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    忍冬藤提取物抗結(jié)腸癌作用研究

    2022-09-01 08:52:26陳靈蔣文婕姚昶李玉蓮方明明
    中國腫瘤外科雜志 2022年4期
    關(guān)鍵詞:忍冬藤膜電位結(jié)腸癌

    陳靈, 蔣文婕, 姚昶, 李玉蓮, 方明明

    結(jié)腸癌是一種由諸多因素誘發(fā)的結(jié)腸上皮來源消化道腫瘤,其發(fā)病早期無明顯癥狀,但隨著疾病進展,可能引起多種并發(fā)癥如器官功能障礙、頭暈頭痛、黃疸、呼吸困難等[1-2]。目前,我國結(jié)腸癌的發(fā)病率及致死率逐漸上升,嚴重影響居民的生存質(zhì)量及生活品質(zhì)[3]。手術(shù)、化療等為當前臨床治療結(jié)腸癌的常規(guī)治療方法,但仍存在復發(fā)率高、不良反應大、成本高等缺點[2]。諸多證據(jù)顯示,部分中藥及其成分可發(fā)揮抗腫瘤作用,具有療效確切和安全性高等特點[4]。傳統(tǒng)中藥忍冬藤又名老翁須、千金藤,藥用歷史十分悠久,最早記載于漢末的《名醫(yī)別錄》,其性甘味寒,尤善清熱解毒,疏風通絡(luò)[5]。忍冬藤中含有有機酸類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類等多種類型代謝產(chǎn)物,可通過多種途徑,作用于多種靶點,發(fā)揮解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌等作用[6]。忍冬藤包括其活性成分對多種腫瘤亦有作用,但目前暫無其抗結(jié)腸癌作用的相關(guān)報道[5-7]。因此,本研究以結(jié)腸癌細胞HCT116和SW480為對象,從線粒體凋亡角度研究忍冬藤提取物的抗結(jié)腸癌作用,以期為忍冬藤及其組方臨床用于治療結(jié)腸癌提供實驗依據(jù)。

    1 材料

    1.1 細胞株 購自ATCC的HCT116和SW480細胞株(人結(jié)腸癌)采用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)于5%CO2、37 ℃的恒溫細胞培養(yǎng)箱中。

    1.2 藥物及試劑 忍冬藤(批號:200911),購自南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,其基原經(jīng)姚昶教授鑒定為忍冬科忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥莖枝;DMSO(批號:V900090)、DMEM培養(yǎng)基(批號:D6429)、AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒(批號:APOAF),均購自德國默克sigma-aldrich公司;CCK8試劑盒(批號:CA1210),購自北京索萊寶公司;JC-1檢測試劑盒(批號:BL711A),購自合肥白鯊公司;胎牛血清(批號:10099141C)、PVDF膜(批號:LC2002)、BCA蛋白定量試劑盒(批號:23246),均購自美國Thermo公司;一抗:Bcl-2(批號:bs-33411R)、Bax(批號:bs-0127R)、Cleaved Caspase-3(批號:bsm-33199M)、Cyt-C(批號:bs-0013R)、Cleaved PARP(批號:bsm-52408R)、p53(批號:bsm-33058M)和GAPDH(批號:bs-0755R)和二抗:IgG-HRP(批號:32935S),均購自北京博奧森公司;p53抑制劑PFT-α(批號:SY1065),購自北京百奧萊博。

    1.3 主要儀器 ML-TS型電子天平,美國Mettler Toliedo公司;YK-1020型超聲機,上海櫻科設(shè)備有限公司;R-100型旋蒸儀,瑞士布奇公司;FD-250201型凍干機,杭州富瑞捷公司;CO2培養(yǎng)箱,德國IRM公司;E2-20TJ型水系統(tǒng),南京EPED有限公司;TS100、TS2R型顯微鏡,日本尼康公司;Calibur型流式細胞儀,美國BD公司;MK3型酶標儀,美國Thermo公司;MINI-4小型垂直電泳儀,美國伯樂公司。

    2 方法

    2.1 忍冬藤提取物的制備 結(jié)合文獻及前期基礎(chǔ)[5],忍冬藤提取物的提取工藝為:取適量忍冬藤藥材(粉碎,40目篩),加入甲醇(50%,2倍體積),靜置1 h后超聲50 min,濾渣重復上述操作,合并兩次濾液,濃縮揮干甲醇后凍干,隨后用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基復溶,得到生藥濃度為1 g/ml的忍冬藤提取物,臨用前以10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋至相應濃度。

    2.2 CCK8法檢測細胞存活率 收集對數(shù)生長期的HCT116和SW480細胞接種于96孔板中(100 μl,5×103個),24 h后各加入濃度為0(0.1% DMSO)、2、5、10、20、40、60和80 g/L“2.1項”忍冬藤提取物。24 h后按CCK8說明書步驟操作,在450 nm處測定吸光值并計算存活率,計算方法與文獻報道一致[5]。

    2.3 Hochest法檢測凋亡 收集對數(shù)生長期的HCT116和SW480細胞接種于24孔板中(500 μl,2.5×104個),24 h后結(jié)合“2.2項”結(jié)果各加入濃度為0(0.1% DMSO)、15、25和35 g/L“2.1項”忍冬藤提取物。24 h后棄液,PBS洗滌3次,加入300 μl染液,避光孵育10 min后PBS洗滌2次,隨后加入300 μl PBS,最后使用熒光倒置顯微鏡觀察處理后的細胞并拍照。

    2.4 Annexin V/PI法檢測凋亡率 收集對數(shù)生長期的HCT116細胞接種于6孔板中(2 ml,4×105個),24 h后處理同“2.3項”,在此基礎(chǔ)上增加0(0.1% DMSO)、35 g/L“2.1項”忍冬藤提取物、35 g/L忍冬藤提取物與5 μmol/L p53抑制劑PFT-α聯(lián)用處理。24 h后依據(jù)凋亡雙染試劑盒說明書步驟處理,最后采用流式細胞儀檢測處理后的細胞凋亡情況。

    2.5 JC-1法檢測線粒體膜電位變化 細胞培養(yǎng)及接種同“2.2項”,細胞處理同“2.3項”。24 h后依據(jù)JC-1試劑盒說明書步驟處理,最后使用熒光倒置顯微鏡觀察處理后的細胞并拍照。

    2.6 Western Blot法檢測相關(guān)蛋白表達 細胞培養(yǎng)及接種同“2.4項”,細胞處理同“2.3項”。24 h后提取總蛋白,按BCA試劑盒說明書步驟定量,按每孔30 μg蛋白量進行SDS-PAGE電泳,結(jié)束后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,5%脫脂奶粉溶液(0.1% TBST配制)封閉2 h。0.1% TBST 1∶1 000稀釋相應一抗,4 ℃孵育過夜,0.1% TBST潤洗。0.1% TBST 1∶10 000稀釋HRP標記的二抗,室溫孵育1 h,0.1% TBST潤洗。加入顯影液,反應結(jié)束后吸干顯影液。曝光、顯影并掃描圖像。最后導入相應分析軟件分析并計算相應蛋白的相對表達水平。

    3 結(jié)果

    3.1 忍冬藤提取物對結(jié)腸癌細胞增殖的影響 如圖1所示,忍冬藤提取物干預24 h后,HCTII6和SW480細胞存活率明顯下降,并且該效果呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。24 h后的IC50值分別為25.34和37.53 g/L。因此,后續(xù)實驗選擇IC50附近的15、25和35 g/L為忍冬藤提取物的實驗濃度。這一結(jié)果亦表明HCT116細胞較SW480細胞對忍冬藤提取物更為敏感,故后續(xù)實驗主要選擇HCT116細胞進行深入探討。

    圖1 忍冬藤提取物對結(jié)腸癌細胞存活率的影響

    3.2 忍冬藤提取物對結(jié)腸癌細胞形態(tài)的影響 如圖2所示,空白組HCT116和SW480細胞呈上皮細胞樣貼壁生長,細胞形態(tài)為有觸角不規(guī)則形;隨著忍冬藤提取物的干預,部分細胞變成折光率更高的類圓形,體積縮小并與周圍細胞脫離。結(jié)果表明,忍冬藤提取物可對HCT116和SW480細胞產(chǎn)生殺傷作用。

    圖2 忍冬藤提取物對結(jié)腸癌細胞形態(tài)學的影響

    3.3 忍冬藤提取物對結(jié)腸癌細胞凋亡的影響 如圖3所示,空白組HCT116和SW480細胞核表現(xiàn)狀態(tài)正常;隨著忍冬藤提取物的干預,HCT116和SW480細胞核出現(xiàn)明顯的凋亡特征(濃染致密的顆粒塊狀藍色熒光)。結(jié)果表明,忍冬藤提取物可誘導HCT116和SW480細胞凋亡。

    圖3 忍冬藤提取物對結(jié)腸癌細胞凋亡的影響

    如圖4所示,相較于空白組,忍冬藤提取物干預后,HCT116細胞凋亡率明顯增加(P<0.01)。結(jié)果表明,忍冬藤提取物可誘導HCT116細胞發(fā)生凋亡。

    注:相較于空白組(Control),**P<0.01

    3.4 忍冬藤提取物對HCT116細胞線粒體膜電位的影響 如圖5所示,空白組HCT116細胞紅色熒光較強;隨著忍冬藤提取物的干預,HCT116細胞紅色熒光逐漸變?nèi)?,綠色熒光逐漸加強,Merge亦呈現(xiàn)變綠趨勢。結(jié)果表明,忍冬藤提取物可促進HCT116細胞線粒體膜電位坍塌。

    圖5 忍冬藤提取物對HCT116細胞線粒體膜電位的影響

    3.5 忍冬藤提取物對HCT116細胞線粒體凋亡相關(guān)及p53蛋白表達的影響 如圖6所示,相較空白組,忍冬藤提取物干預后,HCT116細胞Bax/Bcl-2比值明顯上調(diào)(P<0.01),Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP、Cyt-C和p53蛋白表達明顯增加(P<0.05,P<0.01)。結(jié)果表明,忍冬藤提取物可誘導HCT116細胞發(fā)生線粒體凋亡。

    注:相較于空白組(Control),*P<0.05,**P<0.01

    3.6 p53抑制劑PFT-α對HCT116細胞凋亡的影響 為了驗證忍冬藤提取物是否通過調(diào)控p53依賴的線粒體途徑誘導HCT116細胞的凋亡,選用p53抑制劑5 μmol/L PFT-α與35 g/L忍冬藤提取物聯(lián)用。如圖7所示,相較于忍冬藤提取物組,PFT-α可明顯逆轉(zhuǎn)忍冬藤提取物誘導的HCT116細胞凋亡(P<0.01)。

    注:相較于空白組(Control),**P<0.01;相較于忍冬藤提取物組,##P<0.01

    4 討論

    我國絕大多數(shù)傳統(tǒng)中藥來源于藥用植物,其原植物的初生和次生代謝產(chǎn)物十分復雜,這種復雜性體現(xiàn)在代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型各不相同,復雜的代謝產(chǎn)物正是中藥發(fā)揮多種藥理作用和多方面功效的重要基礎(chǔ)[8]。忍冬藤中含有綠原酸、異綠原酸等有機酸類,木犀草素、木犀草苷、槲皮素等黃酮類,斷氧馬錢苷、獐牙菜苷等環(huán)烯醚萜類等多種類型代謝產(chǎn)物[6]。據(jù)報道,綠原酸可通過IFN-γ信號通路抑制食管癌體內(nèi)及體外模型的PD-L1的表達,從而發(fā)揮抗食管癌作用[9]。木犀草素可通過抑制Akt/mTOR信號通路H3K27Ac和H3K56Ac的水平調(diào)節(jié)MMP-9表達,從而抑制受體陽性的三陰性乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移[10]。獐牙菜苷可通過誘導線粒體凋亡、干預細胞周期和靶向JNK/p38信號通路,最終獲得抗膠質(zhì)母細胞瘤的作用[11]。以上可知,忍冬藤及其代謝產(chǎn)物可通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究中,忍冬藤提取物可劑量依賴地抑制HCT116和SW480細胞增殖并改變其細胞形態(tài)。因此,忍冬藤提取物具有明確的體外抗結(jié)腸癌作用。

    細胞凋亡是細胞通過激活多種基因并促進其表達,最終有序結(jié)束自身生命的一種程序性死亡方式[12]。同時,誘導腫瘤細胞進入凋亡程序是大部分臨床一線化療藥物包括順鉑、奧沙利鉑等發(fā)揮抗腫瘤作用的重要途徑[13]。在本研究中,忍冬藤提取物可誘導HCT116和SW480細胞凋亡。此外,流式細胞術(shù)結(jié)果進一步確認忍冬藤提取物能夠劑量依賴地誘導HCT116細胞凋亡。這些結(jié)果提示,誘導凋亡可能是忍冬藤提取物抗結(jié)腸癌作用的重要途徑。

    線粒體凋亡是細胞凋亡發(fā)生的主要途徑之一,線粒體膜電位的坍塌是其發(fā)生的重要標志之一。本研究中,忍冬藤提取物可促進HCT116細胞線粒體膜電位坍塌。Bcl-2家族中的Bax與Bcl-2蛋白分別發(fā)揮促凋亡和抗凋亡作用,能夠調(diào)控線粒體凋亡,二者的表達變化可導致線粒體膜電位降低及通透性增加[14],導致線粒體內(nèi)部凋亡因子如Cyt-C的釋放。Cyt-C釋放后可以與凋亡因子作用形成凋亡復合體,活化Caspase-9,進一步活化凋亡最終執(zhí)行蛋白Caspase-3,最終啟動線粒體凋亡途徑[5,15]。本研究中,忍冬藤提取物可劑量依賴地上調(diào)Bax/Bcl-2比值,以及Cleaved PARP、Cyt-C和Cleaved Caspase-3蛋白表達,以上提示忍冬藤提取物通過誘導線粒體凋亡發(fā)揮抗結(jié)腸癌作用。

    p53對細胞凋亡具有關(guān)鍵的調(diào)控作用,其激活后從胞質(zhì)進入胞核中,進而誘導凋亡進展。在本研究中,忍冬藤提取物可劑量依賴地上調(diào)p53蛋白表達。進一步研究顯示,p53抑制劑PFT-α可逆轉(zhuǎn)忍冬藤提取物誘導的HCT116細胞凋亡,說明忍冬藤提取物可能通過誘導p53依賴的線粒體凋亡發(fā)揮抗結(jié)腸癌作用。

    綜上,忍冬藤提取物可通過誘導p53依賴的線粒體凋亡發(fā)揮抗結(jié)腸癌作用,此次研究結(jié)果可為忍冬藤及其組方臨床治療結(jié)腸癌提供一定實驗依據(jù)。

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