人卵丘細胞與壁顆粒細胞的差異性研究進展

高二夢，千日成

眾所周知，人體的卵泡發(fā)育是一個十分復雜的過程，以原始卵泡為起點，經(jīng)歷了初級卵泡、次級卵泡、三級卵泡，最終發(fā)育為成熟卵泡。顆粒細胞（granulosa cell，GC）是卵母細胞周圍的體細胞，與卵母細胞共處于同一卵泡微環(huán)境[1]。伴隨著卵泡的生長發(fā)育，卵母細胞周圍的GC同樣經(jīng)歷一系列的變化，從最初的單層扁平的前顆粒細胞轉(zhuǎn)變?yōu)閺蛯又鶢罴毎粮]前卵泡最終發(fā)育成為竇卵泡，卵泡周圍GC數(shù)目明顯增多，GC內(nèi)開始合成并分泌出黏多糖蛋白形成早期的竇腔[2]，至此，GC分化為在空間和功能上不同的2個種群——卵丘細胞（cumulus cell，CC）和壁顆粒細胞（mural granulosa cell，MGC）[3]。

許多學者認為CC與MGC是起源一致、位置不同的同一種細胞，然而從既往發(fā)表的文獻可以看出，已有關(guān)于CC和MGC在功能、基因和細胞譜系等方面的研究，這些研究提示CC與MGC不僅存在著解剖學上的差異，同樣存在著功能、基因等方面的差異。而到目前為止，人CC和MGC在代謝方面的差異尚少見報道。學者們認為，CC與MGC之間同樣存在著代謝譜的差異。探究CC與MGC之間的差異可能有助于評估卵子質(zhì)量、提高胚胎質(zhì)量以及改善妊娠結(jié)局，具有重要的臨床價值。

1 CC與MGC在概念和發(fā)育過程中的差異

卵泡的生長發(fā)育受卵泡刺激素（folliclestimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）、類固醇激素以及卵巢和卵母細胞來源的生長調(diào)節(jié)因子等共同調(diào)節(jié)。GC的增殖對卵泡生長至關(guān)重要，而GC誘導的黃體化則終止排卵前卵泡的生長[4]。

在卵巢中，GC是為卵母細胞生長提供物理支持和微環(huán)境的原發(fā)細胞類型，當卵母細胞進入生長發(fā)育后期，卵泡形成竇腔。從次級卵泡的發(fā)育直至形成卵泡竇腔，GC開始分化為MGC和CC[1]。CC圍繞在卵母細胞周圍，與卵母細胞直接接觸形成卵丘-卵母細胞復合物（cumulus-oocyte complex，COC），其數(shù)量與卵母細胞密切相關(guān)。人類卵母細胞周圍的CC數(shù)量一直被認為是植入潛力的標志。而MGC則分布在卵泡壁上，與卵泡壁相關(guān)，主要承擔類固醇生成功能[5]。CC的分化由卵母細胞分泌有效的生長因子（oocytes secrete effective growth factor，OSF）介導，而MGC的形成則受卵泡外、垂體前葉分泌的FSH調(diào)控，見圖1。MGC中LH受體（LH receptor，LHR）的mRNA表達是GC分化的一個關(guān)鍵標志物，與MGC相比，人CC表達的LHR水平顯著降低，但保留了CYP19A1和FSH受體（FSH receptor，F(xiàn)SHR）的表達[6]。卵母細胞通過分泌不穩(wěn)定的旁分泌信號因子抑制GC向MGC分化，但促進GC向CC分化，以此來調(diào)節(jié)控制其發(fā)育微環(huán)境[7]。

圖1 GC分化示意圖

1.1 CC的概念及發(fā)生發(fā)展CC是卵母細胞的支持細胞，在卵母細胞發(fā)育、成熟、排卵和受精過程中發(fā)揮著重要作用[8]。放射冠被認為是卵母細胞周圍的第一層CC，CC在靠近卵母細胞的內(nèi)層比外層更加緊湊，呈向心性膨脹[9]。CC直接接觸卵母細胞，胞質(zhì)突起穿越透明帶，與卵母細胞建立縫隙連接，形成COC[1]，該復合物直接影響基因表達和蛋白合成，通過縫隙連接、連接蛋白和旁分泌信號的雙向通信調(diào)控卵母細胞發(fā)育，實現(xiàn)卵丘和卵母細胞間的溝通，導致卵母細胞的分化、擴張和成熟等?？p隙連接由細胞膜間通道蛋白聚合體構(gòu)成，連接蛋白Cx43和Cx37是與之最密切相關(guān)的2個蛋白，該通道允許離子、小分子和小代謝物通過，但不允許蛋白質(zhì)、核酸等大分子通過。縫隙連接幫助CC為卵母細胞生長發(fā)育提供能量和營養(yǎng)，至發(fā)育晚期，縫隙連接通過調(diào)節(jié)通道的減少或關(guān)閉促進卵母細胞成熟[1，10]。

1.2 MGC的概念及發(fā)生發(fā)展MGC排列在卵泡內(nèi)壁上，與卵泡生長、分化、成熟以及后續(xù)的排卵和維持妊娠密切相關(guān)，主要執(zhí)行內(nèi)分泌功能，其通過分泌蛋白酶促進排卵，排卵后MGC會逐漸轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生孕酮的黃體細胞，參與隨后的一系列激素調(diào)節(jié)過程。在LH的作用下，MGC和卵泡膜內(nèi)層細胞分裂增生，細胞成多邊形，胞質(zhì)內(nèi)有黃色顆粒和脂滴，呈黃色，稱為黃體。顆粒黃體細胞（granulosa lutein cell）由卵泡GC轉(zhuǎn)變而成，位于黃體中央，細胞大，染色淡，主要分泌孕酮。卵泡膜黃體細胞（theca lutein cell）位于黃體周邊，表面不平坦，細胞小，染色深，主要合成雌激素。而CC則不像MGC那樣黃體化[11]。CC與MGC的相關(guān)差異見圖2。

圖2 CC和MGC的相關(guān)差異

2 CC與MGC在功能上的差異

2.1 CC的基本功能眾所周知，卵母細胞本身不能合成膽固醇，無法吸取葡萄糖代謝。初級卵泡時期，單層柱狀的GC為卵母細胞提供約85%的營養(yǎng)，至竇卵泡期，來源于未分化GC的CC分解膽固醇和葡萄糖，通過縫隙連接為卵母細胞提供必需的氨基酸和核苷酸等營養(yǎng)物質(zhì)，同樣的，卵母細胞也通過縫隙連接傳遞其分泌的信號分子，調(diào)控CC的增殖和膨脹，這是一種雙向的“對話”機制。在卵泡發(fā)育至竇卵泡后期，CC上大量FSHR合成，產(chǎn)生更多的雌激素，促使卵泡發(fā)育，優(yōu)勢卵泡形成，優(yōu)勢卵泡相較于其他群體對FSH更敏感，并產(chǎn)生較高水平的雌激素和調(diào)節(jié)激素抑制素[12]。卵母細胞在黃體中期LH峰的刺激下完成第一次減數(shù)分裂，并停滯于第二次減數(shù)分裂中期（Metaphase Ⅱ，MⅡ期），而CC與卵母細胞之間的物質(zhì)交換很可能是維持減數(shù)分裂停滯狀態(tài)的重要因素。

通過縫隙連接，CC 將環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）轉(zhuǎn)移到卵母細胞，參與抑制卵母細胞成熟。排卵前LH激增，CC與卵母細胞的溝通通道減少甚至關(guān)閉，受CC調(diào)控的cAMP進入卵母細胞減少，卵母細胞中抑制物cAMP水平下降，減數(shù)分裂恢復，卵母細胞成熟[13]。

在卵母細胞成熟過程中，CC表達透明質(zhì)酸合成酶2（hyaluronate synthase 2，HAS2），分泌富含透明質(zhì)酸的基質(zhì)。這種具有黏液彈性的細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）在CC之間積聚，使得CC彼此相互分離擴散，稱為卵丘擴張，這是卵母細胞成熟和排卵的關(guān)鍵步驟。擴張能力是CC分化的一個獨特特征，MGC并不具備[5]。

CC合成透明質(zhì)酸是由FSH誘導的，其機制可能與卵母細胞產(chǎn)生的可溶性因子密切相關(guān)。卵母細胞分泌的細胞因子通過CC呈放射狀擴散，建立了一個濃度梯度[14]。Nagyova等[9]研究發(fā)現(xiàn)，CC及接近COC的MGC中都有透明質(zhì)酸的合成，而外周MGC的最外層很少或沒有檢測到透明質(zhì)酸的活性，但造成這種差異的原因尚存在爭議。

2.2 MGC的基本功能CC的功能主要是為卵母細胞服務的，而MGC主要合成類固醇激素，并分泌FSHR和LHR等激素受體，其既是甾體激素的產(chǎn)生部位，也是促性腺激素的作用部位。類固醇激素生物合成的第一步和限速步驟發(fā)生在GC的線粒體中，而甾體生成過程主要為膽固醇通過各種甾體激素中間體轉(zhuǎn)化為孕酮、雄激素和雌二醇等[12]。MGC與卵母細胞之間被CC和充滿卵泡液的竇腔分開，其某些表型的表達不足使其難以支撐卵母細胞的發(fā)育，但可產(chǎn)生甾體激素和生長因子并分泌到濾泡液中，對卵泡的生長發(fā)育及排卵發(fā)揮重要作用[15]。

FSH可刺激GC將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，低水平的LH可維持卵泡的生長發(fā)育，而排卵則需要高水平的LH。FSH和LH的激增啟動排卵，卵泡的一系列激活導致MGC表皮生長因子的分泌，從而進一步促進卵母細胞減數(shù)分裂的恢復、卵丘擴張、類固醇生成和黃體化等，這些對受精、胚胎發(fā)育和成功植入十分重要[16]。CC同樣也可以分泌許多細胞因子和生長因子，這些可能在為卵母細胞提供營養(yǎng)中發(fā)揮重要作用，其和MGC對卵母細胞生長發(fā)育的作用是一種重疊控制和相互依存的關(guān)系[17]。

排卵需要內(nèi)分泌和旁分泌信號傳導途徑以及MGC（LHR+）和卵丘GC（LHR-）之間的相互作用，LH效應主要是針對MGC而不是CC，在人卵泡中，LHR/絨毛膜促性腺激素受體（chorionic gonadotropin receptor，CGR）主要在卵泡膜和MGC中表達，在CC中表達較低，在卵母細胞中則不表達[18]。因此，LH激增直接影響MGC，首先MGC對LH反應產(chǎn)生生長因子，并通過旁分泌信號傳導和縫隙連接間接影響卵母細胞和CC，由CC通過自分泌強化[19]。

排卵前LH 的激增導致MGC 內(nèi)cAMP 濃度的急劇上升，隨后，在cAMP 的誘導下，雙調(diào)蛋白（amphiregulin,AREG）、表皮調(diào)節(jié)素（epiregulin）和β-細胞素（betacellulin）等表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）樣肽短暫表達，它們是卵丘擴張、卵母細胞成熟和排卵的關(guān)鍵旁分泌介質(zhì)[13]。至卵泡發(fā)育后期，在LH作用下優(yōu)勢卵泡的黃體酮分泌增加，黃體酮是子宮內(nèi)膜準備和維持妊娠所必需的[19]。排卵前的LH含量也會決定卵泡內(nèi)類固醇的產(chǎn)量，從而影響妊娠周期中的胚胎植入能力[20]。CC和MGC的功能關(guān)系見圖3。

圖3 CC與MGC功能關(guān)系圖

3 CC與MGC在轉(zhuǎn)錄本與細胞譜系上的差異

現(xiàn)有研究已經(jīng)提示了CC與MGC存在著轉(zhuǎn)錄譜上的差異，與代謝和細胞增殖有關(guān)的轉(zhuǎn)錄本在CC中富集，而與細胞信號轉(zhuǎn)導和分化有關(guān)的轉(zhuǎn)錄本在MGC中富集[21]。Wigglesworth等[22]對MGC及CC的轉(zhuǎn)錄本進行了研究，發(fā)現(xiàn)CYP19A1、CYP11A1、Star、Twsg1、Nppc、Nrip1、Tob1、LHR和Grem1在MGC中的表達高于在CC中的表達，而Npr2、Ldha、Mvk、Eno1、Fdps、Slc38a3、Pfkp、Nog、Tpi1和Smad7則在CC中的表達更高。此外，Gr?ndahl等[23]在對排卵前CC和MGC相似性、差異性和相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，1 562個基因在CC和MGC中有2倍差異表達，1 406個基因有2～8倍差異性表達，156個基因有8倍差異表達。與MGC相比，CX40在CC中的表達比在MGC中高出16倍以上，CX43在CC中的表達略高（約是MGC中的1.6倍），CC和MGC的表達譜清楚地顯示其是具有分化功能的2個細胞群體。

3.1 CC的轉(zhuǎn)錄譜系特點與CC相比，MGC中LHR高表達，甾體生成能力強，MGC具有獨特的表觀遺傳特征，存在更多的年齡相關(guān)的甲基化差異區(qū)域（differential methylation regions，DMR），而且MGC表達的胎盤生長因子（placenta growth factor，PLGF）是靈長類動物排卵、卵泡血管生成和黃體化所必需的。由此可見，MGC在卵泡形成和與卵母細胞的相互作用中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[24]。LHR基因編碼一種糖蛋白受體，屬于G蛋白耦聯(lián)受體，LH與LHR結(jié)合激活相應蛋白，導致細胞內(nèi)cAMP水平增高和前列腺素合成增加[25]。LHR受體在膜細胞和MGC中的高表達，對產(chǎn)生雄烯二酮、睪酮和孕酮以及排卵、卵泡成熟、黃體化和黃體形成十分必要，優(yōu)勢卵泡的GC最終獲得LHR，這是排卵前卵泡的標志[12]。LH激增導致排卵、黃體化，并導致形成黃體LHR的蛋白和mRNA水平下調(diào)[26]。

3.2 MGC的轉(zhuǎn)錄譜系特點與MGC相比，CC具有高抗苗勒管激素（anti-Mullerian hormone，AMH）表達、高增殖率、低LHR表達、低甾體生成能力的特點。在CC中，重組蛋白gremlin（GREM）、HAS2和環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX2）等高表達可作為優(yōu)質(zhì)胚胎的指標。一些基因的表達，例如PTX3，可作為評估卵母細胞和胚胎質(zhì)量的生物標志物[7，27]。一些特定轉(zhuǎn)錄本的表達，如AMH和Slc38a3等在CC中的表達水平高于MGC[22]。AMH是一種糖蛋白激素，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族，通過AMH受體Ⅱ發(fā)揮生物學功能，其比FSH、雌二醇、抑制素B和竇卵泡計數(shù)（antral follicle count，AFC）更早反映卵巢儲備隨年齡增加而下降的趨勢。同時，AMH基因是FOXO1/3和激活素的潛在靶點，轉(zhuǎn)錄因子家族成員FOXO在特定的卵巢細胞中高度表達，被認為是卵泡生長和（或）凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[4]。而晚期竇卵泡的CC表達的Slc38a3與卵母細胞的成熟有關(guān)，其可編碼中性氨基酸轉(zhuǎn)運體（neutral amino acid transporter），負責CC與卵母細胞間的氨基酸轉(zhuǎn)運，而在GC中則沒有或很少有Slc38a3的表達。

4 結(jié)語

在竇卵泡期，CC由OSF介導形成，圍繞在卵母細胞周圍，為卵母細胞提供必需的氨基酸和核苷酸等營養(yǎng)物質(zhì)。MGC在FSH趨化下排列在卵泡壁周圍，執(zhí)行著類固醇生成等功能。而在基因表達上，既往研究表明，與代謝和細胞增殖有關(guān)的轉(zhuǎn)錄本在CC中富集，而與細胞信號轉(zhuǎn)導和分化有關(guān)的轉(zhuǎn)錄本在MGC中富集?？傊珻C與MGC并非學者們固有認知里的位置不同的同一種細胞，兩者存在著多方面的差異性，而且CC和MGC在代謝組學上可能同樣存在差異性，但這一點尚無任何報道。卵泡微環(huán)境中的代謝改變尤其是脂質(zhì)代謝對維持正常的生殖功能至關(guān)重要，脂質(zhì)代謝通過調(diào)節(jié)顆粒細胞增殖、凋亡、能量代謝和類固醇激素合成對卵泡成熟具有重要作用[28]。研究表明，剝?nèi)ブ車鶦C的卵母細胞具有低糖酵解活性。Purcell等[29]發(fā)現(xiàn)，胰島素受體和胰島素信號傳導所需的許多成分同時存在于CC和卵母細胞中，胰島素刺激的葡萄糖攝取發(fā)生在小鼠的致密和膨脹的CC中，也發(fā)生在人類的CC中，而卵母細胞中未發(fā)現(xiàn)胰島素刺激的葡萄糖攝取的發(fā)生。CC和MGC在功能和基因表達上存在差異，包括參與糖代謝通路、脂質(zhì)代謝通路和類固醇代謝通路的基因差異，由此推測，CC和MGC在發(fā)育的不同階段同樣存在著代謝組學上的差異。GC中富集大量的代謝產(chǎn)物[28]，但兩者之間在代謝譜表達上的差異性尚有待進一步的研究。探索兩者之間的差異可能為學者們開發(fā)評估卵母細胞和胚胎質(zhì)量新的標志物提供新思路，這對改善妊娠結(jié)局具有重要的臨床意義。