瓦山錐化學成分及其酪氨酸酶抑制活性研究

王亞鳳，李思雯,2，何瑞杰，陽丙媛，黃永林*

1廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所 廣西植物功能物質研究與利用重點實驗室，桂林 541006；2桂林醫(yī)學院，桂林 541004

瓦山錐(Castanopsisceratacantha)為殼斗科錐屬(Castanopsis)植物，又名瓦山栲、黃山栲等，主要分布于云南、貴州、四川西南部，民間廣泛用于止血、止渴、止瀉(堅果)、慢性潰瘍等疾病的治療[1,2]。目前，國內外并沒有關于瓦山錐的化學成分和生物活性研究的相關文獻，本課題組對瓦山錐葉子乙醇提取物進行了初步化學成分研究[3]，研究發(fā)現(xiàn)瓦山錐葉子中含有結構新穎的三萜鞣花單寧類化合物，此類化合物是目前發(fā)現(xiàn)不多的一類化合物，由五環(huán)三萜和獨特多元酚通過酯化反應生成，目前只在錐屬植物中分離得到。具有較好的抗氧化、抗癌、降脂活性。為了闡明瓦山錐的物質基礎，發(fā)現(xiàn)新的三萜鞣花單寧類化合物，本實驗對瓦山錐80%乙醇提取物進行了系統(tǒng)的分離純化。酪氨酸酶(又稱為多酚氧化酶)與生物體內合成色素相關，直接影響黑色素的合成，是黑色素合成的限速酶，在生物體內具有多種重要的生理功能，特別是在皮膚美白、抗氧化作用等方面表現(xiàn)尤為突出，還與色素障礙疾病及惡性黑色素腫瘤的發(fā)生和治療有關。酪氨酸酶在黑色素形成過程中作用位點主要為羥基，瓦山錐乙醇提取物中主要為單寧類化合物，其中以含有多個獨特多元酚結構的化合物為主，具有很好的抗氧化、抗癌活性，是否具有酪氨酸酶抑制活性還未見報道。本實驗對分離得到的多個特征性單寧類化合物進行了酪氨酸酶抑制活性篩選，以期找到活性較好的天然化合物。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Brucker Avance 500 MHz超導核磁共振波譜儀(瑞典Bruker)；N-1100旋轉蒸發(fā)儀(東京理化)；CA-1111 冷卻水循環(huán)(東京理化)；自動接收儀(日本Advantec)；F254硅膠薄層板(德國默克)；Sephadex LH-20(25～100 μm;GE Healthcare Bio-Science AB)；Toyopearl HW-40F(日本TOSOH公司)；Diaion HP20SS(75～150 μm;Mistubishi Chemical)；MCI gel CHP 20P(75～150 μm;Mistubishi Chemical)；Toyopearl Butyl-650C(日本TOSOH公司)；酪氨酸酶(上海源葉)；L-多巴(上海源葉)；磷酸鹽緩沖鹽水(北京Solarbio)；提取、分離所用試劑均為分析純。

瓦山錐于2017年8月采自云南省景洪市，經廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所丁濤副研究員鑒定為殼斗科錐屬植物瓦山錐(Castanopsisceratacantha)的樹葉，憑證標本(20170826)保存于廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所廣西植物功能物質研究與利用重點實驗室。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取分離

干燥瓦山錐葉3.5 kg，切成碎片后用80%乙醇室溫浸提2次，每次32 L，每次7天，合并提取液并過濾，濾液經減壓濃縮后得浸膏481.3 g。浸膏水溶解后經Sephadex LH-20(8.5 cm × 40 cm)柱層析分離，甲醇-水(0%→100%，每20%為1梯度，每1梯度2 L)和60%丙酮-水(3 L)溶液洗脫，經薄層層析分析劃段，得到8個餾分：Fr.1～8。Fr.3經MCI gel CHP 20P、Diaion HP20SS、Toyopearl HW-40F等色譜柱反復層析分離純化，得到化合物2(34 mg)、11(9 mg)、12(0.3 g)、13(0.7 g)、16(68 mg)、17(0.5 g)。Fr.4經Diaion HP20SS、Toyopearl HW-40F、Sephadex LH-20等色譜柱反復層析分離純化得化合物1(86 mg)、3(61 mg)、9(72 mg)、10(38 mg)、14(94 mg)、15(34 mg)。Fr.6經Diaion HP20SS、Toyopearl HW-40F、Toyopearl Butyl-650C、ODS C18等色譜柱層析分離純化，得到化合物4(100 mg)、15(74 mg)。Fr.7經MCI gel CHP 20P、Toyopearl HW-40F、Toyopearl Butyl-650C等色譜柱層析分離純化，得到化合物6(0.6 g)。Fr.8經MCI gel CHP 20P、Sephadex LH-20、Diaion HP20SS等色譜柱層析分離純化，得到化合物5(72 mg)、7(62 mg)、8(78 mg)。

1.2.2 抑酶活性篩選

以1 mg/mL的L-多巴為底物，現(xiàn)配現(xiàn)用，將購買的蘑菇酪氨酸酶配制成酶活力為100 U/mL的酶溶液備用，以曲酸為陽性對照。在酶反應組和空白組分別加入25 μL不同濃度的樣品和磷酸緩沖液，加入25 μL酪氨酸酶在37 ℃孵育5 min后再加入100 μL 1 mg/mL的L-多巴溶液，在37 ℃保溫箱反應5 min后，在波長475 nm下測定吸光度，反應組對照和空白對照以失活酶代替活性酶[4,5]。按照下述公式計算酶活抑制率，酪氨酸酶抑制率=[1-(A反應組-A反應對照)/(A空白組-A空白對照)]×100%。重復上述實驗3次。

2 結果與討論

2.1 結構鑒定

化合物1白色針狀結晶;1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：7.45(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2)，7.38(1H，dd，J= 8.3，2.0 Hz，H-6)，6.85(1H，d，J= 8.3 Hz，H-5)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：115.5(C-5)，117.3(C-2)，122.8(C-1)，123.3(C-6)，145.5 (C-3)，150.7(C-4)，168.6(-COOH)。上述波譜數(shù)據與文獻[6]報道一致，故鑒定化合物1為原兒茶酸。

化合物2淡黃色粉末;1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：7.14(2H，s，H-2′′，6′′)，6.91(2H，d，J= 8.9 Hz，H-2，6)，6.66(2H，d，J= 8.9 Hz，H-3，5)，4.78(1H，d，J= 7.7 Hz，H-1′)，4.57(1H，dd，J= 11.8，2.0 Hz，H-6a′)，4.33(1H，dd，J= 11.8，6.9 Hz，H-6b′)，3.75～3.78(1H，m，H-5′)，3.45～3.57(3H，m，H-2′，3′，4′)；13C NMR (125 MHz，(CD3)2CO)δ：64.6(C-6)，71.0(C-4)，74.2(C-2)，74.7(C-5)，77.2(C-3′)，102.9(C-1)，109.9(C-2′′，6′′)，116.3(C-2′，6′)，118.8(C-3′，5′)，121.1(C-1′′)，139.0(C-4′′)，145.9(C-3′′，5′′)，151.6(C-1′)，153.2(C-4′)，167.2(C-7′′)。上述波譜數(shù)據與文獻[7]報道一致，故鑒定化合物2為6-O-沒食子?；芄?。

化合物3白色粉末;1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：7.13(2H，s，H-2′′，6′′)，6.67(1H，d，J= 8.2 Hz，H-5)，6.66(1H，d，J= 2.9 Hz，H-2)，6.57(1H，dd，J= 8.2，2.9 Hz，H-6)，4.81(1H，d，J= 7.8 Hz，H-1′)，4.59(1H，dd，J= 11.9，2.0 Hz，H-6a′)，4.35(1H，dd，J= 11.9，6.6 Hz，H-6b′)，3.70(3H，s，-OCH3)，3.77～3.80(1H，m，H-5′)，3.45～3.58(3H，m，H-2′，3′，4′)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：56.2(-OCH3)，64.6(C-6′)，71.0(C-4′)，74.3(C-2′)，74.8(C-5′)，77.3(C-3′)，103.0(C-2)，103.4(C-1′)，109.4(C-6)，109.8(C-2′′，6′′)，115.7(C-5)，121.2(C-1′′)，139.0(C-4′′)，142.5(C-4)，146.0(C-3′′，5′′)，148.5(C-3)，152.0(C-1)，167.2(C-7′′)。上述波譜數(shù)據與參考文獻[8]報道一致，故鑒定化合物3為3-甲氧基-4-羥基苯酚 1-O-β-D-(6′-O-沒食子酰基)吡喃葡萄糖苷。

化合物4白色粉末;1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.49(1H，s，H-5)，6.99(1H，s，H-6′′)，6.94(1H，s，H-5′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：106.7(C-6′′)，108.2(C-6)，108.4(C-6′)，108.6(C-1′′)，110.5(C-1)，112.1(C-1′)，114.0(C-5)，114.8(C-5′)，135.3(C-4′′)，136.3(C-2′)，136.7(C-2)，139.2(C-2′′)，139.6(C-3′′)，139.7(C-3)，141.1(C-3′)，143.0(C-5′′)，148.7(C-4′)，149.6(C-4)，159.2(C-7′)，159.3(C-7)，166.0(C-7′′)。上述波譜數(shù)據與參考文獻[9]報道一致，故鑒定化合物4為瓦隆酸雙內酯。

化合物5淡黃色粉末;1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：7.16，7.10，7.06，7.01，6.99(each 2H，s，galloyl-H-2，6)，6.31(1H，d，J= 8.3 Hz，H-1)，6.03(1H，t，J= 9.7 Hz，H-3)，5.68(1H，t，J= 9.7 Hz，H-4)，5.64(1H，dd，J= 9.7，8.3 Hz，H-2)，4.55～4.61(2H，m，H-5，6a)，4.33(1H，dd，J= 12.7，5.0 Hz，H-6b)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：62.9(C-6)，69.4(C-4)，71.7(C-2)，73.3(C-5)，73.9(C-3)，93.3(C-1)，109.9，110.0，110.0，110.1，110.2(C-2′，6′)，119.5，120.0，120.1，120.2，121.0(C-1′)，139.1，139.3，139.4，139.5，139.9(C-4′)，145.9，145.9，146.0，146.0，146.1(C-3′，5′)，165.2，166.0，166.1，166.3，166.6(C-7′)。上述波譜數(shù)據與參考文獻[10]報道一致，故鑒定化合物5為1,2,3,4,6-五-O-沒食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖。

化合物6淡棕色粉末;1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：6.69，6.68，6.62，6.61，6.58，6.53，6.35，6.34(s，HHDP H-3，3′)，5.50～5.46(2H，m，α-glu-H-1，α-glu-H-3)，5.34～5.22 (3H，m，α-glu-H-6a，β-glu-H-3，β-glu-H-6a)，5.12～5.06(4H，m，α-glu-H-2，α-glu-H-4，β-glu-H-1，β-glu-H-4)，4.86(1H，dd，J= 9.0，8.3 Hz，β-glu-H-2)，4.62(1H，ddd，J= 9.8，6.9，1.5 Hz，α-glu-H-5)，4.23(1H，ddd，J= 9.7，6.7，0.9 Hz，β-glu-H-5)，3.86(1H，dd，J= 13.4，1.0 Hz，β-glu-H-6b)，3.79(1H，dd，J= 12.9，1.5 Hz，α-glu-H-6b)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：63.5(α-glu-C-6)，63.5(β-glu-C-6)，67.3(α-glu-C-5)，69.5(β-glu-C-4)，69.8(α-glu-C-4)，72.3(β-glu-C-5)，75.5(α-glu-C-2)，75.7(α-glu-C-3)，77.5(β-glu-C-3)，78.3(β-glu-C-2)，91.7(α-glu-C-1)，95.3(β-glu-C-1)，107.2，107.3，107.4，107.5，107.6，107.7，108.2，108.3(HHDP-C-3，3′)，114.0，114.1，114.8，114.9，115.6，115.7，115.8，115.9(HHDP-C-1，1′)，125.9，125.9，126.4，126.4，126.5，126.5，126.5，126.7(HHDP-C-2，2′)，136.0，136.1，136.3，136.4，136.4，136.5，136.5，136.5(HHDP-C-5，5′)，144.1，144.2，144.3，144.4，144.4，144.4，144.5，144.5(HHDP-C-6，6′)，145.0，145.0，145.1，145.1，145.1，145.2，145.2，145.2(HHDP-C-4，4′)，167.7，167.8，168.1，168.2，168.8，168.9，169.3，169.3(HHDP-C-7，7′)。上述波譜數(shù)據與參考文獻[11]報道一致，故鑒定化合物6為長梗馬兜鈴素。

化合物7深褐色粉末;1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：7.17(2H，s，galloyl-2，6)，6.66，6.55，6.46，6.36(each 1H，s，HHDP-3′，3′′，3′′′，3′′′′)，6.20(1H，d，J= 8.5 Hz，H-1)，5.43(1H，dd，J= 10.2，8.5 Hz，H-2)，5.33(1H，dd，J= 13.3，6.6 Hz，H-6a)，5.17(1H，t，J= 9.2 Hz，H-3)，5.14(1H，t，J= 9.2 Hz，H-4)，4.48(1H，dd，J= 9.8，6.6 Hz，H-5)，3.86(1H，d，J= 13.3 Hz，H-6b)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：63.0(C-6)，69.1(C-4)，73.4(C-5)，76.0(C-2)，77.2(C-3)，92.2(C-1)，107.1，107.2，107.5，108.1(HHDP C-1′，1′′，1′′′，1′′′′)，110.3(galloyl C-2，6)，114.4，115.0，115.8，116.1(HHDP C-3′，3′′，3′′′，3′′′′)，119.6(galloyl C-1)，125.6，125.9，126.2，126.2(HHDP C-2′，2′′，2′′′，2′′′′)，136.2，136.4，136.5，136.6(HHDP C-5′，5′′，5′′′，5′′′′)，140.0(galloyl C-4′)，144.4，144.5，144.5，145.1，145.1，145.1，145.3(HHDP C-4′，4′′，4′′′，4′′′′，6′，6′′，6′′′，6′′′′)，146.3(galloyl C-3，5)，165.1(galloyl C-7)，168.0，168.2，168.7，169.4(HHDP C-7′，7′′，7′′′，7′′′′)。上述波譜數(shù)據與參考文獻[12]報道一致，故鑒定化合物7為木麻黃鞣亭。

化合物8淺棕色粉末;1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：7.12(1H，s，α-valoneyl-H-6′′)，7.12(1H，β-valoneyl-H-6′′)，6.60(1H，s，α-valoneyl-H-3)，6.59(1H，s，β-valoneyl-H-3)，6.55(1H，s，α-HHDP-H-3)，6.50 (1H，s，β-HHDP-H-3)，6.35(1H，s，α-HHDP-H-3′)，6.34(1H，s，β-HHDP-H-3′)，6.24(1H，s，α-valoneyl-H-3′)，6.22(1H，s，β-valoneyl-H-3′)，5.42(1H，t，J= 9.7 Hz，α-H-3)，5.35(1H，d，J= 3.6 Hz，α-H-1)，5.21～5.12(3H，m，α-H-6a，β-H-3，β-H-6a)，5.03～4.92(4H，m，α-H-2，α-H-4，β-H-1，β-H-4)，4.79(1H，dd，J= 9.0，8.3 Hz，β-H-2)，4.55～4.50(1H，m，α-H-5)，4.14(1H，dd，J= 8.9，6.9 Hz，β-H-5)，3.72(1H，d，J= 12.8 Hz，β-H-6b)，3.66(1H，d，J= 2.7 Hz，α-H-6b)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：63.5(α-C-6)，63.6(β-C-6)，67.2 (α-C-5)，69.6(β-C-4)，69.9(α-C-4)，72.2(β-C-5)，75.5(α-C-2)，75.7(α-C-3)，77.5(β-C-3)，78.2(β-C-2)，91.5(α-C-1)，95.2(β-C-1)，105.4，105.5(α-valoneyl-C-3′，β-valoneyl-C-3′)，107.1，107.3，107.3，107.4，107.5，107.6(α-valoneyl-C-3，β-valoneyl-C-3，α-HHDP-C-3，β-HHDP-C-3，α-HHDP-C-3′，β-HHDP-C-3′)，109.8，109.9(α-valoneyl-C-6′′，β-valoneyl-C-6′′)，114.3，114.4(α-HHDP-C-1′，β-HHDP-C-1′)，114.8，114.9(α-HHDP-C-1，β-HHDP-C-1)，115.4，115.4(α-valoneyl-C-1′′，β-valoneyl-C-1′′)，116.0，116.1(α-valoneyl-C-1，β-valoneyl-C-1)，117.7，117.7(α-valoneyl-C-1′，β-valoneyl-C-1′)，125.5，125.5，125.9，126.0(α-valoneyl-C-2，β-valoneyl-C-2，α-valoneyl-C-2′，β-valoneyl-C-2′)，126.4，126.4，126.5，126.6(α-HHDP-C-2，β-HHDP-C-2，α-HHDP-C-2′，β-HHDP-C-2′)，136.1，136.1(α-HHDP-C-5′，β-HHDP-C-5′)，136.4，136.5(α-HHDP-C-5，β-HHDP-C-5)，136.6，136.7(α-valoneyl-C-5，β-valoneyl-C-5)，137.0，137.0(α-valoneyl-C-5′，β-valoneyl-C-5′)，137.1，137.2(α-valoneyl-C-2′′，β-valoneyl-C-2′′)，139.9，140.0(α-valoneyl-C-4′′，β-valoneyl-C-4′′)，140.1，141.1(α-valoneyl-C-3′′，β-valoneyl-C-3′′)，143.2，143.2(α-valoneyl-C-5′′，β-valoneyl-C-5′′)，144.3，144.3，144.7，144.7(α-HHDP-C-6，β-HHDP-C-6，α-HHDP-C-6′，β-HHDP-C-6′)，149.9，149.9(α-valoneyl-C-6′，β-valoneyl-C-6′)，145.0，145.0，145.1，145.2(α-valoneyl-C-6，β-valoneyl-C-6，α-HHDP-C-4，β-HHDP-C-4，α-HHDP-C-4′，β-HHDP-C-4′)，145.3(α-valoneyl-C-4，β-valoneyl-C-4)，147.0，147.1(α-valoneyl-C-4′，β-valoneyl-C-4′)，166.9，167.0(α-valoneyl-C-7′′，β-valoneyl-C-7′′)，168.1，168.1，168.1，168.2(α-valoneyl-C-7，β-valoneyl-C-7，α-valoneyl-C-7′，β-valoneyl-C-7′)，169.0，169.1(α-HHDP-C-β-7，β-HHDP-C-7)，169.5，169.5(α-HHDP-C-β-7′，β-HHDP-C-7′)。上述波譜數(shù)據與參考文獻[13]報道一致，故鑒定化合物8為praecoxin A。

化合物9白色粉末;1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：6.74(1H，s，H-III-6)，5.63(1H，d，J= 4.7 Hz，H-1)，5.18(1H，m，H-5)，5.14(1H，dd，J= 4.7，1.4 Hz，H-2)，4.97(1H，dd，J= 6.9，1.4 Hz，H-3)，4.04(1H，t，J= 6.9 Hz，H-4)，3.91(1H，dd，J= 12.2，3.6 Hz，H-6)，3.84(1H，dd，J= 12.2，5.7 Hz，H-6)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：62.8(C-6)，68.2(C-3)，68.8(C-1)，69.9(C-4)，72.9(C-5)，74.4(C-2)，109.0(C-III-2)，112.9(C-II-2)，114.1(C-I-6)，114.4(C-III-6)，115.2(C-II-6)，116.3(C-I-2)，123.1(C-I-1)，126.8(C-III-1)，128.6(C-II-1)，132.1(C-II-4)，136.1(C-III-4)，137.3(C-I-4)，143.7(C-I-3)，143.9(C-I-5)，144.1(C-III-5)，144.5(C-II-5)，145.4(C-II-3)，146.9(C-III-3)，163.9(C-I-7)，166.0(C-II-7)，167.1(C-III-7)。上述波譜數(shù)據與參考文獻[14]報道一致，故鑒定化合物9為栗木素。

化合物10白色粉末;1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：6.76(1H，s，H-III-6)，5.35(1H，t，J= 1.6 Hz，H-2)，5.15(1H，m，H-5)，4.65(1H，d，J= 2.1 Hz，H-1)，4.36(1H，dd，J= 6.9，1.6 Hz，H-3)，3.95(1H，t，J= 6.9 Hz，H-4)，3.90(1H，dd，J= 12.4，3.4 Hz，H-6)，3.82(1H，dd，J= 12.4，6.3 Hz，H-6)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：62.1(C-6)，65.6(C-3)，69.2(C-1)，71.1(C-4)，74.3(C-5)，76.5(C-2)，108.7(C-III-2)，113.4(C-II-2)，114.0(C-I-6)，114.8(C-III-6)，116.0(C-II-6)，117.6(C-I-2)，125.0(C-I-1)，126.2(C-III-1)，128.3(C-II-1)，135.0(C-II-4)，136.0(C-III-4)，137.3(C-I-4)，143.8(C-I-3)，144.1(C-I-5)，144.4(C-III-5)，144.5(C-II-5)，145.4(C-II-3)，147.2(C-III-3)，165.9(C-I-7)，166.2(C-II-7)，168.0(C-III-7)。上述波譜數(shù)據與參考文獻[15]報道一致，故鑒定化合物10為櫟木素。

化合物11白色粉末;1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.81，6.71，6.61(each 1H，s，arom.-H)，5.64(1H，dd，J= 7.6，1.2 Hz，H-5)，5.27～5.25(1H，m，H-1)，5.19(1H，t，J= 7.2 Hz，H-4)，5.04(1H，dd，J= 13.0，2.6 Hz，H-6a)，4.78(1H，d，J= 2.1 Hz，H-2)，4.56(1H，dd，J= 7.0，1.1 Hz，H-3)，4.04(1H，d，J= 12.8 Hz，H-6b)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：66.0(C-6)，69.0(C-3)，70.1(C-4)，71.9(C-5)，73.8(C-2)，78.7(C-1)，108.1(C-V-2)，108.7(C-III-2)，109.5(C-IV-2)，114.1(C-II-2)，115.2(C-I-6)，115.4(C-III-6)，116.2(C-II-6)，116.8(C-IV-6)，116.8(C-V-6)，117.7(C-I-2)，124.9(C-I-1)，125.2(C-III-1)，125.3(C-II-1)，126.9(C-IV-1)，128.1(C-V-1)，136.1(C-II-4)，137.1(C-III-4)，137.7(C-IV-4)，137.9(C-V-4)，138.9(C-I-4)，144.7(C-I-3)，144.9(C-I-5)，144.9(C-III-5)，145.1(C-II-5)，145.2(C-IV-5)，146.1(C-II-3)，146.1(C-III-3)，146.1(C-IV-3)，146.2(C-V-3)，148.8(C-V-5)，166.1(C-I-7)，166.5(C-II-7)，167.4(C-III-7)，168.1(C-IV-7)，170.4(C-V-7)。上述波譜數(shù)據與參考文獻[16]報道一致，故鑒定化合物11為chinquapinic acid。

化合物12白色粉末;1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.78，6.65，6.59(each 1H，s，arom.-H)，5.60(1H，m，H-5)，5.25(1H，br s，H-2)，5.17(1H，t，J= 7.2 Hz，H-4)，4.95(1H，d，J= 12.9，2.8 Hz，H-6b)，4.57(1H，d，J= 2.1 Hz，H-1)，4.54(1H，d，J= 7.9，2.0 Hz，H-3)，4.03(1H，d，J= 12.9 Hz，H-6a)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：66.0(C-1)，66.0(C-6)，68.8(C-3)，70.3(C-4)，71.7(C-5)，78.6(C-2)，107.9(C-V-2)，108.7(C-III-2)，109.4(C-IV-2)，113.9(C-II-2)，115.1(C-I-6)，115.4(C-III-6)，115.5(C-II-6)，115.8(C-IV-6)，116.9(C-V-6)，117.6(C-I-2)，124.4(C-I-1)，124.7(C-III-1)，125.1(C-II-1)，126.8(C-IV-1)，127.9(C-V-1)，136.0(C-II-4)，136.9(C-III-4)，137.5(C-IV-4)，138.1(C-V-4)，138.6(C-I-4)，144.6(C-I-3)，144.9(C-I-5)，144.9(C-III-5)，145.1(C-II-5)，145.2(C-IV-5)，145.2(C-II-3)，145.3(C-III-3)，146.0(C-IV-3)，146.1(C-V-3)，148.8(C-V-5)，165.9(C-I-7)，166.5(C-II-7)，167.4(C-III-7)，168.0(C-IV-7)，170.4(C-V-7)。上述波譜數(shù)據與參考文獻[16]報道一致，故鑒定化合物12為櫟木鞣花素。

化合物13白色粉末;1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.80，6.71，6.60(各1H，s，arom.-H)，5.62(1H，d，J= 4.6 Hz，H-1)，5.37(1H，d，J= 7.5，1.6 Hz，H-5)，5.17(1H，t，J= 7.5 Hz，H-4)，5.03(1H，d，J= 12.7，2.2 Hz，H-6b)，5.00(1H，d，J= 7.0，2.2 Hz，H-3)，4.97(1H，br s，H-2)，4.03(1H，d，J= 12.9 Hz，H-6a)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：65.9(C-6)，68.9(C-3)，70.0(C-1)，71.8(C-4)，73.6(C-5)，75.6(C-2)，108.0(C-V-2)，108.7(C-III-2)，109.5(C-IV-2)，113.9(C-II-2)，115.0(C-I-6)，115.3(C-III-6)，115.6(C-II-6)，116.1(C-IV-6)，116.7(C-V-6)，117.6(C-I-2)，124.4(C-I-1)，124.8(C-III-1)，125.2(C-II-1)，126.8(C-IV-1)，128.0(C-V-1)，136.0(C-II-4)，137.0(C-III-4)，137.6(C-IV-4)，137.9(C-V-4)，138.8(C-I-4)，144.4(C-I-3)，144.8(C-I-5)，144.8(C-III-5)，144.9(C-II-5)，145.0(C-IV-5)，145.2(C-II-3)，145.3(C-III-3)，146.0(C-IV-3)，146.0(C-V-3)，148.3(C-V-5)，166.1 (C-I-7)，166.6(C-II-7)，167.4(C-III-7)，168.1(C-IV-7)，170.4(C-V-7)。上述波譜數(shù)據與參考文獻[17]報道一致，故鑒定化合物13為栗木鞣花素。

化合物14白色粉末;1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.33，6.73，6.67，6.57(各 1H，s，arom.-H)，5.63(1H，d，J= 7.9 Hz，H-5)，5.32(1H，s，H-1)，5.30(1H，d，J= 7.9 Hz，H-4)，5.26(1H，br s，H-2)，5.01(1H，d，J= 7.9 Hz，H-3)，4.73(1H，dd，J= 12.5，1.8 Hz，H-6a)，3.98(1H，d，J= 12.5 Hz，H-6b)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：41.2(C-1)，66.0(C-6)，69.8(C-4)，71.2(C-5)，72.7(C-3)，78.4(C-2)，107.1，108.7，110.1，110.1，111.7，112.8，113.6，114.2，114.4，115.0，116.5，117.0(HHDP，TP-C-2，6)，121.1，125.2，125.8，126.2，127.6，128.4(HHDP，TP-C-1)，135.4，135.6，136.4，136.8，136.8，137.6(HHDP，TP-C-4)，143.2，143.3，144.1，144.2，144.3，144.6，144.7，144.8，145.1，145.4，145.6，147.2(HHDP，TP-C-3，5)，165.7，166.5，166.7，166.9，169.1，170.1(HHDP，TP-C-7)。上述波譜數(shù)據與參考文獻[18]報道一致，故鑒定化合物14為castacrenin D。

化合物15黃色針狀結晶;1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：8.09(2H，d，J= 9.0 Hz，H-2′，6′)，6.97(2H，d，J= 9.0 Hz，H-3′，5′)，6.50(1H，d，J= 2.1 Hz，H-8)，6.23(1H，d，J= 2.1 Hz，H-6)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：94.4(C-8)，99.0(C-6)，103.8(C-10)，116.2(C-3′，5′)，122.9(C-1′)，130.3(C-2′，6′)，136.4(C-3)，147.2(C-2)，157.6(C-9)，160.2(C-4′)，161.7(C-5)，165.1(C-7)，176.5(C-4)。上述波譜數(shù)據與參考文獻[19]報道一致，故鑒定化合物15為山奈酚。

化合物16黃色針狀結晶;1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.64(1H，dd，J= 8.6，2.2 Hz，H-6′)，7.62(1H，d，J= 2.2 Hz，H-2′)，6.85(1H，d，J= 8.6 Hz，H-5′)，6.38(1H，d，J= 2.0 Hz，H-8)，6.19(1H，d，J= 2.0 Hz，H-6)，5.34(1H，d，J= 7.7 Hz，H-1′′)，3.76(1H，d，J= 9.7 Hz，H-6′′a)，3.59(1H，t，J= 9.7 Hz，H-6′′b)，3.56～3.48(4H，m，H-2′′，3′′，4′′，5′′)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：72.8(C-4′′)，75.4(C-2′′)，77.0(C-3′′)，77.6(C-5′′)，94.8(C-8)，100.0(C-6)，104.2(C-1′′)，105.6(C-10)，116.0(C-2′)，117.3(C-5′)，122.8(C-6′)，123.5(C-1′)，135.4(C-3)，145.9(C-4′)，150.0(C-3′)，158.4(C-2)，159.0(C-9)，162.9(C-5)，165.9(C-7)，179.2(C-4)。上述波譜數(shù)據與參考文獻[20]報道一致，故鑒定化合物16為異槲皮素。

化合物17白色粉末;1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.77(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5′)，6.66(1H，s，H-5)，6.64(1H，d，J= 1.9 Hz，H-2′)，6.59(1H，dd，J= 8.0，1.9 Hz，H-6′)，6.18(1H，s，H-8)，4.52(1H，d，J= 1.5 Hz，H-1′′)，3.88～3.84(2H，m，H-1，2′′)，3.82(1H，d，J= 2.6 Hz，Hb-2α)，3.80(3H，s，-OCH3)，3.77(3H，s，-OCH3)，3.74(1H，dd，J= 10.9，3.6 Hz，Hb-3α)，3.68～3.60(2H，m，Ha-3α，3′′)，3.54～3.49(1H，m，H-5′′)，3.36～3.33(1H，m，H-4′′)，3.11(1H，dd，J= 9.8，3.7 Hz，Ha-2α)，2.85～2.81(1H，m，H-4)，2.07～1.98(1H，m，H-3)，1.90～1.83(1H，m，H-2)，1.19(1H，d，J= 6.2 Hz，H-6′′)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：17.9(C-6′′)，33.6(C-4)，40.1(C-3)，45.5(C-1)，48.3(C-2)，56.5(2C，-OCH3)，65.4(C-2α)，68.1(C-3α)，70.1(C-5′′)，72.3(C-2′′)，72.5(C-3′′)，73.9(C-4′′)，102.2(C-1′′)，112.6(C-5)，113.6(C-2′)，116.1(C-5′)，117.2(C-8)，123.2(C-6′)，129.0(C-10)，134.0 (C-1′)，138.1(C-9)，145.2(C-4′)，146.1(C-7)，147.3(C-3′)，149.2(C-6)。上述波譜數(shù)據與參考文獻[21]報道一致，故鑒定化合物17為aviculin。

2.2 抑酶活性篩選結果

按照“1.2.2”所述標準方法平行測定3次取平均值，實驗結果顯示陽性藥曲酸的IC50為0.077 mg/mL，化合物14的IC50為0.034 mg/mL，顯示較強的抑酶活性，其他化合物的活性較弱。實驗結果如下表所示。

表1 不同化合物抑制酪氨酸酶活性的IC50值Table 1 IC50 values of different compounds inhibitingtyrosinase activity

3 結論

從瓦山錐葉子80%乙醇提取物中分離得到17個化合物，主要為含有多個獨特多元酚結構的單寧類化合物，根據現(xiàn)有文獻可知主要發(fā)現(xiàn)于錐屬植物。多數(shù)錐屬植物中含有三萜鞣花單寧類化合物可能與該屬植物的生境和次生代謝途徑有關。瓦山錐葉子80%乙醇提取物的液相色譜檢測顯示含有結構新穎的三萜鞣花單寧類化合物，但是在系統(tǒng)的分離純化過程中并未得到，可能在分離過程中此類化合物未得到有效富集，分離純化的手段需要進一步完善。目前關于結構新穎的三萜鞣花單寧類化合物的生物活性研究報道較少，僅在抗癌、抗氧化、降脂等方面有初步研究。本論文沒有從瓦山錐葉子80%乙醇提取物中分離得到新穎的三萜鞣花單寧類化合物，但是得到大量含有獨特多元酚結構的化合物，根據構效關系篩選了其中9個含有多個獨特多元酚結構的特征化合物的酪氨酸酶的抑制活性，結果顯示化合物14具有較陽性藥更強的抑酶活性，這可能與該化合物中含有更多酚羥基有關。單寧類化合物生物活性豐富，此特殊單寧類化合物的生物活性及作用機理需要進一步挖掘和研究。

致謝：衷心感謝廣西植物研究所黃永林老師的指導，感謝桂林醫(yī)學院李思雯同學的幫助，感謝廣西植物研究所各位同事的幫助。本論文的順利完成是大家共同努力的成果。