3種檢測方法比較忍冬藥用和非藥用部位的抗氧化活性

陳兩綿 鄒芳艷 劉曉謙 高慧敏 張永欣 馮偉紅 郭中原 王智民

摘要 目的：分析和比較忍冬藥用部位（金銀花和忍冬藤）和非藥用部位（忍冬葉）的體外抗氧化活性，為忍冬非藥用部位——忍冬葉的綜合利用和產(chǎn)品開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。方法：分別采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法、2，2′-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）法和鐵離子還原能力（FRAP）微量法測定45份金銀花、忍冬葉和忍冬藤樣品的抗氧化活性，并分別采用描述性統(tǒng)計(jì)、直觀分析、系統(tǒng)聚類分析（HCA）和偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和挖掘。結(jié)果：3種方法測定的抗氧化活性結(jié)果基本相似，測定結(jié)果具有較高的可信度。不同產(chǎn)地的金銀花、忍冬葉和忍冬藤抗氧化活性大?。哼B云港≥河南>山東（金銀花）;連云港>河南>山東（忍冬葉）;河南≥山東≥連云港（忍冬藤）。忍冬藤的抗氧化活性較弱，金銀花和忍冬葉的抗氧化活性較強(qiáng)。金銀花和忍冬葉的抗氧化活性大小因其產(chǎn)地不同而存在差異：忍冬葉≈金銀花（河南），忍冬葉>金銀花（連云港），忍冬葉<金銀花（山東）。HCA和PLS-DA分析將45份樣品分為2個(gè)組別，其中忍冬藤為一組，金銀花和忍冬葉為另一組。忍冬藤的抗氧化活性明顯不同于金銀花和忍冬葉，而金銀花和忍冬葉的抗氧化活性則較為相近。結(jié)論：忍冬植物的非藥用部位——忍冬葉資源豐富，其抗氧化活性比忍冬藤強(qiáng)，與金銀花相當(dāng)，極具綜合利用價(jià)值和產(chǎn)品開發(fā)潛能。

關(guān)鍵詞 忍冬;非藥用部位;忍冬葉;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼;2，2′-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽;鐵離子還原能力;抗氧化活性;微量法

Comparison of Antioxidant Activities between the Medicinal Parts and Non-Medicinal Parts of Lonicera japonica by Three Test Methods

CHEN Liangmian1，ZOU Fangyan1，2，LIU Xiaoqian1，GAO Huimin1，ZHANG Yongxin1，F(xiàn)ENG Weihong1，GUO Zhongyuan1，WANG Zhimin1

（1 National Engineering Laboratory for Quality Control Technology of Chinese Materia Medica， Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 2 Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China）

Abstract Objective：To analyze and compare the antioxidant activities in vitro between the medicinal parts[Lonicerae Japonicae Flos（LJFs） and Lonicerae Japonicae Caulis（LJC）]and the non-medicinal parts[Lonicerae Japonicae Folium（LJFm）]of Lonicera japonica Thunb and provide a scientific basis for the comprehensive utilization and product development of LJFm-the non-medicinal parts of Lonicera japonica Thunb.Methods：A total of 3 micro-models of 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH），2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） diammonium salt（ABTS） and ferric reducing antioxidant power（FRAP） were used respectively to determine the antioxidant activities of 45 samples of LJFs，LJFm and LJC.And descriptive statistics，visual analysis，hierarchical cluster analysis（HCA） and partial least squares discrimination analysis（PLS-DA） were used separately for data processing and mining.Results：The antioxidant activities of 45 samples determined by 3 micro-models were basically consistent，which showed that the measurement results had high reliability.The antioxidant activities of the samples from different producing areas：Lianyungang≥Henan>Shandong（LJFs）; Lianyungang>Henan>Shandong（LJFm）; Henan≥Shandong≥Lianyungang（LJC）.Furthermore，the antioxidant activity of LJC was weak，while that of LJFs and LJFm was strong.The antioxidant activities between LJFs and LJFm varied with the different producing areas，for instance，LJFm≈LJFs（Henan），LJFm>LJFs（Lianyungang），and LJFm

Keywords Lonicera japonica; Non-medicinal parts; Lonicerae Japonicae Folium; DPPH; ABTS; FRAP; Antioxidant activity; Micro-model

中圖分類號：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.17.001

忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）是我國傳統(tǒng)的藥用植物，其花、葉和莖分別稱為金銀花、忍冬葉和忍冬藤。忍冬在不同的歷史時(shí)期以不用的部位入藥。宋代及宋代以前只用忍冬葉和忍冬藤，自明代起明確以金銀花入藥，并逐步發(fā)展為花、葉和莖并用，自清代起則貴花而賤藤[1]?！侗静菥V目》曰：“忍冬，莖葉同花，功用皆同?！盵2]金銀花、忍冬葉和忍冬藤均具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱之功效，可用于癰腫疔瘡，熱毒血痢，溫病發(fā)熱等的治療[3-4]?，F(xiàn)代研究表明，金銀花、忍冬葉和忍冬藤均含有酚酸、黃酮、環(huán)烯醚萜、三萜皂苷、多糖和揮發(fā)油等多種成分[5-8]，均具有抗菌、抗病毒、解熱抗炎、抗氧化、保肝利膽、降糖降脂和抗腫瘤等藥理作用[9-12]。盡管如此，目前《中華人民共和國藥典》[3]僅收載了金銀花和忍冬藤，而忍冬葉被視為忍冬的非藥用部位，尚未得到充分利用。忍冬葉資源豐富，在忍冬的種植過程中，其產(chǎn)量是金銀花的10倍左右，大多作為非藥用部位被廢棄，造成了極大的資源浪費(fèi)。

現(xiàn)代質(zhì)量評價(jià)常采用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測定指標(biāo)性成分的含量，但僅用幾個(gè)指標(biāo)性成分難以全面表征其內(nèi)在質(zhì)量，而生物測定法中的抗氧化活性測定法是對有效成分群的整體評價(jià)，比較能表征清熱解毒類中藥的活性。忍冬的主要化學(xué)成分為酚酸和黃酮類成分，因其酚羥基結(jié)構(gòu)使之具有良好的抗氧化活性。常用的體外抗氧化活性測定方法有1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法、2，2′-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid） Diammonium Salt，ABTS]法和鐵離子還原能力（Ferric Reducing Antioxidant Power，F(xiàn)RAP）法[13-15]，3種方法都是基于紫外-可見分光光度法進(jìn)行抗氧化活性測定。然而，傳統(tǒng)的紫外-可見分光光度法，樣品消耗大、多樣品測定時(shí)操作煩瑣、耗時(shí)長，且常因反應(yīng)條件不同導(dǎo)致抗氧化活性測定結(jié)果出現(xiàn)不一致的情況。有研究采用基于酶標(biāo)儀-酶標(biāo)板的DPPH、ABTS和FRAP微量法測定樣品的抗氧化活性，由于操作的便捷快速、高通量和半自動(dòng)化，不僅可以降低能耗、節(jié)省時(shí)間、提高工作效率，而且可以獲得穩(wěn)定、可靠的測定結(jié)果[16-18]。因此，本研究基于DPPH、ABTS和FRAP微量法，分析和比較忍冬藥用部位和非藥用部位的體外抗氧化活性，為忍冬的非藥用部位——忍冬葉的綜合利用和產(chǎn)品開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 酶標(biāo)儀（Thermo-Fisher公司，美國，型號：Multiskan go）;萬分之一電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，型號：BSA-124S-CW）;十萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，型號：XSE 105DU];漩渦儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號：QL-901）;超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，型號：KQ-250DB）;離心機(jī)（上海安亭科興儀器廠，型號：TGL-16G）;酶標(biāo)板（康寧生命科技有限公司，美國，型號：96孔）;移液槍（Eppendorf公司，德國，型號：2～20 μL，10～100 μL和20～200 μL）。

1.2 試劑 DPPH（純度≥98%，Sigma公司，德國，批號：1001173304）;2，4，6-三吡啶基-1，3，5-三嗪（純度≥98%，TPTZ，Sigma公司，德國，批號：101091144）;ABTS[純度>98%，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號：1014011203];其余試劑均為分析純。

1.3 分析樣品 分別于2014年5月和2015年5月前往山東、江蘇連云港和河南等地，采集忍冬不同部位的樣品，合計(jì)采集金銀花、忍冬葉和忍冬藤樣品45份，樣品的具體情況見表1。上述樣品經(jīng)國醫(yī)大師金世元教授鑒定其來源為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 分別取金銀花、忍冬葉和忍冬藤粉末（過40目篩）約0.15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入70%甲醇溶液20 mL，稱定重量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理20 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為樣品儲備溶液;取樣品儲備溶液適量，用70%甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度系列的溶液，即為供試品溶液。

2.2 DPPH微量法的建立

2.2.1 DPPH乙醇溶液的制備 精密稱取DPPH 4.93 mg，置于100 mL棕色量瓶中，加95%乙醇溶解并稀釋至刻度，避光放置，即得0.125 mmol/L的DPPH乙醇溶液。

2.2.2 DPPH自由基清除率測定 分別精密移取系列質(zhì)量濃度的供試品溶液50 μL及DPPH乙醇溶液200 μL于96孔酶標(biāo)板中，混合均勻，在適宜反應(yīng)時(shí)間內(nèi)使反應(yīng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，于515 nm下測定吸光度，記為Ai。同時(shí)，以50 μL 70%甲醇與200 μL DPPH乙醇溶液作為對照組，其吸光度記為A0;以50 μL 70%甲醇與200 μL 95%乙醇作為空白組，其吸光度記為Aj，按DPPH自由基清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%，計(jì)算清除率，以質(zhì)量濃度（g/L）為橫坐標(biāo)，清除率（%）為縱坐標(biāo)，繪制清除率曲線，進(jìn)一步計(jì)算獲得半數(shù)清除率（EC50）。

2.2.3 供試品溶液最適質(zhì)量濃度系列的確定 分別按照2.1項(xiàng)方法制備金銀花、忍冬葉和忍冬藤的供試品儲備液，并稀釋成系列質(zhì)量濃度的供試品溶液，按照2.2.2項(xiàng)下方法測定清除率，并繪制清除率曲線。金銀花樣品溶液的質(zhì)量濃度系列為0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.30、1.60、2.00 g/L等10種;忍冬葉樣品溶液的質(zhì)量濃度系列為0.10、0.30、0.50、0.70、0.90、1.10、1.30、1.60、2.00、2.50 g/L等10種;忍冬藤樣品溶液的質(zhì)量濃度系列為0.50、0.90、1.30、1.70、2.10、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50 g/L等10種。在當(dāng)前質(zhì)量濃度系列下，DPPH自由基清除率較為均勻地分布在10%～90%范圍內(nèi)，故確定以上質(zhì)量濃度系列作為供試品溶液的最適質(zhì)量濃度系列。見圖1。

2.2.4 反應(yīng)時(shí)間的確定 分別移取低、中和高3種質(zhì)量濃度的供試品溶液（金銀花：0.10、0.80、1.60 g/L;忍冬葉：0.30、0.90、2.00 g/L;忍冬藤：0.90、2.10、4.00 g/L），按照2.2.2項(xiàng)下方法，于反應(yīng)時(shí)間分別為5、10、15、20、25、30、40、45、50、55、60 min時(shí)測定吸光度Ai，觀察各濃度下Ai的變化情況。結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為40 min時(shí)，其Ai與相鄰時(shí)間點(diǎn)（35 min和45 min）Ai的相對偏差（Relative Deviation，RD）均小于5%，表明40 min能使反應(yīng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，故確定反應(yīng)時(shí)間為40 min。

2.3 ABTS微量法的建立

2.3.1 ABTS自由基工作液的制備 分別移取7.0 mmol/L的ABTS溶液5 mL和140 mmol/L的K2S2O8溶液88 μL，混合均勻后，避光放置12～16 h，得ABTS自由基儲備液[19]。使用前，移取ABTS自由基儲備液2.0 mL，置于100 mL棕色量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得ABTS自由基工作液。

2.3.2 ABTS自由基清除率測定 分別精密移取系列質(zhì)量濃度的供試品溶液50 μL及ABTS自由基工作液200 μL于96孔酶標(biāo)板中，混合均勻，在適宜反應(yīng)時(shí)間內(nèi)使反應(yīng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，于734 nm下測定吸光度Ai。同時(shí)，以50 μL 70%甲醇與200 μL ABTS自由基工作液作為對照組，吸光度為A0;以50 μL 70%甲醇與200 μL蒸餾水作為空白組，吸光度為Aj，按ABTS自由基清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%，計(jì)算清除率，以質(zhì)量濃度（g/L）為橫坐標(biāo)，清除率（%）為縱坐標(biāo)，繪制清除率曲線，進(jìn)而獲得EC50。

2.3.3 供試品溶液最適質(zhì)量濃度系列的確定 分別按照2.1項(xiàng)方法制備金銀花、忍冬葉和忍冬藤的供試品儲備液，并稀釋成系列質(zhì)量濃度的供試品溶液，按照2.3.2項(xiàng)下方法測定清除率，并繪制清除率曲線。當(dāng)金銀花、忍冬葉和忍冬藤樣品溶液的質(zhì)量濃度系列與2.2.3項(xiàng)下的質(zhì)量濃度系列相同時(shí)，ABTS自由基清除率較為均勻地分布在10%～99%范圍內(nèi)，故確定ABTS法的供試品溶液最適質(zhì)量濃度系列與DPPH法保持一致。見圖2。

2.3.4 反應(yīng)時(shí)間的確定 分別移取低、中和高3種質(zhì)量濃度的供試品溶液（金銀花：0.10、0.80、1.60 g/L;忍冬葉：0.20、0.70、1.60 g/L;忍冬藤：0.90、2.10、4.00 g/L），按照2.3.2項(xiàng)下方法，于反應(yīng)時(shí)間分別為5、10、15、20、25、30、35、40 min時(shí)測定吸光度Ai，觀察各濃度下Ai的變化情況。結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為25 min時(shí)，其Ai與相鄰時(shí)間點(diǎn)（20 min和30 min）Ai的RD均小于5%，表明25 min能使反應(yīng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，故確定反應(yīng)時(shí)間為25 min。

2.4 FRAP微量法的建立

2.4.1 FRAP工作液的制備 分別移取0.30 mol/L醋酸鹽緩沖溶液25 mL，10 mmol/L TPTZ溶液2.5 mL和20 mmol/L三氯化鐵溶液2.5 mL，混合均勻，即得FRAP工作液[20]，臨用前現(xiàn)配。

2.4.2 FeSO4當(dāng)量測定 分別精密移取適宜質(zhì)量濃度的供試品溶液10 μL及FRAP工作液200 μL于96孔酶標(biāo)板中，混合均勻，37 ℃溫育適宜時(shí)間，使反應(yīng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，于593 nm下測定吸光度Ai，同時(shí)，以10 μL 70%甲醇與200 μL FRAP工作液作為空白組，吸光度為Aj。FeSO4當(dāng)量使用FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行換算，表示為mmol/g。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 配制摩爾濃度分別為0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.20、1.60、2.00 mmol/L FeSO4溶液，按照2.4.2項(xiàng)下方法測定Ai和Aj，以吸光度（Ai-Aj）為縱坐標(biāo)（y），F(xiàn)eSO4濃度（mmol/L）為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=0.615 4x+0.009 0（r=0.999 0），F(xiàn)eSO4溶液在0.20～1.60 mmol/L（n=6）與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.4.4 供試品溶液最適質(zhì)量濃度的確定 分別按照2.1項(xiàng)方法制備金銀花、忍冬葉和忍冬藤的供試品儲備液，并稀釋成系列質(zhì)量濃度的供試品溶液，按照2.4.2項(xiàng)下方法測定吸光度（Ai-Aj），參照2.4.3項(xiàng)下FeSO4溶液線性范圍所對應(yīng)的吸光度（Ai-Aj）范圍，確定金銀花供試品溶液的最適質(zhì)量濃度為1.25 g/L，忍冬葉供試品溶液的最適質(zhì)量濃度為1.25 g/L，忍冬藤供試品溶液的最適質(zhì)量濃度為3.75 g/L。

2.4.5 反應(yīng)時(shí)間的確定 分別移金銀花、忍冬葉和忍冬藤的供試品溶液，按照2.4.2項(xiàng)下方法，于反應(yīng)時(shí)間分別為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 min時(shí)測定吸光度Ai，觀察各濃度下Ai的變化情況。結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為50 min時(shí)，其Ai與相鄰時(shí)間點(diǎn)（45 min和55 min）Ai的RD均小于5.0%，表明反應(yīng)時(shí)間50 min能使反應(yīng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，故確定反應(yīng)時(shí)間為50 min。

2.5 樣品測定 分別采用2.2、2.3和2.4項(xiàng)下的DPPH、ABTS和FRAP微量法，測定45份樣品（金銀花、忍冬葉和忍冬藤）的抗氧化活性。DPPH和ABTS微量法中，樣品的抗氧化活性采用EC50（g/L）表征，EC50值越小，表示樣品的抗氧化活性越強(qiáng);FRAP微量法中，樣品的抗氧化活性采用FeSO4當(dāng)量（mmol/g）表征，F(xiàn)eSO4當(dāng)量越大，表示樣品的抗氧化活性越強(qiáng)。見表2。

2.6 抗氧化活性比較

2.6.1 描述性統(tǒng)計(jì) 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，分別對表2中金銀花、忍冬葉和忍冬藤樣品的3項(xiàng)抗氧化活性指標(biāo)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析。金銀花樣品的3項(xiàng)指標(biāo)的變異系數(shù)為13.7%～20.1%（n=15），忍冬葉樣品的3項(xiàng)指標(biāo)的變異系數(shù)為32.6%～36.2%（n=15），忍冬藤樣品的3項(xiàng)指標(biāo)的變異系數(shù)為13.9%～23.2%（n=15），其變異系數(shù)均>10%，表明金銀花、忍冬葉和忍冬藤樣品的抗氧化活性均存在較大差別，其中忍冬葉各樣品間的差別更為明顯。見表3。

2.6.2 直觀分析 根據(jù)表2的抗氧化活性測定結(jié)果，對相同產(chǎn)地的金銀花、忍冬葉和忍冬藤樣品分別計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差（±s，n=5），并分別比較金銀花、忍冬葉和忍冬藤在不同產(chǎn)地條件下的抗氧化活性大小。見圖3。DPPH、ABTS和FRAP微量法的測定結(jié)果基本相似，表明其測定結(jié)果具有較高的可信度。不同產(chǎn)地金銀花的抗氧化活性：連云港≥河南>山東;不同產(chǎn)地忍冬葉的抗氧化活性：連云港>河南>山東;不同產(chǎn)地忍冬藤的抗氧化活性：河南≥山東≥連云港。同時(shí)，在相同產(chǎn)地條件下，分別比較金銀花、忍冬葉和忍冬藤的抗氧化活性。見圖4。DPPH、ABTS和FRAP微量法的測定結(jié)果亦基本相似，其抗氧化活性大小分別為：忍冬葉≈金銀花>忍冬藤（河南），忍冬葉>金銀花>忍冬藤（連云港），金銀花>忍冬葉>忍冬藤（山東）?？偟恼f來，忍冬藤的抗氧化活性較弱，金銀花和忍冬葉的抗氧化活性較強(qiáng)，金銀花和忍冬葉的抗氧化活性大小因其產(chǎn)地不同而存在差別，但總體差別較小。

2.6.3 系統(tǒng)聚類分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，以DPPH法EC50、ABTS法EC50和FeSO4當(dāng)量為變量，以45份金銀花、忍冬葉和忍冬藤樣品Z-score標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)為個(gè)案，采用組間聯(lián)接法、平方Euclidean距離度量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行聚類分析，獲得樣品的分類情況。系統(tǒng)聚類分析將45份樣品分為2個(gè)大組，其中忍冬藤為一組，金銀花和忍冬葉為一組，表明忍冬藤的抗氧化活性明顯不同于金銀花和忍冬葉。其次，在金銀花和忍冬葉這一組別下細(xì)分的小組中，既有金銀花樣品也有忍冬葉樣品，表明金銀花和忍冬葉的抗氧化活性較為相近，這與直觀分析的結(jié)果保持一致。見圖5。

2.6.4 偏最小二乘-判別分析 采用SIMCA-P 12.0軟件，以DPPH法EC50、ABTS法EC50和FeSO4當(dāng)量為變量，以45份金銀花、忍冬葉和忍冬藤樣品Z-score標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)為觀測值，根據(jù)樣品類型設(shè)置組別：金銀花樣品設(shè)置為組別1，忍冬葉樣品設(shè)置為組別2，忍冬藤樣品設(shè)置為組別3，進(jìn)行偏最小二乘-判別分析（Partial Least Squares Discriminant Analysis，PLS-DA），前2個(gè)主成分的樣品得分散點(diǎn)圖見圖6。提取的前2個(gè)主成分對總方差的累積貢獻(xiàn)率為97.0%，表明前2個(gè)主成分可以很好地表征樣品的原始信息。45份樣品被分成2個(gè)組別，其中忍冬藤樣品為一組，處于t[1]的負(fù)值區(qū)域;金銀花和忍冬葉樣品為一組，處于t[1]的正值區(qū)域且在t[2]的正負(fù)值區(qū)域離散分布。PLS-DA分析驗(yàn)證了系統(tǒng)聚類分析的結(jié)果，結(jié)合直觀分析結(jié)果可知，忍冬葉的抗氧化活性比忍冬藤強(qiáng)，與金銀花相當(dāng)。

3 討論

DPPH法、ABTS法和FRAP法是最為常用的體外抗氧化活性測定方法，其中DPPH法和ABTS法是表征抗氧化物質(zhì)對自由基的清除能力。DPPH·是一種穩(wěn)定的有機(jī)氮自由基，在乙醇溶液中呈深紫色，當(dāng)抗氧化物質(zhì)的氫與其單電子結(jié)合后，會使溶液顏色減退，吸光度減小;ABTS經(jīng)K2S2O8氧化后可生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽離子自由基ABTS·+，抗氧化物質(zhì)可與ABTS·+發(fā)生反應(yīng)使其溶液褪色，吸光度減小。2種方法均是根據(jù)吸光度的減小程度來評價(jià)物質(zhì)的抗氧化活性，常以EC50作為評價(jià)指標(biāo)。FRAP法是表征抗氧化物質(zhì)對金屬離子的還原能力。溶液中前期形成的無色的Fe3+（TPTZ）2Cl3絡(luò)合物，在酸性條件下可以被抗氧化物質(zhì)還原，生成有顏色的Fe2+絡(luò)合物。因此，F(xiàn)RAP法是根據(jù)吸光度的增加程度來評價(jià)物質(zhì)的抗氧化活性，常以FeSO4當(dāng)量作為評價(jià)指標(biāo)。但是，由于各方法的反應(yīng)原理和條件不同，通常測定的結(jié)果并不完全一致，需要同時(shí)配合使用才可以提高評價(jià)的準(zhǔn)確性和可靠性。此外，與傳統(tǒng)的紫外-可見分光光度法比較，基于酶標(biāo)儀-酶標(biāo)板的微量法可操作性強(qiáng)，結(jié)果可靠，能夠高通量、半自動(dòng)化、快速地測定抗氧化物質(zhì)的抗氧化活性。因此，我們分別采用DPPH、ABTS和FRAP微量法測定忍冬藥用和非藥用部位的抗氧化活性，其結(jié)果顯示，3種方法測定的抗氧化活性結(jié)果基本保持一致，表明其測定結(jié)果具有較高的可信度。

忍冬中的主要化學(xué)成分為酚酸類和黃酮類等酚類物質(zhì)，酚類物質(zhì)是具有一個(gè)或多個(gè)芳香環(huán)連接一個(gè)或多個(gè)羥基的一類化合物，因其多個(gè)酚羥基的存在使之具有良好的抗氧化活性[19]。盡管有文獻(xiàn)報(bào)道忍冬中三萜類和多糖類成分亦具有一定的抗氧化活性[21-22]，但與其中的酚類成分比較，抗氧化活性相對較弱;而環(huán)烯醚萜類成分幾乎沒有抗氧化活性[23]。金銀花與忍冬葉主成分含量相似，與忍冬藤差異較大[8]，前二者含有較多的酚類物質(zhì)，后者酚類含量相對較低，以馬錢苷為代表的環(huán)烯醚萜類含量更高。因此認(rèn)為金銀花、忍冬葉和忍冬藤的抗氧化活性強(qiáng)弱與其內(nèi)在酚類成分群的含量高低密切相關(guān)。

金銀花、忍冬葉和忍冬藤在不同產(chǎn)地條件下的抗氧化活性存在差別，金銀花：連云港≥河南>山東，忍冬葉：連云港>河南>山東，忍冬藤：河南≥山東≥連云港，這可能與產(chǎn)地的生長環(huán)境（土壤、氣候、水分等）、采收年份、采收時(shí)期和干燥過程等因素密切相關(guān)。對于金銀花、忍冬葉和忍冬藤三者之間的抗氧化活性大小，忍冬藤的抗氧化活性明顯弱于金銀花和忍冬葉，而忍冬葉和金銀花之間的抗氧化活性大小則因其產(chǎn)地的不同而存在差別，比如，河南：忍冬葉≈金銀花，連云港：忍冬葉>金銀花，山東：忍冬葉<金銀花。這從側(cè)面說明，忍冬葉和金銀花的抗氧化活性較為相近。HCA和PLS-DA分析將金銀花和忍冬葉歸為同一組，驗(yàn)證了直觀分析的結(jié)果?？偟恼f來，忍冬葉作為忍冬植物的非藥用部位，其抗氧化活性比忍冬藤強(qiáng)，與金銀花相當(dāng)，具有極強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。忍冬葉資源豐富，生藥量龐大，價(jià)格低廉，可以在提取物制備、地方特色食品或新資源食品申報(bào)、飲品開發(fā)和忍冬葉茶制作等多個(gè)方面加以綜合利用和開發(fā)。

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（2021-08-06收稿 責(zé)任編輯：王明）