎因子IL-10顯著降低(P<0.01)(見圖4A)，促炎因子IL-23、IL-17、IL-1β顯著升高(P<0.01)(見圖4B、D)，表明DSS造模后小鼠體內(nèi)有明顯的炎癥反應。與模型組相比，苦豆子總堿治療組IL-10一定程度的升高，表明治療后對抗炎因子有一定的正向調(diào)節(jié)作用，而苦豆子總堿治療組IL-23、IL-17、IL-1β顯著降低(P<0.01)，且苦豆子總堿治療組的促炎因子降低較陽性對照組更明顯，要優(yōu)于陽性對照藥物的效果。表明經(jīng)苦豆子總堿治療后能顯著抑制促炎因子，對炎癥的發(fā)生有明顯的抑制作用。

圖4 苦豆子總堿對急性UC小鼠結腸組織炎性細胞因子的影響Fig.4 Effects of total alkaloid from S.alopecuroides on colon cytokines in UC mice

2.5 苦豆子總堿對急性UC小鼠血清中總膽汁酸與總膽固醇含量的影響

如圖5所示，與空白對照組相比，DSS誘導的模型組小鼠血清中總膽汁酸含量顯著升高(P<0.01)，經(jīng)苦豆子總堿和陽性對照藥治療后其含量都顯著降低(P<0.01)(見圖5A)，但苦豆子總堿治療組治療效果更優(yōu)。與空白對照組相比，DSS誘導的模型組小鼠血清中總膽固醇含量降低，但不具有統(tǒng)計學差異，而苦豆子總堿和陽性對照組膽固醇含量顯著升高(P<0.01)(見圖5B)。

圖5 苦豆子對急性UC小鼠血清中總膽汁酸與總膽固醇的影響Fig.5 Effects of total alkaloid from S.alopecuroides on serum TBA and T-CHO in UC mice

2.6 苦豆子總堿對急性UC小鼠肝臟組織和結腸組織相關蛋白表達的影響

如圖6所示，與空白對照組相比，DSS誘導的模型組小鼠肝組織中FXR、TGR5、CYP7A1蛋白的表達量均顯著降低(P<0.01)；與DSS誘導的模型組相比，陽性對照組小鼠肝組織中CYP7A1顯著升高(P<0.01)，苦豆子總堿治療組中CYP7A1變化無統(tǒng)計學意義，苦豆子總堿治療組和陽性對照組小鼠肝組織中FXR和TGR5表達量有升高趨勢，但無統(tǒng)計學意義(見圖6A～C)。

圖6 苦豆子總堿對急性UC小鼠肝臟組織相關蛋白表達的影響Fig.6 Effects of total alkaloid from S.alopecuroides on the expression of related proteins in liver of acute UC mice

如圖7所示，與空白對照組相比，DSS誘導的模型組小鼠結腸組織中FXR和CYP7A1蛋白的表達量均顯著降低(P<0.01)，TGR5蛋白的表達量變化無統(tǒng)計學意義；與DSS誘導的模型組相比，苦豆子總堿治療組小鼠結腸組織中FXR顯著升高(P<0.05)，CYP7A1和TGR5蛋白表達的變化雖有所升高，但無統(tǒng)計學意義(見圖7A～C)。

圖7 苦豆子總堿對急性UC小鼠結腸組織相關蛋白表達的影響Fig.7 Effects of total alkaloid from S.alopecuroides on the expression of related proteins in colon of acute UC mice

2.7 FXR、TGR5、CYP7A1蛋白表達與總膽汁酸、炎癥因子的相關性分析結果

FXR、TGR5、CYP7A1蛋白表達與總膽汁酸、炎癥因子的相關性結果見表3。由表3可知，結腸FXR、CYP7A1與總膽汁酸呈顯著負相關(P<0.05),相關系數(shù)r=-0.459，與IL-10呈極顯著正相關(P<0.01),r=0.553；結腸TGR5與IL-1β、IL-23、IL-17呈顯著負相關(P<0.05),r=-0.450、-0.509、-0.407；肝臟FXR、TGR5、CYP7A1與IL-10呈極顯著正相關(P<0.01),r=0.616、0.700、0.591。

表3 相關性分析結果Table 3 The results of correlation analysis

續(xù)表3(Continued Tab.3)

3 討論與結論

潰瘍性結腸炎UC是一種累及結腸及結腸黏膜的炎癥性腸病，因其發(fā)病機制復雜，在腸道內(nèi)蔓延區(qū)域廣、容易反復發(fā)作、且無特效藥、難以徹底治愈，被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一[18]。

本研究采用3.5%DSS誘導急性UC小鼠模型，相比其他造模方法，該方法操作簡單，易于復制，適用于藥物療效以及作用機制的研究[19]。結果表明，DSS誘導的模型組小鼠便血嚴重，小鼠體重下降，DAI評分明顯上升，結腸長度明顯縮短，結腸組織病理學觀察黏膜脫落，隱窩消失，以上指標表明本實驗造模成功。經(jīng)過苦豆子總堿治療后，上述指標均得到不同程度的改善，表明苦豆子總堿對DSS誘導的急性UC小鼠模型有一定的治療作用。

已有研究表明，在許多腸道炎癥性疾病中，黏膜屏障功能的破壞，與大量細胞因子的釋放而引起的杯狀細胞和黏液層的損耗有關[20,21]，本實驗采用PAS和阿利新藍特殊染色法觀察每組小鼠結腸杯狀細胞，發(fā)現(xiàn)DSS誘導的模型組杯狀細胞數(shù)量顯著降低，苦豆子總堿治療組數(shù)量明顯增加。有文獻報道，炎性反應具有促進UC發(fā)生發(fā)展的作用，其中IL-17、IL-23、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等促炎因子水平明顯升高，IL-10等抗炎因子水平明顯降低，導致促炎因子/抗炎因子失衡引起腸道炎性反應[22]。本實驗采用ELISA檢測了細胞因子的含量，發(fā)現(xiàn)DSS誘導的模型組小鼠促炎因子IL-23、IL-1β、IL-17的含量均顯著增加，苦豆子總堿治療組顯著降低；另外發(fā)現(xiàn)DSS誘導的模型組小鼠抗炎因子IL-10含量顯著降低，苦豆子總堿治療組有所提升。以上結果表明苦豆子總堿可以通過調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)炎性因子以及杯狀細胞的含量，進而起到抑制炎癥的作用，進一步激活小鼠體內(nèi)的抗炎機制，從而改善結腸炎癥，達到治療效果。為臨床治療UC提供一定的理論依據(jù)和方法，但炎癥因子和杯狀細胞如何改善腸道黏膜屏障功能有待進一步研究。

FXR、TGR5高表達于肝臟和結腸組織，參與體內(nèi)各項生理活動，在調(diào)節(jié)炎癥、膽汁酸代謝、改善腸黏膜機械屏障、維持穩(wěn)態(tài)等方面起著重要作用[23]。李彥希等研究發(fā)現(xiàn)藏藥二十五味松石丸對肝損傷的保護作用機制可能通過介導 FXR 信號通路，調(diào)控其下游基因及下游蛋白，抑制膽汁酸過量分泌及合成，使膽汁酸的代謝趨于穩(wěn)態(tài)后改善膽汁淤積，而對膽汁酸的轉(zhuǎn)化過程無影響[23]。Wei等[24]研究表明FXR在UC患者結腸黏膜中的表達明顯下降，而TGR5表達無明顯差異，這些研究結果與本研究結果相符。有研究表明腸過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARα)-UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGTs)信號是膽汁酸穩(wěn)態(tài)的重要決定因素。而在腸炎患者中過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARα)被激活，細胞內(nèi)膽汁酸的減少導致FXR-FGF15通路被抑制，進一步導致肝臟CYP7A1的上調(diào)，從而促進從頭開始的膽汁酸合成持續(xù)上升，打破了原有膽汁酸的穩(wěn)態(tài)[25]。FXR可通過誘導小分子異源二聚體伴侶(SHP)抑制CYP7A1負反饋調(diào)節(jié)膽汁酸的合成[26,27]。本實驗檢測了小鼠血清總膽固醇和總膽汁酸的含量，發(fā)現(xiàn)DSS誘導的模型組小鼠總膽汁酸含量顯著升高，總膽固醇有所降低，苦豆子總堿治療組總膽汁酸含量顯著降低，總膽固醇含量顯著升高。WB結果表明，DSS誘導的模型組小鼠肝臟和結腸組織FXR、TGR5、CYP7A1均顯著下調(diào)，苦豆子總堿治療組肝臟組織中FXR、TGR5、CYP7A1有所上調(diào)但不顯著；結腸組織FXR顯著上調(diào)，TGR5和CYP7A1有所上調(diào)。以上結果提示UC小鼠體內(nèi)FXR、TGR5、CYP7A1的下調(diào)明顯加劇了炎癥的發(fā)生與發(fā)展，而苦豆子總堿可以激活結腸內(nèi)FXR表達，從而降低血清中總膽汁酸的含量，減輕由于膽汁酸堆積引起的炎癥，減輕其炎癥反應，對UC起到一定的治療和保護作用。炎癥因子的檢測結果提示，F(xiàn)XR也可能通過抑制促炎因子的表達減輕炎癥反應。

FXR、TGR5、CYP7A1蛋白表達與總膽汁酸、炎癥因子的相關性分析發(fā)現(xiàn)，UC小鼠結腸組織FXR、CYP7A1與總膽汁酸均呈負相關，而與IL-10均呈正相關，TGR5與促炎因子IL-23、IL-1β、IL-17均呈負相關，提示苦豆子總堿通過激活結腸FXR、TGR5、CYP7A1治療UC小鼠的同時其血清總膽汁酸含量和促炎因子含量降低，而抗炎因子IL-10含量升高，推測其可能通過促炎因子降低及抗炎因子IL-10的升高減輕炎癥反應。與之前結果一致，進一步驗證了苦豆子總堿治療潰瘍性結腸炎可能通過調(diào)控膽汁酸代謝途徑改善炎癥。此外，苦豆子總堿雖然對TGR5的激活有一定的上調(diào)作用但不明顯，其也有可能起到抑制炎癥的作用，有待進一步的研究。

本研究通過給予 BALB/c小鼠3.5%DSS飲水使其連續(xù)自由飲用7天建立小鼠急性UC模型，評價并證實了苦豆子總堿能夠減少DSS誘導的小鼠結腸炎的組織損傷及炎癥癥狀?？喽棺涌倝A治療后血清總膽汁酸含量下降，結腸FXR、CYP7A1、TGR5蛋白均有不同程度的上調(diào)。苦豆子總堿可能通過增加小鼠結腸杯狀細胞和抑炎因子IL-10的含量,降低促炎因子IL-23、IL-1β、IL-17含量,以及激活FXR/TGR5通路相關蛋白的表達治療小鼠潰瘍性結腸炎。