姜黃素對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及作用機(jī)制

張曉梅 趙玉濤 王菊美 趙社芬 韓坤嶺 李艷霞 韓雪 范秀敏

摘要 目的：探究姜黃素對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。方法：取結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞系，隨機(jī)分為對(duì)照組和觀察組，觀察組細(xì)胞使用姜黃素50 μg/mL處理，對(duì)照組給予等量二甲基亞砜處理;采用噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞增殖;劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移;Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲;蛋白免疫印跡法（Western Blotting）檢測(cè)細(xì)胞中上皮性鈣黏蛋白（E-cadherin）、神經(jīng)性鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、磷酸化Jagged 1蛋白（p-JAG1）、磷酸化Notch受體1蛋白（p-Notch1）以及磷酸化Notch受體2蛋白（p-Notch2）表達(dá)水平。結(jié)果：MTT法檢測(cè)顯示，姜黃素可顯著抑制HCT116細(xì)胞增殖。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)以及Transwell實(shí)驗(yàn)顯示姜黃素可顯著抑制HCT116細(xì)胞遷移及侵襲。Western Blotting實(shí)驗(yàn)顯示姜黃素可增加E-cadherin蛋白表達(dá)水平，降低N-cadherin和Vimentin蛋白以及p-JAG1、p-Notch1、p-Notch2等蛋白的表達(dá)水平（均P<0.05）。結(jié)論：姜黃素可顯著抑制結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其機(jī)制可能與JAG1/Notch2通路失活有關(guān)。

關(guān)鍵詞 姜黃素;結(jié)直腸癌;增殖;遷移;侵襲;上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

Effects and Mechanism of Curcumin on Cell Migration，Invasion，and Epithelial-Mesenchymal Transformation in Colorectal Cancer Cells

ZHANG Xiaomei1，ZHAO Yutao1，WANG Jumei1，ZHAO Shefen1，HAN Kunling1，LI Yanxia2，HAN Xue3，F(xiàn)AN Xiumin4

（1 Handan Central Hospital，Handan 056001，China; 2 Department of General Surgery，Affiliated Hospital of Hebei Engineering University，Handan 056002，China; 3 Department of Pharmacy，Hebei University of Chinese Medicine，Shijiazhuang 050200，China; 4 Department of Hematology，Handan First Hospital，Handan 056002，China）

Abstract Objective：To investigate the effects of curcumin on the proliferation，migration，invasion and epithelial mesenchymal transformation（EMT） of colorectal cancer cells.Methods：HCT116 cell lines of colorectal cancer were taken and randomly divided into a control group and an intervention group.HCT116 cells in intervention group were treated with curcumin 50 Ug/mL，and HCT116 cells in control group were treated with the same amount of dimethyl sulfoxide.The cell proliferation ability was detected by thiazolium blue（MTT） assay.Cell migration ability was detected by scratch healing assay.Cell invasion ability was detected by Transwell assay.Expression levels of epithelial cadherin（E-cadherin），neuronal cadherin（N-cadherin），Vimentin，p-Jagged 1（p-JAG1），p-Notch receptor 1（p-Notch 1），and p-Notch receptor 2（p-Notch2） were detected by Western Blotting.Results：Detection of MTT assay showed that curcumin could significantly inhibit the proliferation of HCT116 cells.Wounding healing assay and Transwell assay showed that curcumin could significantly inhibit HCT116 cell migration and invasion.Western Blotting experiments showed that curcumin could increase the expression level of E-cadherin protein，and decrease the expression levels of N-cadherin and Vimentin proteins，as well as p-JAG1，p-Notch1，p-Notch2 and other proteins（P<0.05）.Conclusion：Curcumin can significantly inhibit the proliferation，migration，invasion and epithelial mesenchymal transformation of colorectal cancer HCT116 cells，and the mechanism may be related to the inactivation of JAG1/Notch2 pathway.

Keywords Curcumin; Colorectal cancer; Proliferation; Migration; Invasion; Epithelial-mesenchymal transformation

中圖分類號(hào)：R284;R735.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.17.014

結(jié)直腸癌（Colorectal Cancer，CRC）是一種常見的惡性腫瘤，每年全世界CRC死亡病例超過60萬，并且約25%的CRC患者在確診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1-2]。晚期CRC患者的預(yù)后較差，5年生存率不超過10%[3]。目前越來越多的研究證實(shí)某些中草藥可用于腫瘤的治療[4]。姜黃素是從中藥姜黃中提取的一種有效活性成分，具有抗氧化、抗炎、清除自由基以及抗腫瘤等多種藥理作用，常應(yīng)用于心血管疾病以及消化系統(tǒng)疾病的治療[5-6]。已有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可抑制CRC致瘤性激酶PBK的活性，降低HCT116細(xì)胞的增殖水平，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。然而，姜黃素對(duì)CRC細(xì)胞遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal Transition，EMT）中的作用和具體機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討姜黃素對(duì)HCT116細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116，購自美國模式培養(yǎng)物集存庫。將細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的環(huán)境中常規(guī)培養(yǎng)。

1.1.2 藥物 姜黃素粉，含量≥99.5%，CAS號(hào)：458-37-7，分子量：368.38，規(guī)格100 mg（Sigma公司，美國，批號(hào)：78246）。

1.1.3 試劑與儀器 胎牛血清（Thermo Fisher Scientific公司，美國，貨號(hào)：A3160901）;DMEM培養(yǎng)基（Thermo Fisher Scientific公司，美國，貨號(hào)：0417）;二甲基亞砜（DMSO）（上海碧云天生物科技公司，批號(hào)：ST038-100）;噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒（Abcam公司，英國，貨號(hào)：ab211091）;上皮性鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體（Abcam公司，英國，貨號(hào)：ab244084）;神經(jīng)性鈣黏蛋白（N-cadherin）抗體（Abcam公司，英國，貨號(hào)：256744）;波形蛋白（Vimentin）抗體（Abcam公司，英國，貨號(hào)：8069）;Transwell室（Corning公司，美國，貨號(hào)：3383）;磷酸化Jagged 1蛋白（p-JAG1）（Cell Signaling公司，美國，貨號(hào)：70109S）;磷酸化Notch受體1蛋白（p-Notch1）（Cell Signaling公司，美國，貨號(hào)：8216S）;磷酸化Notch受體2蛋白（p-Notch2）（Cell Signaling公司，美國，貨號(hào)：4530S）;全自動(dòng)凝膠成像和化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（Thermo Scientific公司，美國，ChemiDoc TMMP型）;酶標(biāo)儀（BioTek公司，美國，synergy2型）;光學(xué)顯微鏡（Olympus公司，日本，IX70型）。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 將姜黃素粉末充分溶解于DMSO中，配成濃度為50 μg/mL的溶液。將細(xì)胞分為2組，觀察組細(xì)胞使用50 μg/mL姜黃素處理;對(duì)照組細(xì)胞則使用等量DMSO處理。每組3個(gè)樣本。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.2.1 檢測(cè)細(xì)胞增殖采用MTT實(shí)驗(yàn)[8] 以每孔1×104接種于96孔板中，在培養(yǎng)72 h后，每孔加入MTT溶液10 μL，培養(yǎng)4 h，棄上清，加入DMSO 100 μL，使用酶標(biāo)儀在570 nm波長處檢測(cè)光密度（Optical Density，OD）值。細(xì)胞成活率（%）=（觀察組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。

1.2.2.2 檢測(cè)細(xì)胞遷移采用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)[9] 將各組細(xì)胞接種于6孔板上培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%融合后，用200 μL微量移液器的吸管刮細(xì)胞層產(chǎn)生一條無細(xì)胞區(qū)域，測(cè)量此時(shí)劃痕寬度，記為D 0 h。隨后將細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，測(cè)量劃痕寬度，記為D 24 h。細(xì)胞遷移率（%）=（D 0 h-D 24 h）/D 0 h×100%

1.2.2.3 檢測(cè)細(xì)胞侵襲采用Transwell實(shí)驗(yàn)[10] 將各組細(xì)胞懸浮液添加到Transwell上室，下室加入600 μL完全培養(yǎng)基，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，甲醛固定10 min，然后用1%結(jié)晶紫染色10 min，在顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野的細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

1.2.2.4 檢測(cè)細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、p-JAG1、p-Notch1以及p-Notch2表達(dá)水平采用Western Blotting實(shí)驗(yàn)[11] 將各組細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，加入1%的蛋白酶抑制劑和RIPA裂解液提取蛋白，根據(jù)說明使用BCA蛋白試劑盒定量檢測(cè)，使用10% SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，在室溫下將膜浸泡在5%脫脂牛奶和TBST緩沖液中封閉2 h，隨后將膜加入抗E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、p-JAG1、p-Notch1、p-Notch2抗體稀釋液（1∶1 000），以GAPDH作為內(nèi)參，并在4 ℃中孵育過夜，將膜加入羊抗兔二抗稀釋液（1∶1 000）于37 ℃孵育2 h，ECL發(fā)光顯影。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件統(tǒng)計(jì)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組比較，觀察組中24 h、48 h和72 h細(xì)胞成活率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。見表1。

2.2 姜黃素對(duì)HCT116細(xì)胞遷移能力的影響

對(duì)照組細(xì)胞遷移率（57.61±2.32）%，觀察組細(xì)胞遷移率為（48.92±2.21）%，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見圖1。

2.3 姜黃素對(duì)HCT116細(xì)胞侵襲能力的影響

對(duì)照組細(xì)胞侵襲數(shù)（81.14±2.26）個(gè)，觀察組細(xì)胞侵襲數(shù)為（54.28±2.72）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見圖2。

2.4 姜黃素對(duì)HCT116細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，觀察組中E-cadherin蛋白的表達(dá)水平顯著升高，N-cadherin蛋白、Vimentin蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01）。見表2，圖3。

2.5 姜黃素對(duì)HCT116細(xì)胞中JAG1/Notch2通路的影響

與對(duì)照組比較，觀察組中p-JAG1蛋白、p-Notch1蛋白、p-Notch2蛋白表達(dá)水平均顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。見表3，圖4。

3 討論

目前在我國，結(jié)直腸癌已經(jīng)位列惡性腫瘤發(fā)病第3位[12]。姜黃素是從中藥姜黃、莪術(shù)等中藥種提取的，具有抗腫瘤和抗氧化的功效[13-14]，可調(diào)節(jié)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，已有研究證實(shí)其在體外細(xì)胞模型或動(dòng)物模型中對(duì)腫瘤的預(yù)防和治療具有重要作用，如在胃癌中，姜黃素可通過抑制Hsp90-JAK/STAT3信號(hào)通絡(luò)的激活，顯著降低胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖水平，并抑制細(xì)胞的遷移和侵襲[15-16]。當(dāng)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，上皮細(xì)胞表型缺失，E-cadherin等蛋白表達(dá)減少，而N-cadherin、Vimentin等間質(zhì)細(xì)胞的分子標(biāo)志物表達(dá)增加，從而導(dǎo)致細(xì)胞間黏附能力下降甚至喪失[17-18]。已有相關(guān)研究報(bào)道，JAG1/Notch2信號(hào)通路與乳腺癌、CRC、肺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，當(dāng)信號(hào)通路失調(diào)后可誘發(fā)腫瘤，屬于致癌信號(hào)通路[19-20]。當(dāng)JAG1/Notch2信號(hào)通路活化后，可通過磷酸化作用誘導(dǎo)下游靶基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致JAG1、Notch1、Notch2蛋白的磷酸化水平增加[21-23]。本研究使用50 μg/mL姜黃素處理細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，結(jié)果說明姜黃素可通過下調(diào)JAG1/Notch2信號(hào)通路，抑制CRC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲以及EMT。

既往研究顯示，姜黃素可通過靶向miR-491/PEG10抑制HCT116細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[24]。鄭旦等[25]、胡艷紅等[26]學(xué)者研究體外培養(yǎng)CRC細(xì)胞系SW480，并使用不同濃度的姜黃素進(jìn)行處理，結(jié)果顯示均可以顯著降低細(xì)胞的增殖能力，其作用與時(shí)間及濃度相關(guān)。本研究結(jié)果與之相似。然而本研究僅限于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，后續(xù)將進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)此結(jié)論。

綜上所述，本研究為結(jié)直腸癌的治療提供了一個(gè)新靶點(diǎn)，同時(shí)有待進(jìn)一步深究進(jìn)而為直腸癌的防治提供理論依據(jù)。

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（2021-07-06收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）