哺乳動物卵巢儲備形成中的DNA損傷修復(fù)

周志賢，朱芳，殷緩，蘇葉，蔡海奕，符淳

哺乳動物的卵巢內(nèi)原始卵泡的數(shù)量和質(zhì)量構(gòu)成了卵巢的儲備，其生育能力和后代健康依賴于卵巢儲備中卵泡數(shù)目和性成熟階段高質(zhì)量卵母細(xì)胞的充足供應(yīng)[1]。因此，卵巢儲備反映雌性哺乳動物的生殖潛能。卵巢儲備形成過程中，生殖細(xì)胞處于DNA復(fù)制增殖和減數(shù)分裂重組的活躍期，易發(fā)生各種DNA損傷導(dǎo)致卵泡丟失。卵泡大量丟失導(dǎo)致卵巢儲備功能低下，并與原發(fā)性卵巢功能不全（primary ovarian insufficiency，POI）、不孕和卵巢早衰等多種疾病相關(guān)[2]。在原始卵泡形成過程中，各種DNA損傷修復(fù)途徑對維持生殖細(xì)胞基因組穩(wěn)定有重大意義，也是保證充足的卵巢儲備以維持女性生育能力和產(chǎn)生健康配子的重要機(jī)制。生殖細(xì)胞的發(fā)育作為一項(xiàng)復(fù)雜的生命活動，受到多種因素的調(diào)節(jié)和影響。一方面，生殖細(xì)胞發(fā)育中存在調(diào)節(jié)作用的DNA損傷修復(fù)機(jī)制尚不完全清楚。如：直接損傷逆轉(zhuǎn)途徑和非同源末端連接途徑等DNA損傷修復(fù)途徑是否調(diào)節(jié)原始卵泡形成還有待進(jìn)一步探討。另一方面，研究證實(shí)卵巢干細(xì)胞存在下，哺乳動物綿羊的成年卵巢中觀察到新卵發(fā)生和原始卵泡形成[3]。本文主要綜述卵巢儲備形成中相關(guān)的DNA修復(fù)途徑對生殖細(xì)胞生長發(fā)育的調(diào)節(jié)作用。

1 卵巢儲備形成過程中的DNA損傷和修復(fù)途徑

在原始卵泡的形成過程中，生殖細(xì)胞處于快速有絲分裂增殖和減數(shù)分裂重組的活躍期，在各種內(nèi)外源性因素影響下易發(fā)生各種形式的DNA損傷。各種物理、化學(xué)和生物因素導(dǎo)致的DNA損傷的常見形式有：DNA 錯(cuò)配、缺失、鏈間交聯(lián)（interstrand crosslink，ICL）、雙鍵斷裂（double-strand break，DSB）、復(fù)制叉停滯或斷裂和DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)扭曲等。在哺乳動物原始生殖細(xì)胞（primordial germ cell，PGC）增殖到原始卵泡組裝形成的過程中，多條DNA修復(fù)途徑參與維持生殖細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性[4]。主要包括：同源重組（homologous recombination，HR）途徑、范可尼貧血（Fanconi anemia，F(xiàn)A）途徑、錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair，MMR）途徑、堿基切除修復(fù)（base excision repair，BER）途徑和核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair，NER）途徑。見表1和圖1。

圖1 原始卵泡形成過程中的DNA損傷修復(fù)途徑

表1 原始卵泡形成過程中的DNA損傷修復(fù)途徑

目前研究探討哺乳動物原始卵泡形成過程大多采用小鼠模型。小鼠原始卵泡的發(fā)育約需要17 d，分為5個(gè)階段[5-6]，見圖2。階段①PGC增殖和多能性維持（胚胎5.5～7.5 d），BER途徑開始促進(jìn)生殖細(xì)胞多能性表達(dá)。階段②PGC遷移到達(dá)性腺成為卵原細(xì)胞（胚胎8～10.5 d）。階段③生殖細(xì)胞巢形成，生殖細(xì)胞數(shù)目達(dá)峰值（胚胎11～13.5 d）。此階段中FA途徑對減少生殖細(xì)胞凋亡和維持其基因組穩(wěn)定有重要意義，NER途徑協(xié)助FA途徑修復(fù)損傷，BER途徑發(fā)揮作用維持生殖細(xì)胞基因組穩(wěn)定。階段④減數(shù)分裂啟動，DNA損傷高發(fā)（胚胎13.5 d開始）。此階段中，HR途徑對促進(jìn)生殖細(xì)胞正確減數(shù)分裂、減少其凋亡和維持其基因組穩(wěn)定至關(guān)重要。階段⑤生殖細(xì)胞巢破裂，原始卵泡組裝形成（出生后0～2 d）。最終生殖細(xì)胞巢內(nèi)約1/3數(shù)量的生殖細(xì)胞被顆粒細(xì)胞環(huán)繞組裝成原始卵泡，即生殖細(xì)胞最大損失階段。

圖2 卵巢儲備形成過程（從原始生殖細(xì)胞到原始卵泡）

2 DNA損傷修復(fù)途徑在卵巢儲備形成中的作用

2.1 HR途徑減數(shù)分裂重組過程誘導(dǎo)的生理性DSB由HR途徑修復(fù)，形成交叉（crossover，CO）或非交叉（noncrossover，NCO）兩種產(chǎn)物，見圖3a[7]。HR途徑修復(fù)DSB形成CO，對生殖細(xì)胞正確減數(shù)分裂產(chǎn)生功能性配子至關(guān)重要，是維持生殖細(xì)胞基因組穩(wěn)定的重要機(jī)制。HR途徑避免胞內(nèi)DNA損傷積累，在減少生殖細(xì)胞凋亡和維持其基因組穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用。HR途徑保護(hù)復(fù)制叉（見圖3b）[8-9]和重啟停滯的復(fù)制叉（見圖3c）[10]，促進(jìn)生殖細(xì)胞DNA合成。另外，HR途徑DNA修復(fù)基因缺失與POI的基因組不穩(wěn)定相關(guān)。

2.1.1 修復(fù)DSB促進(jìn)生殖細(xì)胞減數(shù)分裂HR途徑促進(jìn)生殖細(xì)胞正確減數(shù)分裂，對產(chǎn)生功能性配子和維持生殖細(xì)胞基因組穩(wěn)定至關(guān)重要。在減數(shù)分裂重組過程中，HR途徑修復(fù)同源染色體上的DSB形成CO。研究表明，同源染色體對至少需獲得1個(gè)CO，以確保其在第一次減數(shù)分裂后期正確分離[7]。這提示，HR途徑促進(jìn)生殖細(xì)胞減數(shù)分裂正確進(jìn)行，對產(chǎn)生具有正確染色體數(shù)和正常功能的配子至關(guān)重要。另有研究發(fā)現(xiàn)Spo11缺陷小鼠由于DSB誘導(dǎo)缺陷和減數(shù)分裂重組缺陷，產(chǎn)生的配子無功能[11]。另外，卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中染色體錯(cuò)誤分離，導(dǎo)致后代非整倍體，是人類自然流產(chǎn)、不孕和出生缺陷的重要原因。研究表明，絕大多數(shù)非整倍體染色體是卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中染色體分離錯(cuò)誤所致[12]。這提示HR途徑維持生殖細(xì)胞基因組穩(wěn)定，對減少后代非整倍體事件發(fā)生有重要意義。

2.1.2 減少生殖細(xì)胞凋亡HR途徑缺陷導(dǎo)致生殖細(xì)胞內(nèi)DNA損傷累積，造成減數(shù)分裂停滯和基因組不穩(wěn)定。生殖細(xì)胞因此提前經(jīng)歷凋亡，導(dǎo)致卵泡數(shù)量減少[13]。HR途徑基因Brca2-/-小鼠觀察到DNA修復(fù)反應(yīng)減弱，其生殖細(xì)胞內(nèi)存在明顯的DSB積累和染色體錯(cuò)配，并且卵泡數(shù)量減少約一半[14]。HR途徑基因Dmc1-/-不育小鼠也觀察到DNA修復(fù)反應(yīng)缺陷，其生殖細(xì)胞存在減數(shù)分裂抑制和凋亡加速[15]。這都提示，HR途徑正確修復(fù)DNA損傷，是生殖細(xì)胞凋亡減少和維持基因組穩(wěn)定的重要機(jī)制。

2.1.3 促進(jìn)生殖細(xì)胞DNA復(fù)制HR途徑保護(hù)和重啟停滯復(fù)制叉，促進(jìn)生殖細(xì)胞DNA完整復(fù)制。研究表明HR途徑蛋白（BRCA1、BRCA2、RPA和RAD51）參與保護(hù)停滯的復(fù)制叉和新生DNA鏈；BRCA1和BRCA2參與重啟復(fù)制叉，預(yù)防染色體畸變[16]；RAD51和RPA促進(jìn)復(fù)制叉重啟和DNA合成[8]。這提示HR途徑保護(hù)和重啟復(fù)制叉，促進(jìn)DNA合成，在促進(jìn)生殖細(xì)胞增殖和維持其基因組完整方面發(fā)揮作用。

2.1.4 基因缺失與POI的基因組不穩(wěn)定有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)HR 途徑基因（MCM8、MCM9、DMC1、BRCA2、STAG3、SMC1、REC8、RAD51、SYCE1、SYCP3和SPIDR）等的變異與POI的基因組不穩(wěn)定顯著關(guān)聯(lián)[2]。對50例POI患者的全外顯子測序鑒定出RAD51雜合突變，RAD51-/-細(xì)胞表現(xiàn)出DSB修復(fù)效率低下[17]。對1例POI患者家庭成員的全外顯子測序鑒定出STAG3純合突變[18]。對1例POI患者家庭成員的全外顯子測序鑒定出MCM8純合和雜合突變[19]。對14例POI患者的全外顯子測序鑒定出MCM9純合突變[20]。這提示，HR途徑缺陷造成DNA損傷修復(fù)缺陷和DNA完整復(fù)制障礙可能與POI患者的生殖細(xì)胞基因組不穩(wěn)定有關(guān)。

2.2 FA途徑FA途徑修復(fù)ICL（見圖4）[21]，形成DSB以激活HR途徑。FA途徑修復(fù)ICL，是減少生殖細(xì)胞凋亡和維持其基因組完整的重要機(jī)制。FA途徑保護(hù)和促進(jìn)復(fù)制叉重啟（見圖3b），有效促進(jìn)生殖細(xì)胞增殖和維持其基因組完整。另外，F(xiàn)A途徑基因缺失可能解釋了POI的病因。

圖3 HR途徑修復(fù)DSB，保護(hù)和重啟復(fù)制叉

圖4 FA途徑修復(fù)ICL

2.2.1 修復(fù)ICL減少生殖細(xì)胞凋亡研究表明FA途徑修復(fù)ICL，是減少生殖細(xì)胞凋亡和維持其基因組穩(wěn)定性的重要機(jī)制[22]。生殖細(xì)胞暴露于各種內(nèi)外源因素下可產(chǎn)生ICL，這形成直接物理障礙造成復(fù)制叉停滯。FA途徑缺陷情況下，生殖細(xì)胞內(nèi)累積DNA損傷導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，在進(jìn)入減數(shù)分裂之前（胚胎10.5～12.5 d）發(fā)生凋亡，造成卵泡數(shù)目減少。研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)FA基因缺陷小鼠（Fanca-/-、Fancc-/-、Fancd1-/-、Fancd2-/-、Fance-/-、Fancf-/-、Fancg-/-、Fanci-/-、Fancl-/-、Fancm-/-、Fanco-/-、Fancp-/-、Fancr-/-、Fancu-/-、Fancv-/-和Fancw-/-）均表現(xiàn)出卵泡數(shù)量減少[23-24]。其中部分小鼠（Fanca-/-、Fancd1-/-、Fancd2-/-、Fanci-/-、Fancm-/-、Fanco-/-和Fancp-/-）表現(xiàn)出減數(shù)分裂前生殖細(xì)胞內(nèi)DNA損傷累積和凋亡加速。Fanca+/-小鼠觀察到DNA修復(fù)功能缺陷和對有害因素敏感，導(dǎo)致生殖細(xì)胞凋亡加速[25]。這些研究提示FA途徑修復(fù)DNA損傷，在減少生殖細(xì)胞凋亡和維持其基因組穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用。

2.2.2 促進(jìn)生殖細(xì)胞增殖FA途徑促進(jìn)復(fù)制叉重啟和生殖細(xì)胞DNA復(fù)制，有效促進(jìn)生殖細(xì)胞增殖和維持其基因組完整。在停滯復(fù)制叉位點(diǎn)，F(xiàn)A途徑蛋白（FANCD1/BRCA2、FANCD2、FANCI、FANCS/BRCA1和FANCR/RAD51）協(xié)同促進(jìn)復(fù)制叉重啟[26]；FANCJ支持DNA復(fù)制[27]；FANCM特異靶向FA核心與DNA結(jié)合以促進(jìn)復(fù)制叉重啟[28]。這提示FA途徑在復(fù)制叉重啟中發(fā)揮作用。FA途徑缺陷使生殖細(xì)胞易發(fā)生復(fù)制叉停滯和基因組不穩(wěn)定，從而阻礙了生殖細(xì)胞增殖。觀察到Fancm缺陷小鼠復(fù)制叉重啟障礙和基因組不穩(wěn)定導(dǎo)致了細(xì)胞增殖減少和胚胎死亡率升高[29]。觀察到Fanci-/-小鼠卵泡數(shù)量極少，表現(xiàn)為性腺功能減退甚至不孕[23]。觀察到Fanca-/-和Fancc-/-小鼠生殖細(xì)胞減數(shù)分裂前增殖減少和染色體畸變[24]。這提示FA途徑功能完整，在避免復(fù)制相關(guān)的基因組不穩(wěn)定和促進(jìn)生殖細(xì)胞增殖方面發(fā)揮作用。

2.2.3 基因缺失與POI的關(guān)系FA途徑缺陷患者常表現(xiàn)為POI[24]。對50例漢族POI患者的全外顯子測序結(jié)果顯示，F(xiàn)ANCA的雜合突變與POI相關(guān)[25]。相較于野生型小鼠Fanca+/-小鼠也表現(xiàn)為出生后原始卵泡丟失加速和生育力降低[25]。對10例POI患者的全外顯子測序也鑒定出FANCM的兩種雜合突變[30]。對1例POI患者家庭成員的全外顯子測序鑒定出FANCD1純合突變[31]。這提示，F(xiàn)A途徑基因突變與POI有關(guān)。FA基因缺陷造成生殖細(xì)胞增殖減少和凋亡增多，可導(dǎo)致卵巢儲備功能低下甚至不育，這可能部分解釋了POI病因。另外，部分FA基因（FANCD1、FANCJ和FANCN）的雜合突變不足以發(fā)展出POI表型，但其表現(xiàn)出的基因組不穩(wěn)定與癌癥的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[32-33]。

2.3 BER途徑BER途徑是生殖細(xì)胞表達(dá)多能性和維持基因組穩(wěn)定的重要機(jī)制，對原始生殖細(xì)胞發(fā)育形成原始卵泡的正常進(jìn)展十分重要。BER途徑在胚胎7.25 d左右促進(jìn)原始生殖細(xì)胞多能性基因的表達(dá)。在進(jìn)入減數(shù)分裂前（約胚胎11.5 d），BER途徑調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞的全基因組的表觀遺傳編程過程，以促進(jìn)生殖細(xì)胞分化和維持基因組穩(wěn)定；其中包括親本印記擦除、全基因組DNA去甲基化和大規(guī)模染色質(zhì)重塑等[34]。該過程也可修復(fù)部分由DNA損傷修復(fù)缺陷造成的基因組不穩(wěn)定。研究表明BER途徑X射線修復(fù)交叉互補(bǔ)蛋白1（XRCC1）缺乏造成生殖細(xì)胞表觀遺傳缺陷，導(dǎo)致異常精子發(fā)生并且致男性不育[35]。但BER途徑的表觀遺傳修飾與卵泡發(fā)育的關(guān)系有待進(jìn)一步探討。

2.4 MMR途徑MMR途徑維持生殖細(xì)胞正確減數(shù)分裂，促進(jìn)生殖細(xì)胞發(fā)育和維持基因組穩(wěn)定。MMR途徑基因Mlh3和Msh5缺陷雄性小鼠中觀察到CO形成障礙和減數(shù)分裂缺陷，表現(xiàn)為不育[36-37]。這提示，MMR途徑缺陷情況下，生殖細(xì)胞可以因CO形成障礙導(dǎo)致減數(shù)分裂中斷。MMR途徑與卵泡發(fā)育的關(guān)系有待進(jìn)一步探討。另外，MMR途徑可修復(fù)部分DNA損傷如堿基錯(cuò)配等，可能有利于維持生殖細(xì)胞基因組完整。對1例POI患者家庭成員的全外顯子測序鑒定出MSH4純合突變[38]。這提示，MMR途徑缺陷造成的生殖細(xì)胞發(fā)育停滯和基因組不穩(wěn)定可能與POI有關(guān)。

2.5 NER途徑NER途徑協(xié)助FA途徑修復(fù)DNA損傷，去除ICL脫鉤后殘余的DNA加合物[21]。這提示NER途徑協(xié)助FA途徑修復(fù)損傷，可能間接作用于生殖細(xì)胞基因組完整的維持。研究表明NER途徑缺陷造成基因組不完整與癌癥的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，NER途徑DNA損傷特異結(jié)合蛋白2（DDB2）抑制卵巢癌干細(xì)胞的去分化從而抑制卵巢癌的進(jìn)展[39]。對210例孟加拉國宮頸癌患者的研究中，發(fā)現(xiàn)NER途徑基因ERCC4和XPC缺陷影響DNA修復(fù)能力并與宮頸癌高風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[40]。另外，NER途徑與卵泡發(fā)育的關(guān)系有待進(jìn)一步探討。

3 結(jié)語

綜上所述，多種DNA損傷修復(fù)途徑在卵巢儲備的形成中發(fā)揮作用。這些功能對于維持生殖細(xì)胞基因組穩(wěn)定、減少生殖細(xì)胞凋亡、促進(jìn)生殖細(xì)胞增殖和多能性表達(dá)以調(diào)節(jié)原始生殖細(xì)胞發(fā)育形成卵巢儲備至關(guān)重要。其中，HR途徑、FA途徑和MMR途徑的部分基因缺陷與POI發(fā)病有關(guān)。一些對POI遺傳學(xué)病因機(jī)制的研究，已經(jīng)鑒定出許多基因的變異與POI的基因組不穩(wěn)定相關(guān)聯(lián)[2，24，41]，這些基因均參與DNA損傷修復(fù)反應(yīng)，但其導(dǎo)致POI發(fā)病的具體風(fēng)險(xiǎn)還不清楚。DNA損傷修復(fù)機(jī)制的相關(guān)研究對于深入探討POI的發(fā)病機(jī)制、早期發(fā)現(xiàn)潛在POI患者、篩查家庭性DNA修復(fù)相關(guān)疾病并制定長期管理方案具有重要意義。