生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量評(píng)價(jià)及其指紋圖譜的建立*

楊巧虹，陳萍

(1.重慶醫(yī)療器械質(zhì)量檢驗(yàn)中心，重慶 401147；2.陜西省中醫(yī)藥研究院，西安 710003)

生地黃為玄參科植物地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)的干燥塊根，味甘，性寒，歸心、肝、腎經(jīng)，具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津的功效[1]。地黃分布廣泛，主產(chǎn)于河南、山西、河北、山東等地，為四大懷藥之一[2]。生地黃主要含有苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜苷類、糖類、氨基酸類等化合物[3]。藥理研究表明，生地黃具有止血、強(qiáng)心、降血糖、抗炎、提高免疫力、利尿、保肝等作用[4-5]，臨床常用于治療腎陰不足、瘀血阻滯而引起的各種出血癥[6]。

標(biāo)準(zhǔn)湯劑作為一種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)體系，既有投料飲片的代表性，又有傳統(tǒng)制法和制備工藝的一致性，還有臨床療效和質(zhì)量的穩(wěn)定性，為衡量中藥配方顆粒是否與臨床湯劑基本一致的參照物的標(biāo)準(zhǔn)[7]。關(guān)于生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及指紋圖譜研究筆者尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。筆者在本研究中收集到合格的生地黃飲片15批作為原料，依據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》[8]，制備生地黃飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑，對其中苯乙醇苷類成分進(jìn)行含量測定，并建立特征圖譜，為生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑作為衡量配方顆粒與臨床湯劑的一致性提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；CP2102型百分之一天平(奧豪斯儀器<常州>有限公司)；SQP型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器<北京>有限公司，感量：0.01 mg)；ZDHW型調(diào)溫電熱套(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(北京科偉永興儀器有限公司)；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；FZG-1400真空干燥箱(陜西昌泰實(shí)業(yè)有限公司)；Synergy型超純水制水機(jī)(默瑞<上海>生物科技有限公司)。

1.2試劑與試藥

1.2.1試劑 乙腈(OCEANOAK公司，批號(hào)：30281-27409，色譜級(jí))；磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20170110，色譜級(jí))；甲醇(天津市天力化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20200608，分析純)；水為自制超純水。

1.2.2試藥 毛蕊花糖苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：1530-200202，含量>98.0%)；焦地黃苯乙醇苷A1對照品(批號(hào)：P16M11S109726，含量>95.0%)、焦地黃苯乙醇苷B1對照品(批號(hào)：P16M11S109727，含量>97.0%)、異毛蕊花糖苷對照品(批號(hào)：W17J10C90785，含量>98.0%)，均購于上海源葉生物科技有限公司。18批生地黃飲片，經(jīng)陜西省中醫(yī)藥研究院楊智峰研究員鑒定為玄參科植物地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)的干燥塊根，見表1。

表1 生地黃飲片來源信息表

2 方法與結(jié)果

2.1生地黃飲片質(zhì)量考察 依據(jù)《中華人民共和國藥典》(2015年版一部)生地黃飲片項(xiàng)下的性狀、鑒別(顯微鑒別、薄層色譜鑒別)、檢查(水分、總灰分、酸不溶性灰分)、浸出物及含量測定檢查方法，對18批生地黃飲片進(jìn)行質(zhì)量考察，結(jié)果15批飲片的性狀、鑒別、檢查、浸出物、含量測定結(jié)果均符合2015年版《中華人民共和國藥典》要求，15批樣品均檢出地黃顯微特征。結(jié)果見圖1—圖3與表2。

1.木栓細(xì)胞；2.分泌細(xì)胞；3.薄壁細(xì)胞；4.核狀物；5.導(dǎo)管；6.草酸鈣方晶。

1.毛蕊花糖苷；2.生地黃對照藥材；3～17.1～15號(hào)生地黃藥材；18.生地黃對照藥材；19.毛蕊花糖苷。

1.梓醇；2.生地黃對照藥材；3-10.1-8號(hào)生地黃藥材；11.梓醇；12.生地黃對照藥材；13-19.9-15號(hào)生地黃藥材。

2.2生地黃飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備 依據(jù)國家中醫(yī)藥管理局《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》原則，稱取15批質(zhì)量合格的生地黃飲片各50 g，分別加8倍量的水，浸泡1 h，加熱回流提取0.5 h，趁熱濾過，分離出煎煮液后，藥渣加8倍量的水回流提取0.5 h，趁熱過濾，合并濾液，減壓濃縮至250 mL，即得1～15號(hào)生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑，備用。

2.3生地黃飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑薄層色譜鑒別 取生地黃飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑5 mL，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次10 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取毛蕊花糖苷對照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。取水5 mL，按照供試品溶液制備方法制備成陰性對照溶液。吸取上述供試品溶液、陰性對照溶液各5 μL、對照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸(16：0.5：2)為展開劑，展開，取出，晾干，用0.1%的2，2-二苯基-1-苦肼基無水乙醇溶液浸板，晾干。供試品色譜在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。結(jié)果見圖4。

1.毛蕊花糖苷；2-16.1-15號(hào)生地黃藥材；17.毛蕊花糖苷。

表2 15批生地黃飲片質(zhì)量考察結(jié)果

取生地黃飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑10 mL，加甲醇20 mL，超聲10 min，濾過，濾液濃縮至5 mL，作為供試品溶液。取梓醇對照品，加甲醇制成每毫升含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。取水10 mL，按照上述溶液制備方法制備成陰性對照溶液。吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(14：6：1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茴香醛試液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，見圖5。

1.梓醇；2-8.1-7號(hào)生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑；9.陰性；10-19.8-15號(hào)生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

2.4生地黃飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征成分含量測定[9-13]

2.4.1色譜條件 色譜柱：Diamonsil Plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫，洗脫程序見表3；流速：0.8 mL·min-1，檢測波長：334 nm，柱溫：25 ℃，進(jìn)樣量10 μL，理論板數(shù)按特征成分峰計(jì)算均不低于5 000。

表3 梯度洗脫程序

2.4.2溶液制備 對照品溶液：取適量的焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1及異毛蕊花糖苷對照品，精密稱定，加乙腈-0.1%磷酸溶液(16：84)制成每毫升分別含焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1及異毛蕊花糖苷95.00，108.80，53.00，45.36 μg的混合對照品溶液。

供試品溶液：精密量取1～15號(hào)生地黃飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑10 mL，置50 mL量瓶中，分別加甲醇30 mL，超聲10 min，用甲醇稀釋至50 mL，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，蒸干，殘?jiān)靡译?0.1%磷酸溶液(16：84)溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，用乙腈-0.1%磷酸溶液(16：84)稀釋至刻度，搖勻，濾過，續(xù)濾液即為供試品溶液。

陰性對照溶液：精密吸取水10 mL，按上述溶液制備方法制備，即得陰性對照溶液。

2.4.3專屬性實(shí)驗(yàn) 精密吸取陰性對照溶液、對照品溶液及供試品溶液各10 μL，采用“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1及異毛蕊花糖苷的保留時(shí)間分別為34.611，45.044，48.525，52.131 min，分離度均>1.5，理論板數(shù)均>6 000，拖尾因子為1.03～1.31。陰性對照溶液色譜在相同保留時(shí)間處無干擾峰出現(xiàn)，表明專屬性良好。見圖6。

1.焦地黃苯乙醇苷A1；2.毛蕊花糖苷；3.焦地黃苯乙醇苷B1；4.異毛蕊花糖苷。

2.4.4線性關(guān)系考察 精密量取混合對照品溶液0.02，0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60 mL，分別置1 mL量瓶中，用乙腈-0.1%磷酸溶液(16：84)稀釋至刻度，搖勻，制成系列混合對照品溶液，精密吸取10 μL，以“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，線性回歸分析，結(jié)果見表4。

表4 4種對照品的回歸方程及線性范圍

2.4.5精密度實(shí)驗(yàn) 取混合對照品溶液和同一批生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液(批號(hào)：20200101)，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果對照品溶液焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1及異毛蕊花糖苷峰面積的RSD為0.72%、0.56%、2.21%、3.47%，供試品溶液焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1及異毛蕊花糖苷峰面積的RSD為4.47%、0.56%、4.21%、3.46%，表明儀器的精密度良好。

2.4.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)：20200101)，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0，2，4，6，8，12，24，36 h時(shí)進(jìn)樣分析。結(jié)果焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1及異毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為3.95%、2.76%、4.63%及4.53%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)室溫下穩(wěn)定性良好。

2.4.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品(批號(hào)：20200101)10 mL，共6份，按“2.4.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1及異毛蕊花糖苷的平均含量分別為31.563 3，28.614 9，11.846 1，13.177 3 μg·mL-1，RSD值分別為4.08%、1.57%、4.57%及4.85%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.8加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的同一批生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑(批號(hào)：20200101)5 mL，共9份，每3份為一組，置50 mL量瓶中，分別精密加入焦地黃苯乙醇苷A1對照品溶液(156.75 μg·mL-1)0.5，1.0及1.5 mL、毛蕊花糖苷對照品溶液(244.80 μg·mL-1)0.3，0.6及0.9 mL，焦地黃苯乙醇苷B1對照品溶液(148.4 μg·mL-1)0.2，0.4及0.6 mL，異毛蕊花糖苷對照品溶液(164.43 μg·mL-1)0.2，0.4及0.6 mL，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算。結(jié)果見表5。

表5 4種對照品的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.9含量測定 取15批生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果見表6。

2.5生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率及轉(zhuǎn)移率測定

2.5.1出膏率計(jì)算 精密量取1～15號(hào)標(biāo)準(zhǔn)湯劑各20 mL，分別置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴鍋上蒸干，殘?jiān)?05 ℃干燥3 h，干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，計(jì)算出膏率。出膏率(%)=m1/20×V/m2×100% (m1為干膏質(zhì)量、V為樣品溶液總體積、m2為飲片質(zhì)量)。結(jié)果見表6。生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑15批出膏率為54.97%～62.78%，平均值為(58.49±2.83)%。

2.5.2苯乙醇苷類轉(zhuǎn)移率計(jì)算 轉(zhuǎn)移率(%)=標(biāo)準(zhǔn)湯劑中特征成分含量/飲片中特征成分含量×100%。結(jié)果見表6。15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑中苯乙醇苷類成分含量為0.034 9%～0.063 3%，平均值為(0.051±0.009)%，轉(zhuǎn)移率為58.17%～87.95%，平均(76.11±9.53)%。

表6 15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑指標(biāo)成分含量及出膏率、轉(zhuǎn)移率計(jì)算結(jié)果

2.6高效液相色譜特征指紋圖譜建立

2.6.1色譜條件 同“2.4.1”項(xiàng)下的色譜條件。

2.6.2溶液制備 采用“2.4.2”項(xiàng)下的混合對照品溶液和15批供試品溶液。

2.6.3方法學(xué)考察 精密度實(shí)驗(yàn)：取同一批生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液(批號(hào)：20200101)，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)6次。2號(hào)色譜峰(毛蕊花糖苷)在生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備過程中相對較穩(wěn)定、含量高、分離度好，故被選作參照峰。以毛蕊花糖苷為參照，計(jì)算，共有峰相對峰面積和相對保留時(shí)間的RSD均小于5% (n=6)，表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：精密吸取生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液(批號(hào)：20200101)適量，分別于0，2，4，8，12，16，24 h時(shí)，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。以毛蕊花糖苷為參照，計(jì)算，共有峰相對峰面積和相對保留時(shí)間的RSD均小于5%(n=7)，表明供試品溶液在室溫中24 h內(nèi)較為穩(wěn)定[11]。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：精密量取生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑適量，按“2.4.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法平行制備6份供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以毛蕊花糖苷為參照，計(jì)算，共有峰相對峰面積和相對保留時(shí)間的RSD均小于5%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.6.4指紋圖譜建立 取15批供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。經(jīng)分析，供試品溶液的液相色譜圖中2號(hào)峰毛蕊花糖苷峰面積最大且穩(wěn)定，分離度好，保留時(shí)間居中，易于辨認(rèn)，故選為本品指紋圖譜參照峰，見圖7。

1.焦地黃苯乙醇苷A1；2.毛蕊花糖苷；3.焦地黃苯乙醇苷B1；4.異毛蕊花糖苷。

將15批供試品溶液液相色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)》，參照圖譜設(shè)為S1，對照圖譜生成方法設(shè)為平均數(shù)，時(shí)間窗寬度設(shè)為0.10，多點(diǎn)校正，自動(dòng)匹配，生成對照圖譜，分別計(jì)算相似度[11]，并以2號(hào)毛蕊花糖苷為參照物，計(jì)算共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，見表7、表8。圖8為15批生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的特征指紋圖譜。由圖表可見，15批生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑與對照指紋圖譜相似度均>0.96(表9)。表明一致性良好。

表7 15批生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑共有峰相對保留時(shí)間

表8 15批生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑共有峰相對峰面積

表9 15批生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)表

圖8 生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑高效液相指紋圖譜

3 討論

3.1色譜條件的選擇 本實(shí)驗(yàn)對地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑中4個(gè)苯乙醇苷類成分進(jìn)行考察，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中對波長、流動(dòng)相進(jìn)行考察。波長選擇參考《中華人民共和國藥典》2015年一部地黃項(xiàng)下毛蕊花糖苷含量測定選用的檢測波長334 nm；比較乙腈-0.1%醋酸溶液與乙腈-0.1%磷酸溶液兩種流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)選擇乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)基線更平穩(wěn)，峰形較好，特征成分分離效果好。

3.2定性鑒別成分篩選 參照《中華人民共和國藥典》2015年一部和2020年一部中地黃藥材項(xiàng)下選用梓醇與毛蕊花糖苷兩個(gè)指標(biāo)成分作為薄層鑒別，且兩種指標(biāo)成分也作為含量測定，但地黃苷D成分未見相關(guān)研究用于薄層鑒別，故選用這兩種成分作為薄層鑒別指標(biāo)成分。

3.3特征成分篩選 由于毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷屬于同分異構(gòu)體，飲片在煎煮過程中毛蕊花糖苷可能會(huì)部分轉(zhuǎn)化為異毛蕊花糖苷[14-16]，實(shí)驗(yàn)以4種苯乙醇苷類(焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1和異毛蕊花糖苷)總量來表征提取物的含量，可以達(dá)到質(zhì)量均一性，生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑中焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1及異毛蕊花糖苷提取率高、轉(zhuǎn)移率穩(wěn)定，故采用4個(gè)成分共同作為質(zhì)量評(píng)價(jià)的定量特征成分。

3.4標(biāo)準(zhǔn)湯劑pH、密度的測量 實(shí)驗(yàn)測定了15批生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的pH值均為4.5、密度范圍為1.042～1.054，可以作為質(zhì)量控制的指標(biāo)之一。

3.5量值傳遞與質(zhì)量評(píng)價(jià) 經(jīng)過研究從投料飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量控制，再到標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜3個(gè)方面進(jìn)行研究，建立生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的苯乙醇苷類含量測定方法和特征指紋圖譜，實(shí)現(xiàn)對生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，15批生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的平均出膏率為(58.49±2.83)%，苯乙醇苷類成分平均含量為(0.051±0.009)%；按研究建立的15批生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑各參數(shù)均值的75%～125%計(jì)，其參數(shù)范圍確定為：出膏率43.86%～73.11%，苯乙醇苷類含量0.037%～0.063%，平均出膏率、苯乙醇苷類平均含量均在參數(shù)范圍內(nèi)，表明生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量均一性較好。